自身癌抗原特异性cd8+t细胞的分离及增殖方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及自身癌抗原特异性CD8+T细胞的分离及增殖方法，详细地涉及如下方 法及利用其的CD8+T细胞的大量增殖方法，在上述方法中，从存在于癌症患者每个人的血液 内的自身癌抗原筛选由CD8+T细胞识别的表位，并利用已筛选的表位的肽来分离对自身癌 抗原特异性的CD8+T细胞。
【背景技术】
[0002] CD8+T细胞与树突细胞、CD4+T、自然杀伤细胞(NK细胞)之类的其他细胞相比，具有 比较单纯的功能，因而当进行抗癌免疫治疗时，产生未期待的副作用的可能性小。通常，利 用主要组织相容性复合体-I类/肽多聚体(MHC class I/peptide multimer)来分离抗原特 异性CD8+T细胞，但在这种方法的情况下，存在细胞分离之后由细胞自杀导致的死亡率高， 从而为了生产充分量的抗原特异性CD8+T细胞，有需要长时间进行培养的缺点。因而代替刺 激T细胞受体(TCR，T cell receptor)的主要组织相容性复合体多聚体(MHC multimer)，需 要可分离抗原特异性⑶8+T细胞的替代标记（surrogate marker)，对此本发明人很长时间 进行了与作为免疫调节蛋白的4_1BB(CD137)相关的研究。
[0003] 众所周知，4-1BB在由诱导性共刺激分子活性化的T细胞中表达，尤其，不仅增进 〇08+1'细胞的活性，而且增加此1-2、8(：1-)^、8^-1等之类的抗-细胞死亡分子（ &1^卜 apoptoti c molecules)的表达，来呈现抑制活化诱导的细胞死亡（AICD，act i vat ion-induced cell death) 的功能 。这种4-1BB 刺激的 多个特性是适合于癌症治疗 的多个特性， 基于此，利用动物模型对利用抗-4-1BB mAb的癌症治疗效果进行验证。对此，本发明人利用 在以前研究中，以抗原特异性活性化的CD8+T细胞的4-1BB的表达来确立了利用抗-4-1BB抗 体的抗原特异性CD8+T细胞的分离及增殖方法（韩国登录特许第10-0882445号），但在抗体 的情况下，体外（in vitro)及体内（in vivo)半衰期长，并且通过Fc受体的信号传递结果和 通过抗体识别的靶蛋白质的信号传递的效果被合并，从而呈现整体结果。并且，对相同的抗 原存在多种抗体的情况多，并且这些呈现相互稍不同的效果。为了克服这种局限点，利用作 为五聚合体的C0MP-4-1BBL蛋白质来成功开发过分离及增殖抗原特异性CD8+T细胞的方法 (韩国登录特许第10-1103603号）。
[0004] 这两种专利作为外来抗原的病毒抗原(EBV/LMP2A，CMV/pp65)特异性⑶8+T细胞分 离/大量培养的技术，在体内这些细胞的比率高，从而可比较容易体现。但大部分癌细胞由 构成我们身体的细胞形成，因而虽然是构成我们身体的蛋白质，但在正常细胞中以低的比 率存在，并且在癌细胞中需要将识别过表达的自身癌抗原(self tumor Ag)的⑶8+T细胞选 择性分离及大量培养。
【发明内容】
[0005] 技术问题
[0006] 因此，本发明的目的在于，提供自身癌抗原特异性⑶8+T细胞的分离及增殖方法， 上述自身癌抗原特异性CD8+T细胞的分离及增殖方法可在31天内选择性地分离并大量培养 在体内以极低的比率存在的自身癌抗原特异性CD8+T细胞。
[0007] 解决问题的手段
[0008] 为了达成上述目的，本发明提供自身癌抗原特异性CD8+T细胞的分离方法，上述自 身癌抗原特异性CD8+T细胞的分离方法包括:步骤a)，筛选存在于癌症患者血液内的自身癌 抗原CD8+T细胞表位;步骤b)，与上述自身癌抗原CD8+T细胞表位的肽及白细胞介素-2(IL-2) 一同在培养基中培养从癌症患者的血液中分离的外周血单个核细胞(PBMC ,peripheral blood mononuclear cell);步骤c)，在培养的上述外周血单个核细胞中添加与步骤b)相同 的肽来诱导4-IBB表达；以及步骤d )，在涂敷有抗-4-1BB抗体的培养板中培养诱导了 4-IBB 表达的细胞之后，去除未附着的细胞。
[0009] 在本发明的自身癌抗原特异性CD8+T细胞的分离方法中，上述步骤a)的自身癌抗 原可选自由人端粒酶逆转录酶(hTERT)、WTI、NY-ESOl及黑素瘤抗原-A3 (MAGE-A3)组成的组 中。
[0010] 在本发明的自身癌抗原特异性CD8+T细胞的分离方法中，在上述步骤b)中，自身癌 抗原CD8+T细胞表位可以为包含选自由序列1至序列15组成的组中的氨基酸序列的肽。
