g/mL，表明本发明探 针具有极高的灵敏度，检测浓度可低至PPb水平，当处理细胞的STS的浓度逐渐增加时，检 测到的活性的caspase-3的含量也是成正相关地增加，这与细胞成像中所观察到的现象一 致。如果同时对孵育了探针的细胞进行STS和Ac-DEVD-CHO处理时，会导致Eu信号的降 低，这表明caspase-3的活性受到了抑制。同样地，当孵育了对照组探针（DEVG)的细胞用 STS处理后，也会得到一个较低的Eu信号，这表明caspase-3对底物具有高的选择性，它不 能切断DEVG。上述内容也进一步说明了结合在纳米金颗粒上的没有被切断的Eu-BCTOT修 饰的肽段，经过离心后，可以与切断的Eu-BCTOT肽段片段很好地分离，且不影响探针对活 性的caspase-3的定量研究。上面的实验首次提供了一种HeLa细胞中caspase-3的绝对定 量方法，它可以有助于对caspase-3功能的研究。此外，STS和Ac-DEVD-CHO对caspase-3 活性的影响可以通过相应的Eu信号的变化来实现准确和灵敏地监控，这就为caspase家族 活性的增强剂和抑制剂的筛选提供了一个有效的途径，而这些增强剂或抑制剂又是一些癌 症、自身免疫缺陷疾病以及心脏疾病的药物治疗靶标。
【主权项】
1. 一种基于镧系金属的双功能纳米探针，其特征在于：该纳米探针由多肽N端的册12与 BCTOT上的S02C1生成S02-NH连接，所述多肽C端上含有SH与纳米材料连接，且所述多肽 上连接的BCTOT与镧系金属离子螯合组成； 所述多肽上含有蛋白酶的剪切位点。2. 根据权利要求1所述的纳米探针，其特征在于：所述多肽的长度为7~10个氨基酸 残基； 所述纳米材料为纳米金、纳米银、纳米娃、石墨稀、碳纳米管或上转换纳米颗粒； 所述镧系金属离子为铕离子、铽离子、铒离子或镱离子。3. 根据权利要求1或2所述的纳米探针，其特征在于：所述多肽中蛋白酶的剪切位点 的氨基酸序列为DEVD; 所述纳米材料为颗粒状，所述纳米材料的粒径为l〇nm~100nm。4. 根据权利要求3所述的纳米探针，其特征在于：所述多肽的氨基酸序列是N 端-GKDEVDAPGC-C端。5. -种权利要求1-4中任一所述的基于镧系金属的双功能纳米探针的制备方法，包括 如下步骤：1)将所述多肽作为桥联剂首先与天线分子所述BCTOT反应，得到BCTOT修饰的 多肽； 2) 将所述BCTOT修饰的多肽与所述镧系金属离子螯合反应，得到螯合后的多肽溶液； 3) 将所述螯合后的多肽溶液与所述纳米材料溶液反应，即得到基于镧系金属的双功能 纳米探针。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述多肽与所述BCTOT的摩尔比为1 : 0· 5 ~1 ; 步骤1)中，所述反应的温度为10~30°c; 所述反应的时间为1~24h; 步骤2)中，所述镧系金属离子与所述BCTOT的摩尔比为0. 1~10:1 ; 所述镧系金属离子与所述BCTOT螯合后的浓度为0. 1~100μΜ; 所述螯合反应的温度为30°C~60°C，所述螯合反应的时间为1~8h; 所述纳米材料的粒径为l〇nm~100nm; 所述多肽与所述纳米材料的摩尔比为100~3000 :1 ; 步骤3)中，所述反应的温度为10~30°C; 所述反应的时间为1~36h。7. 根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述反应的体系中还加 入缚酸剂； 所述缚酸剂为三乙胺和/或吡啶； 所述多肽与所述缚酸剂的摩尔比为1 :〇. 05~1:0. 2。8. 