专利名称：一种的制作方法
技术领域：
本发明涉及稳定性同位素标记化合物生产领域，具体涉及微生物发酵和生物提取方法。
背景技术：
对L-谷氨酰胺的生产，国内外有一些研究小组对其作了许多研究工作(微生物学通报，4(5)211～212(1984)；16(2)73～76(1989)；发酵科技通讯，19(2)16～18(1990)；食品与发酵工业，221～25(1992)；工业微生物，21(5)11～17(1988)；微生物学杂志，6(3)35～37(1986)；Agri.Biol.Chem.，51(8)2089～2094(1987)；中国专利公报CN1225946A；日本特许公报昭62-18679；昭63-21379等)。但是，关于生物合成法研究15N稳定性同位素标记L-谷氨酰胺的生产领域中还不见专利和文献报道。采用直接发酵法生产，目标氨基酸大量富集，15N稳定性同位素容易标记，但由于发酵配方中有机氮源很难标记，常常使L-谷氨酰胺-15N的丰度下降很多达不到产品要求，所以需要对常规发酵配方进行改善。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的不足而提供一种旨在解决15N丰度下降的问题，并尽量提高15N利用率的15N稳定性同位素标记L-谷氨酰胺的发酵生产工艺。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现一种15N稳定性同位素标记L-谷氨酰胺的生产工艺，其特征在于，该工艺包括以下步骤(1)发酵菌株的选择用于L-谷氨酰胺生产的黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)、钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)之一；(2)保藏斜面制备将上述发酵菌株接种于斜面，29～37℃恒温培养8～20小时，得到保藏斜面，冷藏待用；(3)活化斜面制备将步骤(2)得到的保藏斜面接种于活化斜面，培养方法同步骤(2)；(4)发酵培养基的配制以全合成培养基为基本培养基，添加少量有机氮源。主要配方如下表所示说明碳源 葡萄糖6～14g/dL或蔗糖12～25g/dL无机氮源 氯化铵3～5g/dL或硫酸铵4～8g/dL有机氮源 玉米浆、菌体水解液等0～0.5mL/dLK2HPO4.3H2O 0.1～0.4g/dLMgSO4.7H2O0.02～0.08g/dLMnSO4.H2O 2～20mg/LFeSO4.7H2O2～20mg/LZnSO40.5～10mg/LVH 0～10μg/LVB1 50～500μg/LVB6 50～500μg/L泛酸 50～500μg/L尼克酸 50～500μg/L对氨基安息香酸 50～300μg/LCaCO32～6g/dL，分消(5)发酵工艺将步骤(3)培养好的活化斜面菌苔用少量培养基洗下后接种于已灭菌的装有步骤(4)所述发酵培养基的发酵摇瓶(500mL三角瓶装量20～50mL)或发酵罐(装液量为罐体积的40～60％)中开始发酵，摇床发酵控制条件为发酵初始温度30～39℃，初始pH6.4～6.8，摇床转速180～220r/min，发酵中后期(18～32小时)提高转速至240～280r/min，发酵时间60～96小时；发酵罐控制条件为发酵初始温度30～39℃，初始pH6.4～6.8，通气量0.5～1.5VVM，罐压0.02～0.05Mpa，溶解氧0.5～90％饱和度，通过聚醚类或硅酮类消泡剂消泡；在发酵中后期(18～32小时)，提高转速和通气量保证溶解氧在30～50％饱和度；发酵全过程控制pH在微酸性(添加15N标记尿素、氨水或液氨调节pH6.4左右)，流加50％葡萄糖控制发酵液葡萄糖浓度2～5g/dL，发酵时间48～72小时；(6)分离提取将步骤(5)培养好的发酵液，通过发酵液预处理(添加草酸除去金属离子，添加聚丙烯酰胺等絮凝剂、加热除去蛋白，离心除菌体)得到的上清液采用离子交换法等分部提取得到15N稳定性同位素标记L-谷氨酰胺溶液，通过真空浓缩赶氨并采用活性炭脱色、乙醇低温结晶、真空干燥得到产品。
