原筛选的⑶8+T细胞表位如下列表2至表5。
[0065]实施例2.将临床癌症患者作为对象的表位筛选
[0066]为了验证在实施例1中筛选的人端粒酶逆转录酶、WTl、NY-ES01及黑素瘤抗原-A3 自身癌抗原的多个CD8+T细胞表位能否诱导存在于临床癌症患者的血液内的CD8+T细胞增 殖，执行了示意于图2的表位筛选。人端粒酶逆转录酶的表位筛选将胃癌、肺癌及胰腺癌作 为主要对象来执行，并且WTl表位筛选将脑脊髓癌及肺癌作为主要对象来执行，NY-ESOl表 位筛选将卵巢癌及肉瘤作为主要对象来执行，黑素瘤抗原-A3表位筛选将肉瘤及肺癌作为 主要对象来执行。
[0067]图3为示出利用从正常人(healthy doner)取得的外周血单个核细胞的人端粒酶 逆转录酶表位筛选结果的图。
[0068]图4为示出利用从正常人取得的外周血单个核细胞的WTl表位筛选结果的图。
[0069]由图3及图4可知，人端粒酶逆转录酶及WTl的多个CD8+T细胞表位由从正常人的血 液分离的外周血单个核细胞未诱导T细胞反应。因此，确认为本发明的筛选的多个表位无法 由正常人的T细胞识别。
[0070]图5至图7为示出利用分别从胃癌(gastric cancer)、肺癌（lung cancer)及胰腺 癌(pancreat i c)患者取得的外周血单个核细胞的人端粒酶逆转录酶表位筛选结果的图。
[0071 ]图8及图9为示出利用分别从脑肿瘤(glioblastoma)及肺癌患者取得的外周血单 个核细胞的WTl表位筛选结果的图。
[0072] 图10及图11为示出利用分别从卵巢癌(ovarian cancer)及肉瘤(sarcoma)患者取 得的外周血单个核细胞的NY-ESOl表位筛选结果的图。
[0073] 图12及图13为示出利用分别从肉瘤及肺癌患者取得的外周血单个核细胞的黑素 瘤抗原-A3表位筛选结果的图。
[0074] 由图5至图13可知，将由临床癌症患者的血液分离的外周血单个核细胞作为对象 执行表位筛选来调查对人端粒酶逆转录酶、WTl、NY-ES01及黑素瘤抗原-A3的⑶8+T细胞反 应性，最终确认与正常人不同，呈现高的对选择的多个自身癌抗原的T细胞反应。因此，将胃 癌、肺癌、胰腺癌、肉瘤、卵巢癌等作为对象反复执行表位筛选来确认了对各个自身癌抗原 的反应性。
[0075] 并且，为了客观分析上述自身癌抗原CD8+T细胞表位筛选结果，如下列表6所示地 制作了评分系统（scoring system)。
[0078] 根据上述表6的基准，分析表位筛选结果，其结果在下列表7至表15中不出。
[0079] 下列表7为利用从胃癌患者取得的外周血单个核细胞的人端粒酶逆转录酶表位筛 选的分析结果。表7
[0080]
[0081] 下列表8为利用从肺癌患者取得的外周血单个核细胞的人端粒酶逆转录酶表位筛 选的分析结果。
[0082] 表 8
[0083]
[0084]下列表9为利用从胰腺癌患者取得的外周血单个核细胞的人端粒酶逆转录酶表位 筛选的分析结果。
[0087] 下列表10为利用从脑肿瘤患者取得的外周血单个核细胞的WTl表位筛选的分析结 果。
[0088] 表1〇
[0089]
[0090]下列表11为利用从肺癌患者取得的外周血单个核细胞的WTl表位筛选的分析结 果。
[0093]下列表12为利用从卵巢癌患者取得的外周血单个核细胞的NY-ESOl表位筛选的分 析结果。
[0094]表12
[0096]下列表13为利用从肉瘤患者取得的外周血单个核细胞的WT1表位筛选的分析结 果D
[0100] 下列表14为利用从肉瘤患者取得的外周血单个核细胞的黑素瘤抗原-A3表位筛选 的分析结果。
[0101] 表14
[0102]
[0103] 下列表15为利用从肺癌患者取得的外周血单个核细胞的黑素瘤抗原-A3表位筛选 的分析结果。
[0104] 表15
[0105]
[0106] 如上述表7至表13,以3分以上，⑶8+T细胞因肽的刺激而表达4-1BB的情况下，利用 抗4-1BB抗体来可有效地分离这些细胞。在各癌瘤中以3分以上，T细胞与自身癌抗原发生反 应的比率为40-50%水平，因而判断为利用筛选的自身癌抗原的多个表位可制备T细胞治疗 剂。被筛选的多个肽如下：人端粒酶逆转录酶肽为CLKELVARV(序列I)、PLFLELL(序列2)及 AAVTPAA (序列 3); WT1 肽为SLGEQQVSV (序列4)、RMFPNAPVL (序列 5)、CMTWNQMNL (序列6)及 VLDFAPPGA(序列7); NY-ESO 1 肽为SISSCLQQL (序列 8)、RLLEFYLAM (序列9)、GVLLKEFTV (序列 10)及ILTIRLTAA(序列11);以及黑素瘤抗原-A3肽为LLIIVLAII(序列12)、KIWEELSVL(序列 13)、LVFGIELMEV(序列 14)及SLPTTMNYPL(序列 15)。
