的分离方法中，上述步骤a)中，自身癌抗 原可以为存在于癌症患者自身的体内的一种癌抗原，根据癌瘤可选择适合的自身癌抗原来 使用。优选地，作为利用于抗癌免疫治疗的代表性自身癌抗原可使用人端粒酶逆转录酶(基 因库：BAC11010.1)、WT1(基因库：AA061088.1)、NY-ES01(基因库：CAA05908.1)及黑素瘤抗 原-A3(NCBI参考序列:NP_005353.1)等。众所周知，上述人端粒酶逆转录酶作为在染色体末 端合成端粒脱氧核糖核酸(telomeric DNA)的酶，癌细胞使该酶过度活性化来可回避端粒 依存性细胞死亡来起到作用，并且是包括肺癌、胃癌及胰腺癌的多种实体癌的祀抗原(Kim NW，et al. Science .1994; 266:2011-2015)，众所周知，上述WTl作为与肾母细胞瘤（Wilms tumor)相关的基因，是对锌指(zinc finger)转录因子加密来参与细胞的增殖和分化、死亡 及器官的产生的蛋白质，是脑脊髓癌、肺癌等的靶抗原(Call KM，et al. ,Cell.1990.60: 509_520;Nakahara Y，et al.，Brain Tumor Pathol.2004.21:113_6)。并且，众所周知，上 述NY-ESOl作为属于癌睾丸抗原(CTA，cancer testis antigen)的蛋白质之一，主要表达于 包含生殖细胞(germ cell)、肉瘤(sarcoma)及乳腺癌的多种癌细胞，但未知在这些细胞中 起到什么功能（Gnjatic S，et al.，Adv Cancer Res.2006;95:l_30)。上述黑素瘤抗原-A3 作为属于黑色素瘤相关抗原家族(melanoma-associated antigen family)的蛋白质，未公 开在正常细胞中执行什么功能，但是，众所周知，在包括肺癌、肉瘤及黑色素瘤的多种癌细 胞中过表达，从而评价为适合癌症的免疫治疗的革E抗原（Decoster L，et al. ,Ann Onco1.2012Jun；23(6):I387-93)〇
[0033] 本发明的自身癌抗原特异性CD8+T细胞的分离方法的特征在于，在上述步骤b)中， 表位为包含选自由序列1至序列15组成的组中的氨基酸序列的肽。
[0034] 本发明的自身癌抗原特异性CD8+T细胞的分离方法的特征在于，上述步骤b)中，培 养基为包含自体血浆的培养基，并且，上述步骤b)中，培养12至16天。
[0035]本发明的自身癌抗原特异性CD8+T细胞的分离方法的特征在于，上述步骤c)中，表 达诱导培养12至36小时，上述步骤d)中，培养1至20分钟。
[0036] 并且，本发明提供自身癌抗原特异性CD8+T细胞的大量培养方法，上述自身癌抗原 特异性CD8+T细胞的大量培养方法包括如下步骤:利用包含白细胞介素-2、抗-CD3抗体及自 体血浆的培养基，来使通过上述分离方法分离的自身癌抗原特异性CD8+T细胞和放射线照 射的同种异体(allogeneic)外周血单个核细胞悬浮之后，注入于培养用袋，追加注入上述 培养基来进行培养。
[0037] 在本发明的自身癌抗原特异性CD8+T细胞的大量培养方法的特征在于，上述外周 血单个核细胞从正常供体分离，上述培养执行4至15天。尤其，在执行上述培养期间，在培养 第4天、第7天、第9天、第11天及第14天追加可注入培养基。
[0038] 以下，按步骤说明本发明的自身癌抗原特异性CD8+T细胞的分离及增殖方法。
[0039] (1)表位筛选(Epitope screening)(预先筛选检查）
[0040]本发明利用肽来选择性增殖及分离自我衍生的癌抗原特异性⑶8+T细胞。通过⑶8+ T细胞识别的自身癌抗原的多个表位(epitope)根据每个患者的人类白细胞抗原(HLA)-A型 及状态各不相同，因而通过表位筛选来筛选存在于癌症患者每个人的血液内的自身癌抗原 CD8+T细胞表位，从而筛选3-4种类的T细胞治疗剂制备用肽。
[0041 ] ⑵自身癌抗原特异性CD8+T细胞的增殖
[0042]自身癌抗原特异性CD8+T细胞在血液内以0.1 %以下的方式存在，因而向从血液中 分离的外周血单个核细胞添加3-4种制备用肽及白细胞介素-2来培养14天，从而诱导对来 源于自身癌抗原的肽特异性的CD8+T细胞的增殖。在培养第14天收集全部细胞来由相同的 多个肽再活性化24小时，来使多个肽-特异性CD8+T细胞同时表达4-1BB。
[0043] (3)自身癌抗原特异性CD8+T细胞的选择性分离
[0044] 向涂敷有抗4-1BB抗体的培养板接种由肽再活性化的细胞来培养10分钟，从而附 着表达4-1BB的多个CD8+T，并且未附着的多个细胞全部通过清洗而去除。之后添加包含白 细胞介素-2的培养基来培养两天，从而使分离的多个T细胞与增殖一同向培养板滴落。