步骤(1)中所述的黄色短杆菌是指黄色短杆菌(Brevobacterium flavum)ATCC14067、AS1.495、AS1.582和它们的突变株之一，谷氨酸棒杆菌是指谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13286、ATCC14751、ATCC13032、AS1.805、ACCC11063、IFFI10056、IFFI10052和它们的突变株之一，北京棒杆菌是指北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)AS1.299和其突变株之一，钝齿棒杆菌是指钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)AS1.452和其突变株之一。
步骤(4)中所述的发酵培养基中，玉米浆、菌体水解液等有机氮源添加极少量(0～0.5mL/dL，使用的有机氮源中氨基氮浓度5～20g/dL)以使其对15N丰度的影响降低到最低限度；通过直接添加VH、VB1、VB6、泛酸、尼克酸、对氨基安息香酸等维生素复合物，来促进生长，减少有机氮源的缺乏对菌体生长的影响，同时强化L-谷氨酰胺代谢流。
步骤(5)中所述的溶解氧的控制通过调整搅拌转速、通气量、罐压实现。
步骤(5)中所述的发酵培养中后期通过提高转速或通风，促进L-谷氨酰胺的生成。
步骤(5)中所述的发酵摇瓶通过添加CaCO3控制pH在微酸性，发酵罐上通过流加15N标记尿素、氨水或液氨来控制pH在微酸性。
步骤(5)中所述的发酵罐发酵，通过流加50g/dL葡萄糖溶液控制发酵液中葡萄糖浓度2～5g/dL。
本发明采用微生物直接发酵法生产L-谷氨酰胺-15N2，通过添加微量维生素复合物改善生长和代谢，旨在解决15N丰度下降的问题，并尽量提高15N利用率，以满足产品生产要求。
本发明通过改变发酵配方和工艺，直接添加VH、VB1、VB6、泛酸、尼克酸、对氨基安息香酸等维生素复合物，本发明获得的15N稳定性同位素标记L-谷氨酰胺产量比采用全合成培养基发酵产酸量相应提高10～50％以上，而15N稳定性同位素标记L-谷氨酰胺15N丰度下降可以减少到1％以下，有的甚至几乎不下降，大大提高了15N原料利用率，减少了生产成本。同时，在保证产品15N丰度条件下，简化发酵和提取工艺，由于原料得到充分利用大大节省了原料回收成本。本发明可利用低丰度和高丰度15N无机原料满足不同丰度产品要求。
具体实施例方式
实施例1使用菌种为以黄色短杆菌ATCC14067为出发菌诱变选育获得的突变株8A31，使用的培养基包括斜面保藏培养基、斜面活化培养基和摇瓶发酵培养基。斜面保藏培养基和斜面活化培养基同常规发酵采用相同。使用的发酵初始配方如下表所示发酵配方葡萄糖 12g/dL硫酸铵(15N丰度98.9％) 6g/dL玉米浆 0.1mL/dLK2HPO4.3H2O 0.25g/dLMgSO4.7H2O 0.05g/dL
MnSO4.H2O 10mg/LFeSO4.7H2O 10mg/LZnSO4.7H2O 1mg/LVH 3.5μg/LVB1400μg/LVB6400μg/L泛酸 400μg/L尼克酸 400μg/L对氨基安息香酸 200μg/LCaCO34g/dL(分消)将黄色短杆菌8A31从保藏斜面接种于活化斜面，31℃恒温培养箱中培养24小时，用少许发酵培养液洗下2支斜面菌苔转入上述发酵培养基中(500mL三角瓶装量20mL，共接10瓶)，然后加入分消CaCO3，31℃、200rpm于巡回式摇床上发酵培养32小时左右时调节转速240rpm，直到发酵终了，发酵培养72小时结束，发酵平均产L-谷氨酰胺-15N2可达28g/L。
发酵液采用711阴离子交换树脂单株分离，采用常规方法得到干燥固体L-谷氨酰胺-15N2产品，经质谱分析得到产品丰度98.28％，丰度下降0.627％。
如果将发酵培养基中玉米浆改为0.6，发酵工艺不变，发酵平均产L-谷氨酰胺-15N2可达36g/L，但丰度只有95.34％，丰度下降3.6％。如果发酵培养基中不加玉米浆，发酵平均产L-谷氨酰胺-15N2只有18g/L，丰度98.71％，丰度下降0.192％。上述发酵培养基中如果不添加泛酸、尼克酸、VB6、对氨基安息香酸等维生素复合物，发酵平均产L-谷氨酰胺-15N2只有22g/L。综合考虑，此发明效果显著。
实施例2使用菌种为以谷氨酸棒杆菌S9114为出发菌诱变选育获得的突变株SB274，使用的培养基包括斜面保藏培养基、斜面活化培养基和摇瓶发酵培养基。斜面保藏培养基和斜面活化培养基同常规发酵采用相同。使用的发酵初始配方如下表所示
