一步骤中，在钙离子和磷脂最优量的存在下，通过因子IXa和它的辅因子(因子Villa)，将因子X活化为因子Xa。存在过量的因子X，使得因子X的活化速率仅取决于因子VIII的量。在第二步骤中，因子Xa水解生色底物以产生生色团，并且在405 nm光度测定读取颜色强度。使用线性回归统计方法计算未知物的效价，并且检查测定的可靠性。活性以国际单位/mL (IU/mL)报道。关于因子VIII的生色和凝血测定的进一步细节可见于文献(用于参考，参见:Barrowcliffe T.V.等人， seminars in Thrombosis and Hemostasis，28 (3)，2002; Lippi G.等人，Blood Coagulat1n and Fibrinolysis 2009，20 (1)，2009)o[0081 ] 此处报道的实验的结果以相对单位给出。
[0082]超滤的培养收获物
过滤15 L发酵的收获液以去除细胞和碎片，然后通过使用100千道尔顿(kDa)截止膜的交叉流过滤浓缩40倍。
[0083]纯化至UFDF
通过一系列层析步骤从超滤材料纯化rFVIII，所述层析步骤包括通过使rFVIII结合至固定的单克隆抗体的免疫亲和层析和离子交换层析，如Boedeker, Seminars inThrombosis and Hemostasis, 27 (4): 385-394 (2001)中所述。
[0084]QC 测定
为了分析产生的rFVIII蛋白的质量，应用一系列特定方法。针对完整性、糖基化模式和宿主细胞杂质的任何潜在变化评价FVIII产物的质量。
[0085]通过HPLC分析因子VIII完整性。还通过SDS-PAGE后的银染色和通过使用抗FVIII抗体的蛋白质印迹分析产物的完整性和杂质。
[0086]为了测定污染物和杂质，使用特异性免疫测定分析产物的宿主细胞蛋白，且还分析产物的源自BHK细胞培养物的核酸杂质。
[0087]通过测定不同的糖组分和唾液酸化的程度分析分离的蛋白的糖基化模式。将数据与内部(in-house)的对照rFVIII蛋白进行比较。
[0088]关于实施例1-6的结束语
这些结果表明，可能通过在培养基中引入和/或增加甘露糖和/或钙浓度实现>30%的滴度增益；滴度增益在连续灌注培养中持续>130天。重要地，产物质量属性(包括杂质)或培养性能都不受培养基改变的影响。用葡萄糖没有重现观察到的对滴度增加的影响，例如，当仅仅增加不包括甘露糖的DMEM/F12中葡萄糖的浓度时。
[0089]使用15L灌注生物反应器，将甘露糖浓度从3 g/L增加至5 g/L可以使rhFVIII生产率增加超过25 %。独立地，钙从~1 mM增加至5 mM也导致生产率的几乎相同的增益。并且当甘露糖和钙两者增加时，生产率增益进一步增加至接近40% ;与含有3 g/L甘露糖和ImM钙的标准生产培养基相比，5 g/L甘露糖和5mM钙的组合使得因子VIII比生产率增加>30%。细胞培养性能和产品质量属性不受这种培养基制剂变化的影响。对生产率的影响在培养基切换后约一天内是明显的，并且是可逆的。在连续灌注生物反应器细胞培养过程中，超过30 %的生产率增益从细胞库解冻起持续超过3个月。
[0090]甘露糖和钙对滴度增加的影响当采用两者而非单独采用每一种时更高。已知钙稳定因子VIII分子。标准DMEM/F12 (1:1)培养基制剂中钙的浓度为仅~1 mM。培养基制剂中钙的较高水平因此可以帮助在过程中较早稳定因子VIII分子-早在当因子VIII被分泌到细胞之外时，而不是已经收集收获物之后。
[0091]表1
如ATCC目录中所述的DMEM:F-12 (1:1)培养基制剂 ATCC 目录号 30-2006 无机盐(g/升)
CaCl2 (无水)0.11665
CuS04(无水)0.0000008Fe (N03) 3.9H200.00005
FeS04.7H200.000417
MgS04 (无水)0.08495
KC10.3118
NaHC031.20000
NaCl7.00000
Na2HP04(无水)0.07100
NaH2P04.H200.06250
ZnS04.7H200.000432氨基酸(g/升)
L-丙氨酸0.00445
L-精氨酸.HC10.14750
L-天冬酰胺.H200.00750
L-天冬氨酸0.00665L-胱氨酸.HC1.H20 0.01756
L-胱氨酸.2HC10.03129
L-谷氨酸0.00735
L_谷氨酰胺0.36510
甘氨酸0.01875L-组氨酸.HC1.H20 0.03148
L-异亮氨酸0.05437
L-亮氨酸0.05895
L_ 赖氨酸-HC10.09135
L_甲硫氨酸0.01724
L-苯丙氨酸0.03548
L_脯氨酸0.01725
L-丝氨酸0.02625
L-苏氛酸0.05355
L-色氨酸0.00902L-酪氨酸.2Na.2HzO 0.05582
L-缬氨酸0.05285维生素(g/升)
D-生物素0.0000036565
