专利名称：绒山羊VEGF164基因cDNA核苷酸序列及其毛囊特异性表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及从体外培养的绒山羊胎儿成纤维细胞分离的编码VEGF164蛋白的 cDNA及其毛囊特异性表达载体，更具体地说涉及编码VEGF164蛋白质的cDNA的573bp的 核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列及将克隆到的VEGF164基 因与毛囊特异性的KAP6-1 基因启动子片段以及红色荧光蛋白表达元件连接构成VEGF164毛囊特异性表达载体 pCDsRed-KVo
背景技术：
内蒙古白绒山羊是经过长期自然选育形成的优良地方性绒肉兼用型品种，所产羊 绒具有径细绒长、综合品质优良的特点，但由于近年来草场退化，种群数量增加，舍饲比例 加大，导致产绒量降低。通过转基因技术导入促进毛囊发育和绒毛生长的功能基因，培育高 产绒量新品系是解决这一问题的有效手段。血管内皮生长因子是一种二聚体糖蛋白，具有 促进毛囊发育和毛发生长的功能。克隆内蒙古白绒山羊血管内皮生长因子(VEGF164)基因 并构建毛囊特异性表达载体，稳定转染胎儿成纤维细胞，筛选得到转基因细胞克隆，将为通 过核移植方法获得高产绒量转基因绒山羊新品种提供条件。血管内皮生长因子是1979年Dvorak等首先在无血清的肿瘤细胞培养液及动物 癌性腹水中发现，Senger等(1983)分析后确定是一种以二硫键结合的二聚体肝素亲合性 糖蛋白并命名为血管渗透因子(vascular permeability factor，VPF)。Gospodarowicz 和Ferrara等(1989)从牛的垂体滤泡细胞中分离得到类似物，命名为血管内皮生长因子 (vascular endothelial cell growth factor, VEGF)，后经分析发现二者是同一种细胞因 子，具有特异作用于血管内皮细胞的特异性，在体外可诱导血管发生，并可增加血管壁的通 透性，促进血管内皮细胞的增殖和迁移，促进伤口愈合及在恶性肿瘤中过表达等。近年的研 究发现VEGF可明显促进毛乳头细胞的增殖和迁移，转VEGF基因小鼠可以促进毛发生长。进 一步的研究表明(Man等，2009) VEGF是毛乳头细胞的一种自分泌生长因子，在人初级毛囊 中有表达，在外分泌汗腺的囊泡基底膜中的表达量也非常丰富。VEGF与动物毛囊发育和毛 发生长密切相关。迄今，关于VEGF在大鼠和小鼠中已被证实可以促进毛发的生长，但与绒山羊相关 的研究还未见报道。也未见有绒山羊VEGF基因的cDNA核苷酸序列和与它对应的氨基酸序 列的报道。在各种情况下，有重要的原因研究和开发与绒山羊VEGF蛋白相关的基因克隆及 其重组表达，因为研究清楚绒山羊的VEGF基因和蛋白的功能，可以用在通过转基因克隆技 术培育高产绒量绒山羊，提高绒毛产量等方面，得到的绒山羊VEGF164基因的核苷酸序列 可以用于通过RT-PCR方法或杂交的方法检测VEGF164基因在绒山羊不同组织和不同发育 阶段的表达特性。
发明内容
本发明的目的是通过已知的不同物种的VEGF基因的核苷酸序列设计引物，然后 通过RT-PCR方法克隆绒山羊VEGF164基因的cDNA片段。对该片段测序后提供编码绒山羊 VEGF164蛋白的基因cDNA的573bp的核苷酸序列和由此序列推断的氨基酸序列；将克隆到 的VEGF164基因与毛囊特异性的KAP6-1基因启动子片段以及红色荧光蛋白表达元件连接 构成VEGF164毛囊特异性表达载体ρ⑶sRed-KV，稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞后获得了 具有红色荧光蛋白和新霉素抗性双选择标记的转基因细胞克隆，可以作为转基因体细胞核 供体用于细胞核移植，为利用克隆技术培育高产绒量绒山羊新品系提供了条件。本发明的基因产品采用以下方式表述1、绒山羊VEGF164基因cDNA片段，它的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所述。2、由权利要求1中cDNA的核苷酸序列推断出的绒山羊VEGF164蛋白质的氨基酸 序列如SEQ ID NO 2所述。3、构建的绒山羊VEGF164基因毛囊特异性表达载体ρCDsRed-KV如图9所示。