专利名称：一种添加金属离子提高必特螺旋霉素产量的发酵工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类新药必特螺旋霉素的发酵工艺优化方法。具体说是通过添加金属离子提高必特螺旋霉素产量的一种发酵工艺。
背景技术：
医药生物技术研究所王以光教授等人运用同源重组技术将4″位异戊酰基转移酶基因整合至螺旋霉素产生菌streptomyces spiramyceticusF21染色体上，得到了稳定的必特螺旋霉素基因工程菌WSJ-1.的必特螺旋霉素为混合型抗生素，其主组分4″-酰化螺旋霉素。由于其在国内外均为首创，于2000年10月获得中国发明专利(专利号ZL97104440.6)并在大量临床前试验研究基础上，于2001年7月获得国家药品监督管理局颁发的“新药临床研究批件”。必特螺旋霉素已经通过药品监督管理局的批准，按一类新药要求进行了临床试验，现在已经通过I期临床研究。现有的必特螺旋霉素的发酵生产只是一些较常规的发酵生产方式，所存在的突出问题是发酵单位较低，并且费时费力，往往达不到生产化的要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简便的生产工艺，在发酵过程中通过添加金属离子达到提高效价的目的。本发明是通过以下方式来实现一种添加金属离子提高必特螺旋霉素产量的发酵工艺，发酵工艺为将斜面接种于一级种子培养基，28℃培养48h，按10％接种量接种二级种子培养基，28℃培养24h；按4％接种量接种于发酵摇瓶中，220r/min，28℃旋转式摇床进行发酵，培养96h；或按4％接种量接种于发酵罐中进行发酵，28℃培养96h；，本发明在发酵初始时，将锰离子的水溶液添加到发酵摇瓶或发酵罐中进行发酵，使得发酵摇瓶或发酵罐中锰离子浓度为3～10mM，当发酵进行到18～30小时时，再将锰离子的水溶液添加到发酵摇瓶或发酵罐中，使得发酵摇瓶或发酵罐中的锰离子浓度为2～8mM。
另一种方法是在发酵过程中添加镁离子的水溶液，当上述的发酵进行到18～30小时时，将镁离子的水溶液添加到发酵摇瓶，使得发酵摇瓶中的镁离子浓度为5～35mM。
本发明与现有技术相比，具有如下特点(1)发酵水平高，已明显超过原工艺的水平。
(2)对组分没有影响。
(3)操作简单。
(4)成本低，便于大规模生产。
可以看出这种方法有效地克服了现有发酵方法的不足，为其实现工业产业化作好准备。
具体实施例方式
本发明内容通过以下的实施例作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。
实施例1斜面接种于一级种子培养基，28℃培养48h，按10％接种量接种二级种子培养基，28℃培养24h。按4％接种量接种于发酵摇瓶中，220r/min，28℃旋转式摇床培养96h。按常规方法配置发酵培养基后(发酵培养基淀粉、葡萄糖、鱼粉、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸铵、酵母粉)，将一定量的锰盐溶于定量的水中后添加到初始料中进行发酵，投入到摇瓶中后的锰离子浓度为3mM，当发酵进行到24小时时再一次性投入含一定量锰离子的水溶液于发酵液中，此时投入到摇瓶中后的锰离子浓度为8mM。
实施例2如实施例1的方法，将一定量的锰盐溶于定量的水中后添加到初始料中进行发酵，投入到摇瓶中后的锰离子浓度为7mM，当发酵进行到18小时时，再一次性投入含一定量锰离子的水溶液于发酵液中，此时投入到摇瓶中后的锰离子浓度为2mM。
实施例3
如实施例1的方法，将一定量的锰盐溶于定量的水中后添加到初始料中进行发酵，投入到摇瓶中后的锰离子浓度为10mM，当发酵进行到30小时时，再一次性投入含一定量锰离子的水溶液于发酵液中，此时投入到摇瓶中后的锰离子浓度为5mM。
