一种通过添加金属离子提高龙须菜寡糖产量的方法
【专利摘要】一种通过添加金属离子提高龙须菜寡糖产量的方法，涉及龙须菜寡糖。以太平洋火色杆菌(Flammeovirga?Pacifica)H2为生产菌株，在基本培养基中添加钠、钾、铜、亚铁、镁、锌等离子化合物中的一种；所述基本培养基的组成为20～50g龙须菜干粉，加入自来水1000mL。所述化合物可采用氯化物等。利用太平洋火色杆菌(Flammeovirga?Pacifica)H2为生产菌株，通过在基本培养基中添加氯化钠、氯化钾、氯化铜、氯化亚铁、氯化镁、氯化锌等来提高龙须菜寡糖的产量。结果表明，在发酵培养体系中最高产量达到3.85g/L，比不加金属离子的对照组提高了52.2％。
【专利说明】一种通过添加金属离子提高龙须菜寡糖产量的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及龙须菜寡糖，尤其是涉及一种通过添加金属离子提高龙须菜寡糖产量的方法。
【背景技术】
[0002]本 申请人:在中国专利CN102827899A中提供了一种龙须菜琼胶寡糖及其制备方法与应用，制备方法:1)将菌株太平洋火色杆菌(Flammeovirga Pacifica)H2用活化培养基平板进行活化后，接种于种子培养基中，振荡培养得发酵液；所述活化培养基平板为:含经60~80目过筛后的龙须菜粉末I %，酵母膏0.2%，NaC13%，琼胶粉1.5%，蒸馏水配制，经121°C，20min灭菌后使用；所述种子培养基为:含CMC-Na20.5%~1.5%，酵母膏0.2%，NaC13%,蒸懼水配制，经12rC,20min灭菌后使用；所述太平洋火色杆菌(FlammeovirgaPacifica)H2已于2012年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCN0:M2012229o
[0003]龙须菜寡糖以太平洋火色杆菌(Flammeovirga Pacifica) H2为出发菌株，以龙须菜为底物发酵产生的一种具有自主知识产权的寡糖。前期对所制备的龙须菜寡糖的活性进行了初步的研究，结果表明，该龙须菜寡糖对荔枝、龙眼、圣女果、杨梅以及草莓等具有较好的保鲜作用，延长了贮藏期和货架寿命；可以有效抑制核盘菌的生长，为农业生产的应用提供了依据；具有抗氧化的生物活性，在保健品方面具有良好的应用价值。
[0004]上述制备方法将菌株与龙须菜共培养，利用菌株所产的酶系直接降解龙须菜获得寡糖，步骤简单，环境污染小，成本低。然而,在Flammeovirga PacificaH2进行发酵培养时，龙须菜寡糖的产量较低，制约了其作为功能性生物制品的开发研究，因此提高其龙须菜寡糖量是必须加以解决的问题。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于针对现有的龙须菜寡糖产量低的缺陷，提供一种通过添加金属离子提高龙须菜寡糖产量的方法。
[0006]本发明以太平洋火色杆菌(Flammeovirga Pacifica) H2为生产菌株,在基本培养基中添加钠、钾、铜、亚铁、镁、锌等离子化合物中的一种；所述基本培养基的组成为20~50g龙须菜干粉，加入自来水1000mL。
[0007]所述钠、钾、铜、亚铁、镁、锌等离子化合物可采用钠、钾、铜、亚铁、镁、锌等离子氯化物等。
[0008]钠离子化合物可采用氯化钠等，钾离子化合物可采用氯化钾等，铜离子化合物可采用氯化铜等，亚铁离子化合物可采用氯化亚铁等，镁离子化合物可采用氯化镁等，锌离子化合物可采用氯化锌等。
[0009]所述钠、钾、铜、亚铁、镁、锌等离子化合物的初始添加时间可为O~24h，最好均为Oh0
[0010]所述钠、钾、铜、亚铁、镁、锌等离子化合物的添加方式可为每次添加25~50mg/L，连续添加2~4次，使离子最终浓度达到50~200mg/L ;钠、钾、铜、亚铁、镁、锌等离子化合物的添加方式最好均为每隔6~12h添加一次，每次添加25~50mg/L，连续添加2~4次，使离子最终浓度达到50~200mg/L。
[0011]太平洋火色杆菌(Flammeovirga Pacifica) H2的保存条件为_80°C超低温冰箱。采用的种子培养基为:羧甲基纤维素钠10g/L，酵母粉2g/L，琼脂粉0.5g/L，沙滤海水1L，经121°C，20min高温灭菌冷却后使用。培养方法如下:
