毒蛋白表达变化，结果如图10中B所示， sgIE-1敲出的细胞相对sgMock处理后，早期蛋白IE-1直到24hp.i.才能检测到微弱的条 带，晚期蛋白VP39到48hp.i.才能够检测到明显的蛋白条带，同样极晚期蛋白Poly直到 48hp.i.都没有检测到蛋白表达。总体蛋白表达相对sgMock处理的细胞延迟24h以上，这 一结果充分说明了Cas9的敲出效率是非常明显的。最后，对sgIE-1敲出的细胞的病毒感 染力TCID5。进行了分析，结果如图10中C所示，发现sgIE-1敲出的细胞相对sgMock病毒 毒力下降3-4个数量级。
[0057] 实施例3、稳定表达CRISPR/Cas9系统抑制BmNPV增殖效果检测
[0058]Invitrogen公司开发的昆虫细胞表达载体pIZ_V5/His含有Zeocin抗性基因，通 过长时间抗生素筛选可以获得稳定表达外源蛋白的细胞系。为了提高抗基因编缉载体的抗 病毒效果，将基因编缉载体pIZ-Cas9-Mcherry-U6_sgMock和pIZ-Cas9-Mcherry-U6_sgIEl转染到BmN-SWUl细胞中，转染48小时稳定后用含400 y g/mL浓度的Zeocin抗生素的培养 基筛选阳性细胞一周左右，大量细胞死亡后逐步降低抗生素浓度，最后稳定培养。结果如图 11所示，大概筛选两个月左右基本95%以上的细胞都含有目的蛋白的表达，证明这个细胞 能够稳定表达目的蛋白，可以用于抗病毒研究。
[0059] 用稳定表达基因编缉载体的细胞感染BmNPV，72小时后荧光观察 pIZ-Cas9-Mcherry-U6_sgMock和pIZ-Cas9-Mcherry-U6_sgIEl稳定细胞系的病毒复制情 况，结果如图12所示，稳定表达sgMock的细胞病毒感染基本不受影响，而sgIE-1稳定细胞 系基本检测不绿色荧光，通过荧光统计分析发现稳定表达sgMock感染率达100%，sgIE-1 稳定细胞系只达到5%左右，表明sgIE-1系统具有非常明显的抗病毒效果。
[0060] 为了充分证明含有基因编缉系统地稳定细胞系能够充分抑制病毒增殖，对感染病 毒的SgMock和SgIE-1稳定细胞系的病毒感染力TCID5。进行了分析，结果如图13所示，发 现sgIE-1基因编缉的细胞相对sgMock病毒毒力下降6-7个数量级，sgIE-1基因编缉的细 胞基本没有再次感染能力。
[0061] 实施列4、病毒诱导型CRISPR/Cas9系统构建及分析
[0062] 目前，CRISPR/Cas9基因编缉技术已经迅速应用于人类疾病基因治疗及基因工程 研究，但是Cas9的脱靶现象仍然困扰着大多数基因编缉研究学者，虽然有很多策略能够降 低之中脱靶效率，但是并没有一种方法能够彻底避免脱靶。因此，进一步利用构建的病毒诱 导型39K启动子来启动这一基因编缉载体，利用先前同样的方法把Hr3-39K启动子经过Xho I/ClaI酶切连接到相应的载体上，转化、挑取阳性克隆、酶切验证。其中Hr3-39K启动子序 列为SEQIDNo. 18。载体命名pHr3-39K-Cas9-Mcherry-U6为这一系统在病毒感染后能够 启动子迅速被病毒激活，然后表达Cas9蛋白，从而编辑病毒基因，病毒诱导型基因编缉原 理如图14所示。
[0063]为了更精确的验证病毒诱导型基因编缉系统地编辑的效率，首先转染pHr3-39K-Cas9_Mcherry-U6载体48小时后，在不同时间点加入病毒，通过mRNA水平和蛋白 水平检测Cas9被诱导转录和翻译的时间。结果如图15中A所示，病毒感染后，6小时就能 检测Cas9基因开始转录，一直持续增加到24小时，Cas9蛋白24小时就能检测到大量的表 达，说明这个基因编缉系统在病毒感染后能够迅速转录翻译，从而编缉病毒基因，从而达到 抗病毒效果。
[0064] 同理为了检测这个基因编缉系统对病毒的敏感性，分别用M0I为100、50、20和5 的病毒滴度来感染过表达pHr3-39K-CaS9-Mcherry-U6载体的细胞。感染48小时后，分别 提取RNA和蛋白检测Cas9转录和表达水平，结果如图15中B所示，不同浓度的病毒滴度对 Cas9转录和蛋白表达并没有显著的差异，结果说明我们构建的病毒诱导型基因编缉载体能 够在极微量的病毒感染后就能够被激活，能够快速反映，抑制病毒大规模扩增。
[0065] 实施列5、病毒诱导型CRISPR/Cas9系统抗病毒分析