本发明的基因产品的制备方法概述为本发明是一段从体外培养的绒山羊胎儿成纤维细胞分离的编码VEGF164蛋白 的cDNA及其毛囊特异性表达载体，更具体地说是编码VEGF164蛋白质的cDNA核苷酸序 列和与它对应的氨基酸序列及在毛囊细胞内特异性表达VEGF164蛋白的真核表达载体 PCDsRed-KV0本发明采用RT-PCR方法克隆基因并获得相应的核苷酸序列，首先设计了一对 引物并应用这对引物通过RT-PCR方法扩增出了绒山羊VEGF164基因cDNA的特异性片段， 经过测序后得到这一片段的573bp的核苷酸序列，包含编码VEGF164蛋白的完整ORF ；将克 隆到的VEGF164基因与毛囊特异性的KAP6-1基因启动子片段以及红色荧光蛋白表达元件 连接构成VEGF164毛囊特异性表达载体ρ⑶sRed-KV。其特征是在还没有绒山羊VEGF164基 因核苷酸序列的情况下，通过比较已知的小鼠、大鼠、人、绵羊、牛和马的VEGF基因的核苷 酸序列，找到保守区，然后根据GenBank中绵羊VEGF基因cDNA序列(EU857623. 1)设计出了 一对用于RT-PCR扩增绒山羊VEGF164基因cDNA片段的特异性引物，进而通过RT-PCR方法 扩增出了绒山羊VEGF164基因cDNA片段，测序后得到了 573bp的核苷酸序列和与它对应的 氨基酸序列；克隆到的VEGF164基因与毛囊特异性表达的KAP6-1基因启动子连接，顺序连 接红色荧光蛋白表达元件，构建成毛囊特异性表达VEGF164蛋白和稳定表达红色荧光蛋白 的真核表达载体。基于上述说明，本发明的技术特征也可以表述为一种自绒山羊分离的多 核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列，是下列序列之一 1)序列表中SEQ ID NO 1的cDNA 序列；2)与序列表中SEQ ID NO 1的cDNA序列相对应的标注为SEQ ID NO 2的氨基酸序 列。3)绒山羊VEGF164基因与KAP6-1基因启动子片段以及红色荧光蛋白表达元件连接构 成的毛囊特异性表达VEGF164蛋白和稳定表达红色荧光蛋白的真核表达载体ρ⑶sRed-KV。本发明具有以下突出的特点和显著的技术进步首先，这一绒山羊VEGF164基因 cDNA片段的核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列及其毛囊特异性表达载体在国内外是首 次获得。其次，本发明具有很强实用价值和未来广阔的应用前景。根据本发明利用RT-PCR 法克隆绒山羊VEGF164基因cDNA的弓|物和编码绒山羊VEGF164蛋白质的包括573bp的cDNA 的核苷酸序列和由它推断的氨基酸序列。此cDNA包括的573bp的核苷酸序列，它含有编码 含有190个氨基酸残基的VEGF164蛋白质的完整0RF，经过进一步的改造后构建了 VEGF164基因的毛囊特异性表达载体，转染绒山羊胎儿成纤维细胞后获得了稳定转染的转基因细胞克隆，可以作为转基因体细胞核供体用于细胞核移植，为利用克隆技术培育高产绒量绒山 羊新品系提供了条件。此外，它还可以亚克隆到如PET或pcDNA3. 1等原核或真核表达载体 上进行表达。重组的cDNA片段可能会表达出完整的绒山羊VEGF164蛋白，进而可用于抗体 生产，检测绒山羊各类细胞和组织、早期胚胎、个体在不同状态下的VEGF164的表达情况等等。
从下面给出的说明结合附图，本发明的上面目的的特征将变的明了。其中图1显示了绵羊VEGF基因的cDNA的核苷酸序列(GenBank登录号EU857623. 1)。图2显示了绒山羊VEGF164基因573bp的cDNA的核苷酸序列与绵羊(EU857623. 1) 的VEGF基因cDNA的序列的比较。图3显示了 573bp的绒山羊VEGF164基因的cDNA核苷酸序列(SEQ ID NO 1)禾口 由此序列推断的氨基酸序列(SEQ ID NO :2)。图4显示从绒山羊胎儿成纤维细胞分离的总RNA的RT-PCR的结果(573bp VEGF164的cDNA)的电泳图。图5显示本实验室构建的中间载体P19T-K的图。图6显示本实验室构建的中间载体ρ⑶sRed的构建流程图。图7显示中间载体P19T-KV酶切鉴定的电泳图。图8是显示毛囊特异性表达载体ρ⑶sRed-KV酶切鉴定的电泳图。