[0012]将低温冷冻保藏的菌株H2接种到装有50mL灭菌过的种子培养基的250mL三角瓶中，30°C、180r/min培养20~24h，按体积比5%接入到基本培养基中，培养40~48h，离心取上清检测龙须菜寡糖的含量。
[0013]本发明所述龙须菜寡糖的分析方法如下:
[0014]由于龙须菜寡糖为还原性糖，因此可采用DNS法测还原糖含量来测定龙须菜寡糖的含量。还原糖能与DNS溶液发生显色反应，通过比色法作出标准曲线，就可测出还原糖含量。所述标准曲线的绘制方法如下:
[0015]称取在105~110°C干燥后的葡萄糖50mg，用蒸馏水溶解定容到50mL，即得Img/HiL葡萄糖液，再稀释成不同浓度的葡萄糖液，再与水按体积比1: 3的比例混合，煮沸15min ;冷却离心后，用721分光光度计测定550nm波长处的吸光度值，以葡糖浓度为横坐标，OD550为纵坐标做标准曲线，以此做标准可得到样品液中还原糖的含量。
[0016]本发明旨在通过金属离子对龙须菜寡糖的代谢进行调控以实现龙须菜寡糖产量的提高，从而为大规模制备龙须菜寡糖提供技术支持，为开发龙须菜寡糖功能生物制品奠定基础。
[0017]本发明的有益效果:本发明利用太平洋火色杆菌(Flammeovirga Pacifica)H2为生产菌株，通过在基本培养基中添加氯化钠、氯化钾、氯化铜、氯化亚铁、氯化镁、氯化锌等来提高龙须菜寡糖的产量。结果表明，在发酵培养体系中最高产量达到3.85g/L，比不加金属离子的对照组提高了 52.2%。本发明对于太平洋火色杆菌H2发酵研究及龙须菜寡糖代谢调控研究具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为基本培养基中氯化钠对龙须菜寡糖产量的影响。
[0019]图2为基本培养基中终浓度150mg/L的氯化钠不同添加次数对龙须菜寡糖产量的影响。
[0020]图3为基本培养基中终浓度150mg/L的氯化钠不同添加时间对龙须菜寡糖产量的影响。
[0021]图4为基本培养基中氯化钾对龙须菜寡糖产量的影响。
[0022]图5为基本培养基中氯化铜对龙须菜寡糖产量的影响。
[0023]图6为基本培养基中氯化亚铁对龙须菜寡糖产量的影响。
[0024]图7为基本培养基中氯化镁对龙须菜寡糖产量的影响。
[0025]图8为基本培养基中氯化锌对龙须菜寡糖产量的影响。
【具体实施方式】
[0026]实施例1基本培养基中氯化钠对龙须菜寡糖产量的影响
[0027]如图1所示，在基本培养基中培养太平洋火色杆菌H2开始时，通过添加50mg/L、150mg/L、200mg/L终浓度的氯化钠,考察其对龙须菜寡糖合成的影响。结果发现终浓度为50mg/L的氯化钠，比没有任何添加物的对照提高了 15.1% ;添加终浓度为150mg/L的氯化钠，对龙须菜寡糖的合成促进作用最大，比没有任何添加物的对照组提高了 29.3% ;而添加终浓度为200mg/L的氯化钠时，龙须菜寡糖的产量只比对照组提高了 22.5%。根据少量多次以及实际实验确定在基本培养基中最佳添加方式为每隔8h添加一次50mg/L的氯化钠，共添加3次(即最后一次添加时间24h)，最终浓度为150mg/L，初始添加时间为Oh。
[0028]实施例2基本培养基中终浓度150mg/L的氯化钠不同添加次数及时间对龙须菜寡糖产量的影响
[0029]如图2所示，在基本培养基中培养H2时，对终浓度为150mg/L的氯化钠分不同添加次数，来确定最佳的添加次数。结果表明，在基本培养基中一次性加入终浓度为150mg/L的氯化钠，比对照组提高了 29.3% ;而分2次添加终浓度为150mg/L的氯化钠时，比对照组提高了 34.7% ;分3次添加终浓度为150mg/L的氯化钠时，比对照组提高了 41.5% ;分4次添加终浓度为150mg/L的氯化钠时，只比对照组提高了 38.1 %。因此根据少量多次的原贝U，首先确定对不同终浓度的添加物添加次数为3次。图3则表示，在基本培养基中分3次添加终浓度为150mg/L，每次间隔不同时间。结果发现，在发酵培养开始每隔6h添加一次，共计3次，加入终浓度为150mg/L时，比对照组产龙须菜寡糖提高了 35.3% ;结果发现，在发酵培养开始每隔8h添加一次，共计3次，加入终浓度为150mg/L时，比对照组产龙须菜寡糖提高了 47.1% ;结果发现 ，在发酵培养开始每隔12h添加一次，共计3次，加入终浓度为150mg/L时，比对照组产龙须菜寡糖提高了 41.5%。通过本实施例确定氯化钠的最佳添加方式为每隔8h添加一次50mg/L的氯化钠，共添加3次(即最后一次添加时间为16h)，最终浓度为150mg/L，初始添加时间为Oh。