如下⑴或⑵或（3)所示的应用： (1) 权利要求1-3中任一项所述的双功能纳米探针在对蛋白酶的定性和/或定量检测 中的应用；或权利要求1-3中任一项所述的双功能纳米探针在制备定性和/或定量检测蛋 白酶的产品中的应用； (2) 权利要求1-3中任一项所述的双功能纳米探针在对蛋白酶的细胞内成像中的应 用；或权利要求1-3中任一项所述的双功能纳米探针在制备对蛋白酶的细胞内成像的产品 中的应用； (3)权利要求1-3中任一项所述的双功能纳米探针在筛选蛋白酶的增强剂或抑制剂中 的应用；或权利要求1-3中任一项所述的双功能纳米探针在制备筛选蛋白酶的增强剂或抑 制剂的模型中的应用。9.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述定性检测采用光谱检测，所述定量检 测采用质谱检测； 所述光谱检测具体为细胞成像，所述质谱检测具体为ICP-MS定量检测； 和/或，所述定性和/或定量检测为体外和/或活细胞内进行。10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述蛋白酶为caspase-3 ; 或，所述体外定性检测的方法包括如下步骤： 当采用光谱检测和/或质谱检时，按照如下步骤进行：1)将所述基于镧系金属的双功 能纳米探针溶液加入到体外的检测样品中，反应，然后将所述反应的体系离心，取上清液， 光谱检测和/或质谱检测上清液，若有检测到荧光和/或所述镧系金属离子信号响应，则表 明待测样品中含有蛋白酶； 或，所述细胞内定性检测的方法包括如下步骤：将所述基于镧系金属的双功能纳米探 针溶液加入活细胞中，反应，然后将孵育了所述探针的所述活细胞进行裂解后，离心分离收 集上清液，质谱检测检测上清液，若有检测到所述镧系金属离子信号响应，则表明待测细胞 内含有蛋白酶或表明待测细胞内的蛋白酶具有蛋白酶活性； 或，所述体外定量检测的方法包括如下步骤：首先将所述基于镧系金属的双功能纳米 探针溶液加入到所述蛋白酶的标准品中，测定所述镧系金属离子的浓度，以所述蛋白酶的 标准品的浓度为横坐标，所述镧系金属离子的浓度为纵坐标，建立标准曲线I;将所述基于 镧系金属的双功能纳米探针溶液加入到体外的检测样品中，反应，然后将所述反应的体系 离心，取上清液，质谱检测上清液，测得待测样品中镧系金属离子的浓度代入所述标准方程 I中，即得到所述待测样品中蛋白酶的含量； 或，所述细胞内定量检测的方法包括如下步骤：首先将所述基于镧系金属的双功能纳 米探针溶液加入到所述蛋白酶的标准品中，测定所述镧系金属离子的浓度，以所述蛋白酶 的标准品的浓度为横坐标，所述镧系金属离子的浓度为纵坐标，建立标准曲线II;将所述基 于镧系金属的双功能纳米探针溶液加入活细胞中，反应，然后将孵育了所述探针的所述活 细胞进行裂解后，离心分离收集上清液，质谱检测上清液，测得待测细胞中镧系金属离子的 浓度代入所述标准方程II中，即得到所述待测细胞中蛋白酶的含量； 或，所述细胞成像的方法包括如下步骤：培养皿中活细胞与所述基于镧系金属的双功 能纳米探针溶液孵育，然后将孵育了所述探针的所述活细胞进行洗涤后，进行细胞成像即 可。
【专利摘要】本发明公开了一种基于镧系金属的双功能纳米探针及其制备方法与应用。本发明基于镧系金属的双功能纳米探针制备方法包括如下步骤：1)将含有DEVD氨基酸残基的多肽作为桥联剂首先与天线分子BCTOT反应，得到BCTOT修饰的多肽；2)将所述BCTOT修饰的多肽与镧系金属离子螯合反应，得到螯合后的多肽溶液；3)将所述螯合后的多肽溶液与纳米材料溶液反应，即得到基于镧系金属的双功能纳米探针。本发明基于镧系金属的双功能纳米探针应用于对caspase-3的光谱检测、质谱检测、细胞成像和/或ICP-MS定量检测中。本发明能实现生物分子现场的动态可视化和高灵敏度定量分析。
【IPC分类】B82Y40/00, G01N21/75, G01N21/25, B82Y30/00
【公开号】CN105259118
【申请号】CN201510666540
【发明人】钱小红, 秦伟捷, 冯端
【申请人】中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年10月15日