图9显示VEGF164基因毛囊细胞特异表达载体构建流程及载体ρ⑶sRed-KV的图。图10是显示ρ⑶sRed-KV转染细胞48h后相差显微镜和荧光显微镜观察细胞的 图。图11是显示G418筛选9天后转基因细胞克隆的图。图12是显示通过PCR鉴定转基因细胞用引物在序列中位置示意图。图13是显示转基因细胞克隆的PCR鉴定的电泳图。图14是显示组织半定量RT-PCR分析VEGF164基因在绒山羊脑、心脏、睾丸、胰腺、 脾、肾和肺中的表达情况。图15是显示绒山羊VEGF164基因与其它14种脊椎动物的VEGF基因根据基因间 核苷酸序列的同源性建立的进化树。图16是显示推断的由绒山羊VEGF164基因核苷酸序列编码的VEGF164蛋白的二 级结构。图17是显示推断的由绒山羊VEGF164基因核苷酸序列编码的VEGF164蛋白具有 的VEGF蛋白所特有的保守性活性位点。
具体实施例方式本发明人已经努力从绒山羊的不同组织细胞中分离出VEGF基因。作为结果，本发 明人从绒山羊体外培养的胎儿成纤维细胞分离了 VEGF164基因的cDNA的573bp片段，并且 确定了它的核苷酸序列和由它推断出的氨基酸序列。本发明人通过比对已知的小鼠、大鼠、人、绵羊、牛和马的VEGF基因的核苷酸序列，找到保守区，然后根据GenBank中绵羊VEGF基 因cDNA序列(EU857623. 1)设计出了一对用于RT-PCR扩增绒山羊VEGF164基因cDNA片段 的引物(上游引物称为P1，下游引物称为P2)，并应用这对引物扩增出了特异性片段，测序 后得到了绒山羊VEGF164基因的cDNA的573bp片段，序列分析表明核苷酸序列与绵羊的 VEGF基因的(EU857623. 1)有99%的相似性，(572/573)，由此序列推导出的氨基酸序列与 绵羊的相比仅有1个氨基酸的差别。这一 cDNA片段称为“VEGF164”。将克隆到的VEGF164基 因与毛囊特异性的KAP6-1基因启动子片段以及红色荧光蛋白表达元件连接构成VEGF164 毛囊特异性表达载体pCDsRed-KV，稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞后获得了具有红色荧光 蛋白和新霉素抗性双选择标记的转基因细胞克隆。为了从绒山羊胎儿成纤维细胞中分离VEGF164基因，本发明人首先按照提取细 胞总RNA的标准要求收集体外培养的内蒙古白绒山羊(Inner Mongolia Cashmere Goat, Capra hircus)的胎儿成纤维细胞。然后利用TaKaRa的总RNA提取试剂盒(TaKaRa RNAiso Reagent)并按照使用说明书的操作程序提取绒山羊胎儿成纤维细胞的总RNA，然后以该总 RNA为模板进行反转录操作，得到cDNA第一链。再以此cDNA第一链为模板，利用特异性引 物P1、P2进行PCR扩增，得到目的片段(图4)。之后将电泳后分离的目的片段切胶回收， 测定双链cDNA的浓度，与pMD19-T克隆载体连接构建成质粒pMD19T_VEGF164。为了检测连接反应是否成功和扩增质粒pMD19T-VEGF164，将其转化E coli DH5 α 感受态细胞，然后将此被质粒PMD19T-VEGF164转化了的Ecoli DH5 α细胞涂在含有氨苄青 霉素的选择性平板上，并同时进行蓝、白菌落筛选。37°C培养16小时后选取白色的重组菌 落再进行平板划线培养12小时。作为结果，初步认定白色菌落为获得的重组菌落。重组菌落和重组质粒PMD19T-VEGF164的进一步鉴定则分为三个步骤进行。首先 挑取划线培养的菌落用Kieser法提质粒，再以此质粒为模板，用特异性引物Pl、P2进行PCR 鉴定，阳性的初步认定为重组质粒，其相应的 菌落则为重组菌落。然后，再挑取初步认定为 重组的菌落进行液体培养，精提质粒，再以此精提的质粒为模板进行PCR鉴定，阳性的质粒 进一步进行EcoR I+Hind III双酶切鉴定。经过了 PCR和酶切双重鉴定的质粒确定为重组质 粒PMD19T-VEGF164。作为结果，得到了显示阳性反应的重组质粒和重组菌落。将含有重组 质粒PMD19T-VEGF164的Ecoli DH5 α液体培养的样品送宝生物工程(大连)有限公司测 序。作为结果，获得了 573bp的山羊VEGF164基因cDNA的核苷酸序列。