[0030]实施例3基本培养基中氯化钾对龙须菜寡糖产量的影响
[0031]如图4所示，在基本培养基中培养H2时，每隔8h添加一次50mg/L的氯化钾，共添加3次(即最后一次添加时间为16h),最终浓度为150mg/L,初始添加时间为Oh。结果发现，按照这种添加方式，比对照组产龙须菜寡糖提高了 37.4%。
[0032]实施例4基本培养基中氯化铜对龙须菜寡糖产量的影响
[0033]如图5所示，在基本培养基中培养H2时，每隔8h添加一次50mg/L的氯化铜，共添加3次(即最后一次添加时间为16h),最终浓度为150mg/L,初始添加时间为Oh。结果发现，按照这种添加方式，比对照组产龙须菜寡糖降低了 20.4%。
[0034]实施例5基本培养基中氯化亚铁对龙须菜寡糖产量的影响
[0035]如图6所示，在基本培养基中培养H2时，每隔8h添加一次50mg/L的氯化亚铁，共添加3次(即最后一次添加时间为16h),最终浓度为150mg/L,初始添加时间为Oh。结果发现，按照这种添加方式，比对照组产龙须菜寡糖降低了 13.5%。
[0036]实施例6基本培养基中氯化镁对龙须菜寡糖产量的影响
[0037]如图7所示，在基本培养基中培养H2时，每隔8h添加一次50mg/L的氯化镁，共添加3次(即最后一次添加时间为16h),最终浓度为150mg/L,初始添加时间为Oh。结果发现，按照这种添加方式，比对照组产龙须菜寡糖提高了 52.2%。
[0038]实施例7基本培养基中氯化锌对龙须菜寡糖产量的影响
[0039] 如图8所示，在基本培养基中培养H2时，每隔8h添加一次50mg/L的氯化锌，共添加3次(即最后一次添加时间为16h),最终浓度为150mg/L,初始添加时间为Oh。结果发现，按照这种添加方式，比对照组产龙须菜寡糖提高了 3.3%。
【权利要求】
1.一种通过添加金属离子提高龙须菜寡糖产量的方法，其特征在于以太平洋火色杆菌(Flammeovirga Pacifica)H2为生产菌株，在基本培养基中添加钠、钾、铜、亚铁、镁、锌离子化合物中的一种；所述基本培养基的组成为20~50g龙须菜干粉,加入自来水lOOOmL。
2.如权利要求1所述一种通过添加金属离子提高龙须菜寡糖产量的方法，其特征在于所述钠、钾、铜、亚铁、镁、锌离子化合物采用钠、钾、铜、亚铁、镁、锌离子氯化物。
3.如权利要求1所述一种通过添加金属离子提高龙须菜寡糖产量的方法，其特征在于钠离子化合物采用氯化钠，钾离子化合物采用氯化钾，铜离子化合物采用氯化铜，亚铁离子化合物采用氯化亚铁，镁离子化合物采用氯化镁，锌离子化合物采用氯化锌。
4.如权利要求1所述一种通过添加金属离子提高龙须菜寡糖产量的方法，其特征在于所述钠、钾、铜、亚铁、镁、锌离子化合物的初始添加时间为O~24h。
5.如权利要求4所述一种通过添加金属离子提高龙须菜寡糖产量的方法，其特征在于所述钠、钾、铜、亚铁、镁、锌离子化合物的初始添加时间为Oh。
6.如权利要求4所述一种通过添加金属离子提高龙须菜寡糖产量的方法，其特征在于所述钠、钾、铜、亚铁、镁、锌离子化合物的添加方式为每次添加25~50mg/L，连续添加2~4次，使离子最终浓度达到50~200mg/L。
7.如权利要求6所述一种通过添加金属离子提高龙须菜寡糖产量的方法，其特征在于所述钠、钾、铜、亚铁、镁、锌离子化合物的添加方式均为每隔6~12h添加一次，每次添加25~50mg/L，连续添加2~ 4次，使离子最终浓度达到50~200mg/L。
【文档编号】C12P19/14GK104164461SQ201410359052
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年7月25日 优先权日:2014年7月25日
【发明者】产竹华, 刘胜龙, 陈兴麟, 曾润颖, 王润萍 申请人:国家海洋局第三海洋研究所