表1.锰离子添加工艺在摇瓶上的实验结果没有添加过Mn2+Mn2+摇瓶对照Mn2+添加浓度(mM)摇瓶对照效价组分效价(u/ml) 组分 添加时间(h)(u/ml) (iso/sp) (iso/sp) 0mM/h实施例1 2000 3/1 4070 2/138(24h)实施例2 2440 3/1 3890 3/172(18h)实施例3 1600 1/1 3140 2/110 5(30h)实施例4如实施例1的方法，将发酵摇瓶改为发酵罐。
实施例5如实施例2的方法，将发酵摇瓶改为发酵罐。
实施例6如实施例3的方法，将发酵摇瓶改为发酵罐。
表2.锰离子添加工艺在30L发酵罐上的实验结果批 发酵罐对照 Mn2+发酵罐 Mn2+添加浓度(mM)号效价 组分 效价 组分添加时间(h)(u/ml) (iso/sp) (u/ml) (iso/sp) 0 /实施例4 2120 3/1 3320 2/1 3 8(24h)实施例5 2115 3/1 3232 2/1 7 2(18h)实施例6 1468 1/1 2380 1/1 10 5(30h)实施例7
基本发酵工艺流程为斜面接种于一级种子培养基，28℃培养48h，按10％接种量接种二级种子培养基，28℃培养24h。按4％接种量接种于发酵摇瓶中，220r/min，28℃旋转式摇床培养96h。按常规方法配置发酵培养基后(发酵培养基淀粉、葡萄糖、鱼粉、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸铵、酵母粉)，按常规方法配置发酵培养基后，当发酵进行到18小时时将一定量的镁盐溶于定量的水中，一次性投入到发酵液中，此时投入到摇瓶中后的镁离子浓度为25mM。
实施例8按照实施例7的方法，当发酵进行到25小时时，将一定量的镁盐溶于定量的水中，一次性投入到发酵液中，此时投入到摇瓶中后的镁离子浓度为6mM。
实施例9按照实施例7的方法，当发酵进行到30小时时，将一定量的镁盐溶于定量的水中，一次性投入到发酵液中，此时投入到摇瓶中后的镁离子浓度为35mM。
表3.镁离子添加工艺在摇瓶上的实验结果批没加Mg2+摇瓶对照 Mg2+摇瓶对照 Mg2+添加浓度号(mM)效价 组分 效价 组分 添加时间(h)(u/ml)(iso/sp) (u/ml) (iso/sp)实施例722263/1 3040 2/125(18h)实施例824403/1 3420 1.5/1 6(25h)实施例917004/1 2566 2/135(30h)
权利要求
1.一种添加金属离子提高必特螺旋霉素产量的发酵工艺，发酵工艺为将斜面接种于一级种子培养基，28℃培养48h，按10％接种量接种二级种子培养基，28℃培养24h；按4％接种量接种于发酵摇瓶中，220r/min，28℃旋转式摇床进行发酵，培养96h；或按4％接种量接种于发酵罐中进行发酵，28℃培养96h；其特征在于，在发酵的过程中，添加锰离子或镁离子的水溶液，使得发酵罐或发酵摇瓶中锰离子或镁离子的浓度为2-35mM。
2.如权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，发酵初始时，将锰离子的水溶液添加到发酵摇瓶或发酵罐中后，使得发酵摇瓶或发酵罐中锰离子浓度为3～10mM；当发酵进行到18～30小时时，添加锰离子的水溶液，使得发酵摇瓶或发酵罐中的锰离子浓度为2～8mM。
3.如权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，当发酵进行到18～30小时时，添加镁离子的水溶液，使得发酵摇瓶中的镁离子浓度为5～35mM。
全文摘要
一种添加金属离子提高必特螺旋霉素产量的发酵工艺。本发明是在按常规方法配置发酵培养基后，添加一定量的锰离子溶液或镁离子溶液，用本发明所建立的发酵工艺进行必特螺旋霉素的发酵水平已明显超过原工艺的水平，不仅效价高，而且操作简单成本低，便于大规模生产，有效地克服了现有发酵方法的不足，并为下一阶段的工业产业化的实现奠定了良好基础。
文档编号C12P19/62GK1546681SQ20031010932
公开日2004年11月17日 申请日期2003年12月12日 优先权日2003年12月12日
发明者庄英萍, 康源, 王永红, 储炬, 张嗣良 申请人:华东理工大学