氯化胆碱0.00898
叶酸(λ 00265
肌醇0.01261
烟酰胺0.00202
D-泛酸0.00224(半f丐(hemicalcium)) 吡哆醇.Ηα0.00203
核黄素ο.00022
硫胺素.Ηα0.00217
维生素 Β-120.00068
其他(g/升)
D-葡萄糖3.15100
HEPES3.57480
次黄嘌呤0.00239
亚油酸0.000044
酚红，
钠盐0.00810
腐胺.2Ηα0.00008
丙酮酸 *Na0.05500
DL-硫辛酸0.000105
胸苷0.000365。
[0092]本文所用的部分标题(sect1n headings)仅为组织性目的，而不应理解为以任何方式限制所描述的主题。
[0093]虽然本教导结合多种实施方案进行了描述，但不旨在本教导受限于此类实施方案。相反，本教导涵盖多种替代方案、修饰、和等同方案，如本领域技术人员将理解的。
[0094]因此，应当在说明性而不是限制性意义上考虑本说明书和实施例。此外，本文引用的所有论文、书籍、专利申请和专利出于所有目的以其整体通过引用并入本文。
【主权项】
1.哺乳动物细胞培养基制剂，其包含约3.5 g/L或更多的甘露糖和约1.5 mM至约9.5mM范围内的钙中的至少一者。2.权利要求1的制剂，其中所述培养基包含约3.5 g/L或更多的甘露糖和小于约1.5mM或大于约9.5 mM的I丐。3.权利要求1的制剂，其中所述培养基包含小于约3.5 g/L的甘露糖和约1.5 mM至约9.5 mM范围内的钙。4.权利要求1的制剂，其中所述培养基包含约4g/L至约5 g/L范围内的甘露糖。5.权利要求2的制剂，其中所述培养基包含约4g/L至约5 g/L范围内的甘露糖。6.权利要求1的制剂，其中所述培养基包含约2mM至约5 mM范围内的钙。7.权利要求3的制剂，其中所述培养基包含约2mM至约5 mM范围内的钙。8.权利要求1的制剂，其中所述制剂包含1:1比率的DMEM/F12且包括约4g/L至约5g/L范围内的甘露糖和约2 mM至约5 mM范围内的钙中的至少一者。9.在细胞培养物中产生重组蛋白的方法，其包括: 提供表达重组蛋白的细胞；和 在细胞培养基中培养所述细胞，所述细胞培养基包括约3.5 g/L或更多的甘露糖和约1.5mM至约9.5 mM范围内的钙中的至少一者。10.权利要求9的方法，其中所述培养基包含约3.5 g/L或更多的甘露糖和小于约1.5mM或大于约9.5 mM的I丐。11.权利要求9的方法，其中所述培养基包含小于约3.5 g/L的甘露糖和约1.5 mM至约9.5 mM范围内的钙。12.权利要求9的方法，其中所述培养基包含约4g/L至约5 g/L范围内的甘露糖。13.权利要求10的方法，其中所述培养基包含约4g/L至约5 g/L范围内的甘露糖。14.权利要求9的方法，其中所述培养基包含约2mM至约5 mM范围内的钙。15.权利要求11的方法，其中所述培养基包含约2mM至约5 mM范围内的钙。16.权利要求9的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。17.权利要求16的方法，其中所述哺乳动物细胞选自BHK细胞、CHO细胞、HKB细胞、HEK细胞和NS0细胞。18.权利要求17的方法，其中所述哺乳动物细胞是BHK细胞。19.权利要求9的方法，其中所述细胞表达凝血途径重组蛋白。20.权利要求19的方法，其中所述细胞表达重组人因子VIII(rhFVIII)、或其变体。21.权利要求20的方法，其中所述变体因子VIII是遗传变体。22.权利要求21的方法，其中所述遗传变体是B结构域缺失的FVIII。23.权利要求20的方法，其中所述变体因子VIII是聚乙二醇化的FVIII。24.权利要求9的方法，其中所述细胞是表达重组因子VIII的BHK细胞，其中所述培养基包含1:1比率的DMEM/F12且包括约4 g/L至约5 g/L范围内的甘露糖和约2 mM至约5mM范围内的钙中的至少一者。
【专利摘要】公开了增加重组蛋白的产生的制剂和方法以及其他方面。所述制剂和方法涉及在用于培养表达重组蛋白的细胞的细胞培养基制剂中增加甘露糖或钙浓度、或两者。在一些实施方案中，提供了具有约3.5？g/L或更多的甘露糖和约1.5？mM至约9.5？mM范围内的钙中的至少一者的哺乳动物细胞培养基制剂。提供了许多其他方面和/或实施方案。
【IPC分类】C07K14/755, C12N5/00
【公开号】CN105308174
【申请号】CN201480010579
【发明人】Y.希莫尼, V.默尔勒, V.斯里尼瓦桑, R.马坦吉汉
【申请人】拜尔健康护理有限责任公司
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2014年2月25日
【公告号】CA2902170A1, EP2961827A1, US20160002592, WO2014134071A1