[0107] 实施例3.自身癌抗原特异性T细胞治疗剂的试验制备
[0108] 通过表位筛选来筛选适合制备T细胞治疗剂的对各个自身癌抗原的3-4种的表位 的肽之后，利用这些肽来执行了人端粒酶逆转录酶、WT1、NY-ES01及黑素瘤抗原-A3特异性T 细胞治疗剂的试生产。T细胞治疗剂的生产由自我衍生抗癌T细胞的第一次增殖、分离及大 量培养这三个步骤构成。
[0109] (1)自身癌抗原特异性CD8+T细胞的增殖
[011 0]通过表位筛选，从确认存在一个以上的3分以上的表位的癌症患者中分离了 50ml 的血液。
[0111] 1)从患者的血液分离外周血单个核细胞：向填满了 7 m 1的聚蔗糖-泛影葡胺 (卩；[(3011-117口39116)的151111的管（(301'11；^311：1^6)慢慢流出71111的血液，来覆盖(0￥61'1350于 聚蔗糖溶液的上层。在常温且2000rpm的条件下，将管离心分离20分钟，并且只收集位于聚 蔗糖和血浆之间的白色的细胞层来清洗之后使用为外周血单个核细胞。
[0112] 2)以IX IO6细胞/ml将分离的外周血单个核细胞悬浮于细胞毒性T淋巴细胞(CTL) 培养基(RPMI1640培养基+4mM L-谷氨酰胺+12.5mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)+50yM的 2-巯基乙醇+3%的自体血浆）中，并且以使通过表位筛选来在本发明中筛选的3-4种的多个 肽的浓度分别成为lμg/ml的方式添加。以每次Iml的方式将这些细胞悬浮液接种于14ml的 管(round tube)来在C〇2培养箱中培养。
[0113] 3)培养第二天，以每次Iml的方式将包含50U/ml的白细胞介素_2(诺华公司阿地白 介素(Pr 〇leUkin，N〇Vatis))的细胞毒性T淋巴细胞培养基添加于各个管中。
[0114] 4)培养第7天、第9天、第11天及第13天，去除Iml的上层培养基之后，添加了包含 50U/ml的白细胞介素-2的细胞毒性T淋巴细胞培养基。
[0115] 5)培养第14天，向50ml的圆锥管（cornical tube)收集各个管的细胞之后，添加 RPMI1640培养基，从而在HOOrpm条件下离心分离5分钟来清洗细胞。还将上述过程反复两 次。
[0116] 6)以2 X IO6细胞/ml的浓度，利用细胞毒性T淋巴细胞培养基悬浮清洗的细胞之 后，分别以5μg/ml的浓度添加3-4种的相同的肽来培养。
[0117] (2)自身癌抗原特异性CD8+T细胞的筛选
[0118] 1)培养第24小时，收集再活性化一天的外周血单个核细胞来利用RPMI1640培养基 清洗两次之后，以5 X IO6细胞/ml的浓度悬浮细胞毒性T淋巴细胞培养基，并添加了50U/ml 的白细胞介素-2。
[0119] 2)以每次Iml的方式向以50μg/ml的浓度涂敷一天的6孔板或12孔板（culture plate)添加这些细胞，在CO 2培养箱中，将抗4-1BB抗体培养10分钟。
[0120] 3)培养10分钟后，全部清洗未附着于板的细胞来去除，之后，向各个孔添加了2-4ml的包含lOOOU/ml的白细胞介素-2的细胞毒性T淋巴细胞培养基，来在CO 2培养箱中培养 两天。
[0121] (3)自身癌抗原特异性CD8+T细胞的大量培养
[0122] 1)全部收集利用抗4-1BB抗体分离来培养两天的细胞，从而利用RPMI1640培养基 清洗两次来进行计数。
[0123] 2)从正常供体分离外周血单个核细胞来以IX IO8细胞/ml悬浮之后，以3000rad放 射线照射来诱导细胞的死亡之后，使用为可对T细胞的增殖诱导提供需要的共同刺激 (costimulation)的培养添加物。
[0124] 3)向50ml的圆锥管添加分离的CD8 + T细胞5 X IO5细胞和照射的同种异体 (irradiated allogeneic)多个外周血单个核细胞I X IO8细胞之后，将包含1000U/ml的白 细胞介素_2、40ng/ml的抗-CD3 mAb(BD Bioscience)及3% 的自体血衆（au