[0066] 为了提高抗基因编缉载体的抗病毒效果，将基因编缉载体pHr3-39K-Cas9-Mc herry-U6-sgMock(pIZ-Cas9-Mcherry-U6_sgMock载体的启动子由Hr3_39K替换）和 pHr3-39K-Cas9-Mcherry-U6-sgIE-l转染到BmN-SWUl细胞中，转染48小时稳定后用含 400ug/mL浓度的Zeocin抗生素的培养基筛选阳性细胞一周左右，大量细胞死亡后逐步降 低抗生素浓度，最后稳定培养。大概筛选两个月左右基本95%以上的细胞都含有目的蛋白 的表达，证明这个细胞能够稳定表达目的蛋白，可以用于抗病毒研究。
[0067]用稳定表达基因编缉载体的细胞感染BmNPV，72小时后荧光观察pHr3-39K-Cas9-Mcherry-U6_sgMock和pHr3-39K-Cas9-Mcherry-U6-sgIE_l稳定细胞系 的病毒复制情况，结果如图16所示，稳定表达sgMock的细胞病毒感染基本不受影响，而 sgIE-1稳定细胞系基本检测不绿色荧光，通过荧光统计分析发现稳定表达sgMock感染率 达100%，sgIE-1稳定细胞系只达到5 %左右，这一系统具有非常明显的抗病毒效果。
[0068] 为了说明含有病毒诱导型基因编缉系统的稳定细胞系能够充分抑制病毒增殖，对 感染病毒的sgMock和sgIE-1病毒诱导型稳定细胞系的病毒感染力TCID5。进行了分析，结 果如图17所示，sgIE-1基因编缉的细胞基本没有再次感染能力，这一结果充分证明了构建 的病毒诱导型基因编缉系统能够快速敏感的抑制病毒增殖复制。
[0069] 最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通 过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在 形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. Cas9介导的家蚕基因编辑载体，其特征在于：包括U6启动子调控sgRNA表达的表达 框U6-sgRNA和IE-I启动子调控Cas9表达的表达框。2. 根据权利要求1所述Cas9介导的家蚕基因编辑载体，其特征在于：还包括荧光标记 系统。3. 根据权利要求2所述Cas9介导的家蚕基因编辑载体，其特征在于：所述荧光标记系 统为Mcherry红色焚蛋白。4. 根据权利要求1所述Cas9介导的家蚕基因编辑载体，其特征在于：所述Cas9的核 苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述表达框U6-sgRNA含有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序 列，所述IE-I启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。5. 根据权利要求3所述Cas9介导的家蚕基因编辑载体，其特征在于：所述Mcherry红 色荧蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO. 17所示。6. 根据权利要求1所述Cas9介导的家蚕基因编辑载体，其特征在于：所述Cas9由SEQ ID NO. 18所示的Hr3-39k诱导型启动子调控表达。7. 根据权利要求1~6任一项所述Cas9介导的家蚕基因编辑载体，其特征在于：所述 sgRNA为egfp基因的sgRNA或ie-1基因的sgRNA ;所述egfp基因的sgRNA的核苷酸序列 含有如SEQ ID NO. 5~10所示中的任意一条或两条；所述ie-1基因的sgRNA的核苷酸序 列如SEQ ID NO. 11~16所示中的任意一条或两条。8. 含有权利要求1~7任一项所述Cas9介导的家蚕基因编辑载体的转化体。9. 权利要求1~7任一项所述Cas9介导的家蚕基因编辑载体在昆虫基因功能研究或 家蚕抗BmNPV品系基因工程育种中的应用。
【专利摘要】本发明公开了Cas9介导的家蚕基因编辑载体，包括组成型基因编辑载体和诱导型基因编辑载体，其中组成型基因编辑载体包括U6启动子调控sgRNA表达的表达框U6-sgRNA和IE-1启动子调控Cas9表达的表达框，诱导型基因编辑载体Cas9由Hr3-39k诱导型启动子调控表达，本发明的Cas9介导的基因编辑载体能够稳定、高效编辑目的基因，为制备昆虫抗病毒转基因素材和具有高效抗病毒的品种提供了有力的工具。
【IPC分类】C12N15/85, A01K67/04, C12N5/10
【公开号】CN105132460
【申请号】CN201510630939
【发明人】潘敏慧, 鲁成, 董战旗, 胡楠, 陈婷婷, 陈鹏
【申请人】西南大学
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年9月29日