CH0细胞克隆孔，重复Dot-Blot检测，用已知浓度的纯 化PTX3蛋白样本经序列稀释后制备标准曲线，通过阳性强度对比，评估各阳性细胞株的重 组蛋白产量，建立稳定高产的CH0细胞克隆株。
[0037] 优选地，所述步骤S5中纯化人类PTX3重组蛋白的方法为依次采用阴离子交换法、 羟磷灰石法以及排阻色谱法纯化法。
[0038] -种如权利要求1所述的人类PTX3重组蛋白在制备抗SARS的药物组合物中的用 途。
[0039] 本发明的有益效果
[0040] 1、从人类的原代上皮细胞中提取携带人类PTX3蛋白信息mRNA。由于本方法mRNA 是从类型单一极其接近自然状态人类原代上皮细胞中所提取，因而具有RNA酶活性低，RNA 提取产量高，纯度高，无降解等优点。保证了核苷酸序列的完整性，使反转录合成cDNA的成 功率大大提高。
[0041] 2、将所述重组表达载体转化至大肠杆菌中，用氨苄青霉素培养基筛选出阳性菌 落，扩增阳性转化菌落，提取所述重组载体进行特异性内切酶消化和核苷酸测序双重鉴定， 确保所构建的pSG5/neo/PTX3载体正确无误；通过先将重组载体转化至大肠杆菌中培育转 化体，以达到蓄积大量测序正确的重组表达载体pSG5/neo/PTX3的目的。
[0042] 3、通过将CH0-K1细胞中的促凋亡因子bax和bak基因敲除，建立了具有抗凋亡功 能的CH0细胞，提高了重组蛋白表达细胞持续存活时间与细胞培养密度，进一步提高了重 组蛋白的产出率。
[0043] 4、本发明构建了能在哺乳动物细胞中稳定高表达蛋白的载体，通过抗生素筛选以 及培养液条件的改进，建立产量较高，表达稳定，适合悬浮培养的细胞株，初选出来的细胞 株的人类PTX3重组蛋白产量> 50mg/L，同时，我们采用阴离子交换法、羟磷灰石法以及排 阻色谱法纯化法等三种方法纯化PTX3重组蛋白，使得重组蛋白回收率达到69 %，纯度达到 95%〇
[0044] 5、本发明所制备的人类PTX3重组蛋白经体外细胞测试与体内动物模型应用，证 明其能与SARS样病毒结合，并抑制病毒复制，对病毒的呼吸道感染具有治疗药理价值。
【附图说明】
[0045] 图1:本发明的PSG5/PTX3的构建示意图；
[0046] 图2 :本发明的pSG5/PTX3/neo的构建示意图；
[0047] 图3 :本发明的锌指蛋白制备及其基因敲除结构示意图；
[0048] 图4 :本发明的重组蛋白PTX3纯化后的Western Blot检测结果示意图；
[0049] 图5 :本发明的PTX3对小鼠MHV1的亲和力测定示意图；
[0050] 图6 :本发明的PTX3对小鼠MHV1繁殖的抑制作用的示意图；
[0051] 图7 :本发明的PTX3重组蛋白对病毒感染引起的肺损伤程度示意图；
[0052] 图8 :本发明的PTX3重组蛋白对病毒的清除作用示意图。
【具体实施方式】
[0053] 下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文 字能够据以实施。
[0054]应当理解，本文所使用的诸如"具有"、"包含"以及"包括"术语并不配出一个或多 个其它元件或其组合的存在或添加。
[0055] 本发明一种人类PTX3重组蛋白的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0056] S1、从人类的原代上皮细胞中提取携带PTX3蛋白翻译信息的mRNA，设计特异性引 物，以所述mRNA为模板，合成cDNA，并在所述cDNA的两端分别引入限制性酶切位点BamH I 和Bgl II ;
[0057]S2、用内切酶暴露出真核细胞表达载体pSG5上的BamHI和BglII粘性末端，将 上述带有BamHI和BglII末端的所述cDNA克隆到所述表达载体上构建pSG5/PTX3载体， 在所述PSG5/PTX3载体中插入新霉素抗性基因，构建重组载体pSG5/ne〇-/PTX3 ;
[0058] 在表达载体pSG5/PTX3中插入新霉素抗性基因，形成pSG5/PTX3/neo重组表达载 体，以新霉素抗性筛选稳定的转染CH0-K1细胞。只有表达载体转染阳性的细胞，才能够合 成并分泌新霉素抗性蛋白，从而帮助细胞抵抗G418的攻击。在pSG5载体的BamHI和Bgl II这两个酶切位点间没有其他有用序列，酶切以后不会影响本身的功能，能够最大限度的 保持pSG5载体的功能完整性；
[0059]S3、将所述重组载体转化至大肠杆菌宿主菌株DH5a中，通过在补充有50mg/L氨 苄青霉素的LB培养基上培育筛选出阳性转化菌落；小批量培养阳性菌落并提取载体，并用 BamHI和Bgl II对载体进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定插入片段大小，并 切胶回收，测序鉴定；鉴定无误后，将所述重组载体转化阳性的菌落扩大培养；