[00?1 ]在本发明的自身癌抗原特异性CD8+T细胞的分离方法中的特征在于，上述步骤c) 中，表达诱导培养12至36小时。
[0012]在本发明的自身癌抗原特异性CD8+T细胞的分离方法中，上述步骤d)中，可培养1 至20分钟。
[0013]并且，本发明提供自身癌抗原特异性CD8+T细胞的大量培养方法，上述自身癌抗原 特异性CD8+T细胞的大量培养方法包括如下步骤:利用包含白细胞介素-2、抗-CD3抗体及自 体血浆的培养基，来使通过上述方法分离的自身癌抗原特异性CD8+T细胞和放射线照射的 同种异体(allogeneic)外周血单个核细胞悬浮之后，注入于培养用袋，追加注入上述培养 基来进行培养。
[0014] 在本发明的自身癌抗原特异性CD8+T细胞的大量培养方法中，上述外周血单个核 细胞可从正常供体分离。
[0015] 在本发明的自身癌抗原特异性CD8+T细胞的大量培养方法中，上述培养可执行4至 15天。
[0016] 发明的效果
[0017] 根据本发明，利用作为非外来抗原的存在于癌症患者的每个人的血液中的自身癌 抗原CD8+T细胞表位的肽来可分离对自身癌抗原特异性的CD8+T细胞。因此，若利用以本发明 的方法分离的用于识别在正常人中以极低的比率存在的自身癌抗原的T细胞，则可有效地 选择来源于癌症患者自身的癌细胞来去除。
【附图说明】
[0018] 图1为说明本发明的自身癌抗原特异性CD8+T细胞的选择性分离及大量培养过程 的图。
[0019] 图2为表示本发明的表位筛选过程的工序流程图的图。
[0020]图3为示出利用从正常人(healthy doner)取得的外周血单个核细胞的人端粒酶 逆转录酶表位筛选结果的图。
[0021]图4为示出利用从正常人取得的外周血单个核细胞的WTl表位筛选结果的图。
[0022]图5至图7为示出利用分别从胃癌(gastric cancer)、肺癌（lung cancer)及胰腺 癌(pancreatic cancer)患者取得的外周血单个核细胞的人端粒酶逆转录酶表位筛选结果 的图。
[0023] 图8及图9为示出利用分别从脑肿瘤(glioblastoma)、肺癌患者取得的外周血单个 核细胞的WTl表位筛选结果的图。
[0024] 图10及图11为示出利用分别从卵巢癌(ovarian cancer)及肉瘤(sarcoma)患者取 得的外周血单个核细胞的NY-ESOl表位筛选结果的图。
[0025] 图12及图13为示出利用分别从肉瘤及肺癌患者取得的外周血单个核细胞的黑素 瘤抗原-A3(MAGE-A表位筛选结果的图。
[0026] 图14为用于说明人端粒酶逆转录酶T细胞治疗剂的试生产过程的图。
[0027]图15为用于说明WTlT细胞治疗剂的试生产过程的图。
[0028]图16为用于说明NY-ESOl T细胞治疗剂的试生产过程的图。
[0029]图17为用于说明黑素瘤抗原-A3T细胞治疗剂的试生产过程的图。
【具体实施方式】
[0030] 癌细胞来源于构成我们身体的细胞，因而为了选择性地去除癌细胞，需要从癌细 胞中过表达的自身癌抗原（self tumor Ag)特异性⑶8+T细胞的选择性分离及大量培养。但 是，用于识别自身癌抗原的T细胞在正常人的情况下，不仅以比率极低的方式存在，而且以 因免疫耐受（immune tolerance)而抑制活性的状态存在。因此，尚未开发从癌症患者的血 液中选择性地分离自身癌抗原特异性CD8+T细胞来大量培养的规格化的工序。对此，本发明 人开发了如下规格化的工序技术，即，利用抗4-1BB抗体来在31天内可选择性地分离并大量 培养在体内以极低的比率存在的人端粒酶逆转录酶、WTl、NY-ES01及黑素瘤抗原-A3之类的 自身癌抗原特异性的CD8+T细胞。
[0031] 因此，本发明提供自身癌抗原特异性CD8+T细胞的分离方法。具体地，本发明的自 身癌抗原特异性CD8+T细胞的分离方法包括:步骤a)，筛选存在于癌症患者血液内的自身癌 抗原CD8+T细胞表位;步骤b)，与上述自身癌抗原CD8+T细胞表位的肽及白细胞介素-2-同在 培养基中培养从癌症患者的血液中分离的外周血单个核细胞(PBMC,peripheral blood mononuclear cell);步骤c)，在培养的上述外周血单个核细胞中添加与步骤b)相同的肽来 诱导4-1BB表达；以及步骤d)，在涂敷有抗-4-1BB抗体的培养板中培养诱导了4-1BB表达的 细胞之后，去除未附着的细胞。
[0032]在本发明的自身癌抗原特异性CD8+T细胞