将本实验室前期构建的含有绵羊毛囊特异性表达的KAP6-1基因启动子的 pl9TK(图5，ΚΑΡ6-1基因启动子克隆和ρ19ΤΚ构建参见“郭旭东，毛舒燕，宝明涛，尹俊，旭 日干.绵羊角蛋白关联蛋白ΚΑΡ6-1基因5'端调控区的分子克隆及测序结果比较.内蒙古 大学学报(自然科学版)，2007，38 :58-63”)和pMD19T_VEGF164分别用Sal I+Sph I双酶 切后电泳，切胶回收P19TK大片段与VEGF164小片段(长573bp)，纯化后由T4DNA连接酶连 接，得到重组质粒P19T-KV。提取质粒后酶切鉴定重组结果，载体测序。序列测定表明基因 与KAP6-1启动子连接正确。以pCDsRed2质粒(该质粒由本实验室构建，含有以CMV启动 子稳定表达红色荧光蛋白的表达元件。CMV启动子PCR扩增正向引物(pC-Ι，从基因序列第 4679 位开始设计)序列为 5，-GTC GGT ACC TCT TTC CTG CGT TAT CCC-3，，引物设计时 5， 端加入了 KpnI识别位点(序列划线标示，以下相同)，在其前面加了 3个保护性碱基；反向 引物(pC-2，从基因589位开始逆向设计)序列为5，-GTG CCC GGG GAT CTG ACG GTT CACTAA A-3’，引物设计时5’端加入了 SmaI识别位点，在其前面也加了3个保护性碱基。以质 粒 PIRES2-EGFP 为模板进行 PCR 扩增，PCR 反应条件为95°C lmin、60°C lmin、72°C lmin，40 次循环。预期片段长度660bp红色荧光蛋白的质粒载体pDsRed2-l和PCR扩增出来的CMV 启动子部分片段分别以KpnI+Smal酶切，T4 DNA连接酶。构建流程见图6)为构建骨架，将 ρ⑶sRed2载体Bgl II酶切，回收后Klenow fragment补平，再经Hind III酶切，获得上游为平 末端，下游为Hind III粘性末端的pCDsRed2大片段(约4. 8kb)。pl9T_KV经Sma I +Hind III双酶切获得上游为平末端，下游为Hind III粘性末端KV片段(约1.6kb)。T4 DNA连接酶 连接ρ⑶SRed2大片段和KV片段，构建毛囊特异性表达载体ρ⑶sRed2-KV (图9)。转化大肠 杆菌DH5 α，提取质粒后经酶切鉴定重组结果并载体测序。经酶切鉴定及序列测定，载体构 建正确，完全符合预期要求，获得了重组表达载体。显示上面提到的特征的本发明的特异性PCR引物Pl和Ρ2，可以利用RT-PCR方法 扩增出绒山羊的VEGF164基因的cDNA片段。将本发明克隆的VEGF164基因cDNA重组到真 核表达载体上构建的毛囊特异性表达载体P⑶sRed-KV可以稳定转染绒山羊胎儿成纤维细 胞，在毛囊中可以表达出完整的VEGF164蛋白，促进毛囊发育和毛发生长。转VEGF164基因 细胞系的获得为通过克隆技术培育高产绒量绒山羊新品系提供了材料。根据本发明获得的 绒山羊VEGF164基因cDNA的核苷酸序列可进一步通过RT-PCR或杂交的方法检测VEGF164 基因的组织表达特异性，进而可用于检测绒山羊各类细胞和组织、早期胚胎、个体在不同状 态下的VEGF164基因的表达情况等。在下面的实施例中进一步说明了本发明，但这并不限制本发明的范围。实施例1 绒山羊VEGF164基因的cDNA 573bp片段的克隆为了克隆来自绒山羊胎儿成纤维细胞的VEGF164基因包含573bp编码区的cDNA， 根据图1公开的核苷酸序列(EU857623. 1)，并比对大鼠、小鼠、人、绵羊、牛和马的VEGF基因 核苷酸序列，找到保守区，然后以图1序列为基序首先制备允许扩增573bp的cDNA的PCR弓丨 物，即上游引物 Pl 5' CGGTCGAC ATGAAC TTTCTGCTCTCT 3'(其中 CG 为保护碱基，GTCGAC 为 Sal I 的酶切位点)。扩增的下游引物P2 AT GCATGC TCACCGCCTCGGCTTGTC 3' (AT 为保护碱基，GCATGC为Sph I的酶切位点)。 为了利用RT-PCR方法克隆VEGF164基因的cDNA，从绒山羊胎儿成纤维细胞分离总 RNA，利用TaKaRa总RNA提取试剂盒(TaKaRa RNAiso Reagent)并按照使用说明书的操作 程序提取绒山羊胎儿成纤维细胞总RNA，进行电泳检测和紫外测定RNA浓度后置于-80°C冰 箱保存备用。