[0045] (4)自身癌抗原特异性CD8+T细胞的大量培养
[0046] 混合分离于IL培养用袋（culture bag)的CD8+T细胞5 X IO5细胞、照射放射线 (irradiated allogeneic)的多个外周血单个核细胞I X IO8细胞、1000U/ml的白细胞介素- 2、40ng的抗-CD3mAb，来定期添加培养基14天，从而以~IO9细胞/L水平大量培养细胞来以 可向癌症患者给药的水平增殖。
[0047]以下，通过实施例对本发明进行详细说明。但是，这些实施例用于更详细地说明本 发明，本发明的范围并不限制于这些实施例。
[0048] 实验例.表位筛选工序
[0049]通过算法筛选了自身癌抗原的多个⑶8+T细胞表位(epitope)。为了确认存在于癌 症患者的血液内的多个T细胞与哪种CD8+T细胞的表位发生反应，从癌症患者的血液分离外 周血单个核细胞(PBMC，peripheral blood mononuclear cell)来清洗之后，以IX IO6细 胞/ml悬浮于细胞毒性T淋巴细胞(CTL)培养基(RPMI1640培养基+4mM L-谷氨酰胺+12.5mM 的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) +50μΜ的2-巯基乙醇+3 %的自体血浆），并以每次Iml的方式 向14ml的管(round tube)接种。向各个管以lμg/ml的浓度添加通过算法进行分析来筛选的 各个表位的多个肽(peptides)，来在CO 2培养箱中开始培养。培养第二天，将包含50U/ml的 白细胞介素-2的细胞毒性T淋巴细胞培养基以每次Iml的方式向各个管接种。培养第7天、第 9天、第11天及第13天去除Iml的培养基之后，添加了包含50U/ml的白细胞介素-2的细胞毒 性T淋巴细胞培养基。培养第14天，向各个管添加 RPMI1640培养基，来在HOOrpm条件下离心 分离5分钟，从而将细胞清洗3次。向清洗的细胞悬浮Iml的细胞毒性T淋巴细胞培养基之后， 以5μg/ml的浓度添加相同的肽来进行培养。24小时之后，收集各管的细胞来利用抗-CD8-PE-Cy5及抗-4-1BB-PE抗体进行染色，从而进行流式细胞分析，并且分析表达4-1BB的⑶8+T 细胞的比率，从而分析了与哪种肽发生反应来将CD8+T细胞活性化。图2为示出本发明的表 位筛选过程的工序流程图的图。
[0050] 从圣地亚哥联科生物公司（613；[08(^61106,53110丨680,04)购买了使用于实验的抗-Q)8-PE-Cy5及抗-4-1BB-PE。从圣地亚哥英杰生命科技有限公司（Invitrogen，San Diego， CA)购买了 RPMI1640、L-谷氨酰胺、4-羟乙基哌嗪乙磺酸及2-巯基乙醇。
[0051 ]实施例1.自身癌抗原筛选及CD8+T细胞表位筛选
[0052] 基于按各个不同癌瘤评价哪种癌抗原对癌症的免疫治疗适合的多个论文 (Scanlan MJ,et al.,Tmmunol Rev.2002 Oct.188:22-32；Ramakrishnan S,et al., Cancer research.1998.58:622-625；Nakahara Y,et al.,Brain Tumor Pathol.2004.21 (3): 113-6)，筛选了适合韩国人的好发癌及难治性癌（胃癌、肺癌、胰腺癌等)的免疫治疗的 自身癌抗原。人端粒酶逆转录酶(基因库:BAC11010.1)、WT1 (基因库:AA061088.1)、NY-ES01 (基因库:CAA05908.1)及黑素瘤抗原-A3(NCBI参考序列:NP_005353.1)作为以多种方式利 用于抗癌免疫治疗的代表性的自身癌抗原，筛选可适用这些四种癌抗原的癌瘤来在下列表 1中进行了整理。
[0053] 表 1
[0054]
[0055]通过算法分析筛选的自身癌抗原的氨基酸序列，来确定推定为CD8+T细胞表位的 氨基酸序列（CTLPred: http: //www · imtech · res · in/raghava/ctlpred/ ,NetCTL: http: // www. cbs · dtu · dk/services/NetCTL/，SYFPEITHI: http: //www. syfpeithi · de/)，并将筛选 的表位作为对象来将肽进行化学合成(Peptron Inc;www.peptron.com)，从而使用于表位 筛选(epitope screening)。从各个自身癌抗