[0060] S4、敲除CH0-K1细胞中Bax和Bak基因，为切除CH0-K1细胞中的促调亡基因Bak 和Bax，设计8个锌指蛋白模炔基因，将其分成两组，4个连接在一起构成一个大锌指蛋白结 构基因，每个大锌指蛋白结构基因跟一个FokI核酸内切酶基因连接。两个FokI连接后 将基因切断，非同源基因片段末端连接，造成CH0-K1细胞中的促凋亡基因Bak和Bax的敲 除。得到具有抗凋亡特性的目标细胞并冷藏；
[0061 ] 如图3所示，为切除CH0-K1细胞中的促调亡基因Bak和Bax，设计8个锌指蛋白模 炔基因，将其分成两组，4个连接在一起构成一个大锌指蛋白结构基因，每个大锌指蛋白结 构基因跟一个FokI核酸内切酶基因连接。两个FokI连接后将基因切断，非同源基因片 段末端连接，造成CH0-K1细胞中的促凋亡基因Bak和Bax的敲除。
[0062] S5、以纯化并测序鉴定后的所述重组载体转染所述目标细胞中以得到表达细胞， 培育并筛选稳定高产的PTX3重组蛋白表达细胞株，从所述表达细胞的培养液中富集并纯 化人类PTX3重组蛋白。
[0063] 所述步骤S4中，对所述CH0-K1细胞进行基因敲除的步骤，当两个锌指蛋白核酸酶 (ZFN)切割靶位点，制造出双链断裂以后，细胞的修复机制被激活，DNA的非同源的末端连 接，会有70%的概率通过随机删减或添加可以引起移码突变的碱基，或无义突变引起蛋白 质长度变化，从而导致基因敲除，再通过细胞筛选和基因测序鉴定从而得到基因敲除细胞， 其具体敲除步骤包括：
[0064] S41、合成编码Bak锌指蛋白的第一基因和编码Bax锌指蛋白的第二基因，并分别 与非特异性核酸内切酶FokI融合；
[0065]S42、将所述第一基因、第二基因以及所融合的非特异性核酸内切酶FokI基因片 段一并插入带有抗卡那霉素基因的PVAX1载体中，构建特异性内源性基因敲除载体；
[0066] S43、将所述特异性内源性基因敲除载体转入所述CH0-K1细胞中，所述转染的 CH0-K1细胞表达的所述带有非特异性核酸内切酶FokI的Bak锌指蛋白和Bax锌指蛋白， 分别特异性的锚定到所述CH0-K1细胞自身的Bak和Bax基因，进而敲除所述促凋亡因子， 得到所述目标细胞。本发明中的Bak锌指蛋白和Bax锌指蛋白结合得更加紧密，不会出现 抛锚现象，酶切位点比较准确，并且锌指蛋白是偶数对。
[0067] 所述步骤S4中所述目标细胞转染所述重组载体之前还包括以下步骤：
[0068]S44、在转染前7天，将所述目标细胞用添加有体积分数为10%的胎牛血清的F12 培养液培养于24孔板中；
[0069]S45、在转染前6天至转染前1天的期间，每天更换培养液的同时丢弃一半数目的 所述目标细胞，使用由CD-CH0无血清培养液和含有体积分数为10 %的胎牛血清的F12培养 液组成的混合培养液培养，其中所述混合培养液中的胎牛血清的体积分数每天递减2 %，直 至为〇，在转染前1天将所述目标细胞转移至6孔培养板中，每孔装有2mL的所述目标细胞 悬浮液。
[0070]所述F12 培养液中添加 4. 76g/L的HEPES和 125mg/LL-glutamine。添加的 HEPES有很强pH值调节缓冲作用，使培养液的pH值能稳定在有利于细胞生长范围内。 L-glutamine是左旋谷氨酰胺，在细胞培养时是重要的。它是核酸碱基从头合成的途径的重 要原料，如果缺失就会造成细胞合成DNA的效率下降，造成细胞分裂的减少。同时，脱掉氨 基后，L-glutamine可作为培养细胞的能量来源，参与蛋白质的合成。
[0071] 所述6孔板中每孔细胞数为2. 7X105个。细胞融合度约为30-40%，此时细胞量 不是太多，营养充分，状态较好，为转染的最佳时机。于转染前3小时更换培养液，取纯化后 重组载体5yg以磷酸钙法转染细胞。
[0072] 所述步骤S5中所述目标细胞转染所述重组载体之后，表达细胞的筛选培育具体 步骤如下：
[0073]S51、将所述重组载体转染的目标细胞转移至T25培养瓶中，并在培养液中添加 700yg/mL的G418 ;
[0074]S52、待表达细胞在含有700yg/mLG418的培养液中扩增至培养瓶底面积的80% 时，将一瓶中的所述表达细胞均分至3瓶培养，并将培养液中G418的浓度减少至200yg/ mL；
[0075]S53、待表达细胞繁殖融合至培养瓶底面积的50%时，将这3瓶中的细胞汇总并记 录细胞的总数。
[0076] 所述步骤S5中筛选表达细胞具体包括以下步骤：
[0077]S54、取步骤S5-3中的经G418选择培养的阳