然后，利用TaKaRa的AMV反转录酶并按照使用说明书的操作程序进行反转录 反应，得到cDNA第一链。 以上面得到的cDNA第一链为模板，PU P2为引物，利用TaKaRa PrimeSTAR DNA 聚合酶进行PCR反应。PCR扩增的反应体系为25yL体系，5XPrimeSTAR Buffer 5μ L ； 2. 5mmol/L dNTPs 2 μ L ;10 μ mol/L 弓丨物 PI、P2 各 0· 5 μ L ；模板 cDNA 0. 5 μ L ；PrimeSTAR DNA聚合酶0. 25 μ L ；去离子水16. 25 μ L0 PCR的反应条件为95°C预变性5min，95°C lmin， 55°C 30S,72°C lmin，共 35 个循环，72°C延伸 10min，72°C TaqPolymerase 加尾 30min。预期 片段长度573bp。反应结束后，PCR产物10μ 1经琼脂糖凝胶进行电泳(0. 5% TAE,电 压8v/cm，1. 5h)。电泳结束，0. 5 μ g/ml的EB染色液中染色20分钟，再清水浸泡10分钟后 置于凝胶成像仪观察照相。作为结果，得到了 573bp的特异性目的片段(参见图4)。
为了将获得的573bp的cDNA特异性目的片段连接到pMD19_T克隆载体上，首先将 电泳分离的573bp的cDNA特异性目的片段进行切胶，然后利用胶回收试剂盒回收目的片 段，紫外测定浓度后按照PMD19-T克隆载体说明书操作 程序完成连接。为了检测连接反应 是否成功和进一步扩增质粒PMD19T-VEGF164，将其转化Ecoli DH5 α感受态细胞，然后将 此被质粒PMD19T-VEGF164转化了的Ecoli DH5 α细胞涂在含有氨苄青霉素和Χ-gal的选择 性平板上，并同时涂上IPTG进行诱导，实现蓝、白菌落筛选。涂布的平板37°C培养16小时 后选取白色的重组菌落再进行平板划线培养12小时。作为结果，得到了白色的重组菌落。进一步的工作是对重组菌落和重组质粒进行鉴定(理论上将只有含有重组质粒 的菌落才是真正的重组菌落)。首先将白色的重组菌落进行划线培养12小时，然后挑取菌 落，用Kieser法提质粒。再以此质粒为模板，用特异性引物PI、P2进行PCR鉴定。对阳性 的菌落进行摇床振荡液体培养12小时，精提质粒，紫外检测浓度并进行琼脂糖凝胶电 泳(0.5%TAE，电压8V/Cm，1.5h)检测，作为结果，得到了与预期结果大小相符的质粒。最 后一步是对精提的质粒利用酶切反应(EcoR I ,Hind III)进行二次鉴定。作为结果，得到 了 573bp的特异性目的片段。经过两次鉴定的重组质粒，与其相应的菌落即是重组菌落。将液体培养的重组菌 落样品Iml送英潍捷基(上海)贸易有限公司公司测序。作为结果，获得了绒山羊VEGF164 基因的cDNA编码区573bp片段的克隆。实施例2 绒山羊VEGF164基因cDNA的核苷酸序列图2显示了绒山羊VEGF164基因cDNA的核苷酸序列与绵羊的VEGF基因 (EU857623. 1) cDNA的核苷酸序列的比较。表明1)绒山羊VEGF164基因cDNA的核苷酸序 列与绵羊的VEGF基因cDNA的核苷酸序列有99%的同源性。由绒山羊的这段核苷酸序列推 导出的氨基酸序列与绵羊的VEGF蛋白相同位置片段的氨基酸序列相比(ACG49836. 1)只有 1个氨基酸的差异。图3显示了实施例1中获得的573bp的cDNA位核苷酸序列(SEQ ID NO 1)和推 断的氨基酸序列(SEQ ID NO 2)。在图3中，显示的序列是绒山羊VEGF164基因⑶S的核 苷酸序列，573bp的完整ORF和由此序列编码形成的分子量为22. 3KD的成熟蛋白质的190 个氨基酸，其N端的26个氨基酸残基组成信号肽序列，后面的164个氨基酸残基形成成熟 蛋白 VEGF164。实施例3 绒山羊VEGF164基因中间载体ρ 19T-KV和毛囊特异性表达载体 pCDsRed-KV 的构建将质粒pl9TK(本实验室构建，pMD19T载体上连接有1052bp的绵羊KAP6-1基因启 动子，见图5)和pMD19T-gVEGF164分别用Sal I+Sph I双酶切后电泳，切胶回收pl9TK大 片段与VEGF164小片段(长573bp)，纯化后由Τ4 DNA连接酶连接，得到重组质粒pl9T_KV。 提取质粒后酶切鉴定重组结果(图7)，载体测序。之后将pCDsRed2载体Bgl II酶切，回收后Klenow fragment补平，再经Hind III酶切，获得上游为平末端，下游为Hind III粘性末端的P⑶sRed2大片段(约4. 8kb)。 P19T-KV经Sma I +Hind III双酶切获得上游为平末端，下游为Hind III粘性末端KV片 段(约1. 6kb)。T4DNA连接酶连接ρ⑶sRed2大片段和KV片段，构建毛囊特异性表达载体 ρ⑶SRed2-KV。转化大肠杆菌DH5 α，提取质粒后经酶切鉴定重组结果(图8)并载体测序。构建的毛囊特异性表达载体ρ⑶SRed-KV经酶切鉴定正确，测序后显示VEGF164基因正确连 接在KAP6-1启动子的下游，顺序连接红色荧光蛋白表达元件，载体构建正确，完全符合预 期要求。ρ⑶SRed2载体是以pDsRed2为框架，在DsRed2基因上游加入CMV启动子，增强红 色荧光蛋白的表达，以提高转基因细胞的筛选效率。表达载体PCDsRed-KV构建流程见图9。实施例4 表达载体ρ⑶sRed-KV转染内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞扩大培养含重组质粒ρ⑶SRed2-KV的E.Coli DH5 α宿主菌，按照去内毒素质粒中 量提取试剂盒的说明提取和纯化质粒。以紫外分光光度计测定质粒浓度和纯度。利用限制 性内切酶Hind III (载体中单一酶切位点)将质粒线性化，乙醇沉淀回收。转染实验参照Lipo2000操作说明和要求进行。转染前一日，以胰蛋白酶消化P2 代绒山羊胎儿成纤维细胞并计数，离心去上清，以无抗生素、含10% FBS的DMEM/F12培养 液重悬细胞，按照6X IO4细胞/孔密度接种六孔培养板。转染当日，取25 μ 1约合4. 0 μ g 线性化质粒ρ⑶sRed2-KV至1. 5ml Eppendorf管中，用无血清DMEM/F12调整至终体积为 250 μ 1 ；另取1个1. 5ml Eppendorf管中加入Lipo20008 μ 1，同样以无血清DMEM/F12调整 至终体积为250 μ 1 ；室温放置5min，将质粒和脂质体放入同一个管中轻轻混勻，室温下静 置20min。细胞在转染前吸弃原培养液，用PBS洗3遍，将混合物500 μ 1加入六孔培养板细 胞中，摇动培养板混勻，在37°C、5% CO2、饱和湿度条件下培养，6hr后换DMEM/F12完全培养 基，继续培养至48hr后观察荧光并统计转染率。转染细胞培养48h后，在20倍荧光显微镜和相差显微镜下统计每一个视野中发红 色荧光细胞数和细胞总数的比值，连续统计3个视野，获得的平均值计算转染效率。经胰蛋 白酶消化接种在IOOmm培养皿中，24h后加入终浓度为800 μ g/ml的G418开始筛选，隔天换 液一次，连续培养9天后形成大量同时具有新霉素抗性和红色荧光标记的多克隆细胞群， 之后将G418的浓度调整为300 μ g/ml的维持浓度扩大培养后冻存。作为结果，Lipo2000介导线性化质粒ρ⑶sRed-KV转染细胞48h后观察荧光，统计 转染率约为10% (图10A，B)。连续筛选9天后培养皿中出现了荧光密集的多克隆细胞群 (图11A)。对分离的多克隆群细胞扩大培养，获得转基因细胞系(图11B)。实施例5 转基因绒山羊胎儿成纤维细胞克隆的PCR鉴定选取扩大培养成功后稳定表达红色荧光蛋白的转基因细胞克隆、转染空载体细 胞及未转染细胞，提取细胞基因组DNA进行PCR鉴定。PCR鉴定用特异性引物以预期的 pCDsRed2-KV 序列为模版进行设计，引物 P3 5 ‘ CACACCCACACTGAGAGC 3 ‘ 18mer ；P4 5' CGATCTCGAACTCGTGGC 3' 18mer，起始和终止位置见图 12。25 μ 1 反应体系TaKaRa LA Taq (5U/μ 1)0. 25 μ 1 ； IOx LA Buffer (Mg+plus) 2. 5 μ 1 ；dNTP Mixture (各 2· 5mM) 4 μ 1 ； 细胞基因组 DNA 0. 5μ 1 ；Pl (10 μ Μ) 0. 5 μ 1 ；Ρ2 (10 μ Μ) 0. 5 μ 1 ；ddH2016. 75 μ 1 ；反应条件 94°C 4min ;(94°C lmin、50°C 2. 5min、72°C 2. 5min，35 个循环)72°C IOmin0 预期片段长度 1405bp。作为结果，以基于VEGF164基因上游KAP6-1启动子序列设计的引物Pl和基于 VEGF164基 因下游CMV启动子序列设计的引物P2 PCR扩增重组序列片段，结果显示在预期 的1083bp处检测到一条特异性的扩增条带(图13)，表明ρ⑶sRed-KV已经整合到绒山羊胎 儿成纤维细胞的基因组DNA中，可以作为转基因体细胞核供体用于细胞核移植。实施例6 =VEGF 164基因在内蒙古白绒山羊不同组织中表达的半定量RT-PCR检测
内蒙古白绒山羊的脑、心脏、睾丸、胰腺、肝、脾、肾、肺等组织采自内蒙古白绒山羊种羊场屠宰后的羊体，现场采集后立即放入液氮冷冻，带回实验室置-80°C保存。按总 RNA提取试剂盒((TaKaRa RNAiso Reagent)说明书的操作方法分别提取各组织的总RNA， 琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整性，紫外测定RNA浓度，然后用Oligo d(T)20Primers按照 反转录酶AMV说明书的方法反转录合成cDNA第一链。按照组织表达半定量RT-PCR的要 求，为了保证各组织RT-PCR反应模版的数量一致，采用了两种措施，即首先每种组织的总 RAN反转录时，用量均为1 μ g ；然后以β -actin为内参，通过调整cDNA用量保证扩增出 的不同组织的β -actin条带一致，从而确定扩增目的基因VEGF164的PCR反应体系。内 参 β -actin 的 PCR 特异性引物为上游引物 P5 5 ‘ TGGCACCACACCTTCTA CAACGAGC 3 ‘； 下游引物 P6:5' CGTCCCCAGAGTCCATGA CAATG 3'。10 μ L 反应体系10XPCR buffer 1 μ L ； dNTP :0· 8 μ L ；模版cDNA: :PCR的反应条件为:10μ L扩增反应体系=IOXPCRbuffer lyL;dNTP0. 8yL;模版cDNA;引物 Pl 0. 2yL;引物 P2 0. 2 μ L ；r-Taq 0. 1 μ L ;ddH20。各 组织cDNA模版用量分别为脑0. 2 μ L、心脏0. 2 μ L、睾丸0. 3 μ L、胰腺0. 4 μ L、脾0. 1 μ L、 肾0. 3 μ LJi 0. 2μ L ；相对应的CldH2O用量分别为脑7. 1μ L、心脏7. 1μ L、睾丸7. 0μ L、 胰腺 6.9 μ L、脾 7.2 μ L、肾 7.0 μ L、肺 7. IyL0 扩增循环95°C 预变性 5min，(95°C lmin， 50°C 30S，72°C lmin)，34个循环，72°C延伸10min. PCR扩增目的基因VEGF164的特异性引 物(P1，P2)、反应循环及反应体系与实施例1 (绒山羊VEGF164基因的cDNA573bp片段的克 隆)中所述相同，各组织cDNA模版用量与扩增内参基因β-actin相同。β-actin预期片 段长度229bp，VEGF164预期片段长度573bp。反应结束后，PCR产物10 μ 1经琼脂糖凝 胶电泳检测(0. 5% TAE,电压8v/cm，1. 5h)。电泳结束，0. 5 μ g/ml的EB染色液中染色20 分钟，再清水浸泡10分钟后置于凝胶成像仪观察照相。作为结果，组织半定量RT-PCR分析表明，VEGF164基因在脑、心脏、睾丸、胰腺、脾、 肾和肺中都有表达，其中在睾丸，胰腺和肺中表达量相对较高，在脑，心脏和肾中相对较低 (图 14)。实施例7 :VEGF164基因核苷酸序列及其编码的蛋白的氨基酸序列生物信息学和 功能预测测序得到的内蒙古白绒山羊VEGF164基因cDNA序列用NCBI上的BLAST进行序 列比对(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)，开放阅读框(ORF)预测采用 DNAstar。 理论分子量大小和蛋白等电点预测采用Protein property calculator软件(http:// www. basic. North westtern. edu/biotools/proteincalc. html)。胃
用SMART程序(http://smart, embl. de/)，蛋白质功能位点分析采用Psite程序(http:// www. softberry. com)，蛋白质亚细胞定位采用ProtComp Version 9. 0程序，进化树建立使 用CLC软件。作为结果，测序得到内蒙古白绒山羊VEGF164基因cDNA核苷酸序列中GC含量 为 51. 1%。与人(AF486837. 1)、称猴(ΧΜ_001089925. 1)、犬属(NMJ)Ol 110502. 1)、小鼠 (BC061468. 1)、马(AB053350. 1)野猪(AF318502. 1)、牛(AB450824. 1)、绵羊(EU857623. 1) 的VEGF基因的碱基序列同源性分别为94%、94%、94%、90%、95%、95%、98%、99%。相应 的氨基酸序列同源性分别为94%、94%、94%、90%、95%、95%、98%、99%。与14种脊椎动 物的VEGF基因根据基因间核苷酸序列的同源性建立进化树(图15)，表明内蒙古白绒山羊与绵羊的亲缘关系最近。编码蛋白分析表明，内蒙古白绒山羊VEGF164基因最大ORF编码一个由190个氨基酸残基组成的蛋白质。该蛋白理论分子质量22.3KD，等电点(pl)8.02，氨基酸组成中 Glu, Cys含量最高，为16%。SMART分析表明该蛋白质1 26氨基酸位形成信号肽结构 域，49 131氨基酸位为血小板衍生和血管内皮生长因子家族(PDGF，VEGF)结构域，128 172氨基酸为表皮生长因子相似结构域，该结构域包含一些保守的半胱氨酸残基，对蛋白的 高级结构形成非常重要(图16)。Psite分析表明在100 103氨基酸位有一个蛋白激酶C 磷酸化位点，146 184氨基酸位有4个酪蛋白激酶磷酸化位点，56 59氨基酸位有1个 N-豆蔻酰化位点，83 88氨基酸位有1个微体C端靶信号，171 173氨基酸位有1个血 小板衍生的生长因子家族(PDGF，VEGF)标签(图17)。ProtComp Version 9. O将其定位于 细胞外(分泌)。生物信息学分析表明，克隆的绒山羊VEGF164基因与其它物种的VEGF基因既有较 高的同源性，又有序列上的差别，是绒山羊的一个新基因，为首次获得。对由该基因核苷酸 序列推断的VEGF164蛋白分析表明，该蛋白的氨基酸序列与其它物种的VEGF蛋白既具有保 守区的一致性，又具有不同的氨基酸残基。对绒山羊VEGF164蛋白的二级结构分析表明，该 蛋白具有VEGF蛋白保守的信号肽序列、功能结构域和活性位点，在细胞内表达后应该具有 VEGF血管内皮生长因子的功能，可以促进细胞生长和毛囊发育，在转基因动物中超表达可 以促进绒毛生长。
权利要求
绒山羊VEGF164基因cDNA片段，它的核苷酸序列如SEQ ID NO1所述。
2.由权利要求1中cDNA的核苷酸序列推断出的绒山羊VEGF164蛋白质的氨基酸序列 如 SEQ ID NO 2 所述。
3.构建的绒山羊VEGF164基因毛囊特异性表达载体PcdsRed-KV如图9所示。
全文摘要
本发明涉及从体外培养的绒山羊胎儿成纤维细胞分离的编码VEGF164蛋白的cDNA的核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列及毛囊特异性表达VEGF164蛋白和稳定表达红色荧光蛋白的真核表达载体pCDsRed-KV。其特征在于绒山羊VEGF164基因cDNA片段的核苷酸序列与它对应的氨基酸序列如SEQID NO1所述和SEQ ID NO2所述；构建的绒山羊VEGF164基因毛囊特异性表达载体pCDsRed-KV如图9所示。生物信息学分析表明，绒山羊VEGF164蛋白具有VEGF蛋白保守的信号肽序列、功能结构域和活性位点，在细胞内表达后具有VEGF血管内皮生长因子的功能，可以促进细胞生长和毛囊发育，在转基因动物中超表达可以促进绒毛生长。
文档编号C12N15/12GK101988066SQ20101055662
公开日2011年3月23日 申请日期2010年11月24日 优先权日2010年11月24日
发明者侯鑫, 刘东军, 刘俊娥, 李彬, 王志钢, 郭旭东, 鲍文蕾 申请人:内蒙古大学