发酵配方葡萄糖 14g/dL氯化铵，15N丰度98.7％ 4g/dL玉米浆 0.1mL/dLK2HPO4.3H2O 0.2g/dLMgSO4.7H2O0.05g/dLMnSO4.H2O 2mg/LFeSO4.7H2O2mg/LZnSO4.7H2O1mg/LVH 3.5μg/LVB1 400μg/LVB6 200μg/L泛酸 400μg/L尼克酸 400μg/L对氨基安息香酸 200μg/LCaCO35g/dL，分消将谷氨酸棒杆菌SB274从保藏斜面接种于活化斜面，31℃恒温培养箱中培养24小时，用少许发酵培养液洗下2支斜面菌苔转入装量20mL上述发酵培养基的500mL三角瓶中，然后加入分消CaCO3，31℃、220rpm于巡回式摇床上发酵培养24小时左右时调节转速260rpm，直到发酵终了，发酵培养72小时结束，发酵平均产L-谷氨酰胺-15N2可达26g/L。
发酵液采用711阴离子交换树脂单株分离，采用常规方法得到干燥固体L-谷氨酰胺-15N2产品，经质谱分析得到产品丰度98.19％，丰度下降0.517％。
实施例3使用菌种为以北京棒杆菌AS1.299为出发菌诱变选育获得的突变株AGM409，使用的培养基包括斜面保藏培养基、斜面活化培养基和发酵培养基。斜面保藏培养基和斜面活化培养基同常规发酵采用相同。使用的发酵初始配方如下表所示发酵初始配方葡萄糖 6g/dL氯化铵，5N丰度99.2％4g/dL玉米浆 0.1mL/dLK2HPO4.3H2O 0.25g/dLMgSO4.7H2O0.06g/dLMnSO4.H2O 10mg/LFeSO4.7H2O10mg/LZnSO4.7H2O1mg/LVH 5μg/LVB1 200μg/LVB6 400μg/L泛酸 400μg/L尼克酸 400μg/L对氨基安息香酸 200μg/L将北京棒杆菌AGM409从保藏斜面接种于活化斜面，31℃恒温培养箱中培养24小时，用少许发酵培养液洗下10支斜面菌苔转入装量2L上述发酵培养基的3.7L发酵罐中，发酵初始温度31℃，搅拌转速600r/min，通气量1VVM，罐压0.04Mpa，通过聚醚类或硅酮类消泡剂消泡，通过流加15N标记氨水控制pH6.8；在发酵24小时后，提高转速和通气量保证溶解氧在20～40％饱和度，通过流加15N标记氨水控制pH6.5，流加50％葡萄糖控制发酵液葡萄糖浓度2～5g/dL，发酵时间68小时，发酵平均产L-谷氨酰胺-15N2可达30g/L。
发酵液采用711阴离子交换树脂单柱分离，采用常规方法得到干燥固体L-谷氨酰胺-15N2产品，经质谱分析得到产品丰度98.88％，丰度下降0.323％。
权利要求
1.一种15N稳定性同位素标记L-谷氨酰胺的生产工艺，其特征在于，该工艺包括以下步骤(1)发酵菌株的选择用于L-谷氨酰胺生产的黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)、钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)之一；(2)保藏斜面制备将上述发酵菌株接种于斜面，29～37℃恒温培养8～20小时，得到保藏斜面，冷藏待用；(3)活化斜面制备将步骤(2)得到的保藏斜面接种于活化斜面，培养方法同步骤(2)；(4)发酵培养基的配制以全合成培养基为基本培养基，添加少量有机氮源。主要配方如下表所示说明碳源葡萄糖6～14g/dL或蔗糖12～25g/dL无机氮源氯化铵3～5g/dL或硫酸铵4～8g/dL有机氮源玉米浆、菌体水解液0～0.5mL/dLK2HPO4.3H2O 0.1～0.4g/dLMgSO4.7H2O 0.02～0.08g/dLMnSO4.H2O2～20mg/LFeSO4.7H2O 2～20mg/LZnSO40.5～10mg/LVH 0～10μg/LVB1 50～500μg/LVB6 50～500μg/L泛酸50～500μg/L尼克酸 50～500μg/L对氨基安息香酸 50～300μg/LCaCO32～6g/dL，分消(5)发酵工艺将步骤(3)培养好的活化斜面菌苔用少量培养基洗下后接种于已灭菌的装有步骤(4)所述发酵培养基的发酵摇瓶或发酵罐中开始发酵，摇床发酵控制条件为发酵初始温度30～39℃，初始pH6.4～6.8，摇床转速180～220r/min，发酵中后期提高转速至240～280r/min，发酵时间60～96小时；发酵罐控制条件为发酵初始温度30～39℃，初始pH6.4～6.8，通气量0.5～1.5VVM，罐压0.02～0.05Mpa，溶解氧0.5～90％饱和度，通过聚醚类或硅酮类消泡剂消泡；在发酵中后期，提高转速和通气量保证溶解氧在30～50％饱和度；发酵全过程通过添加15N标记尿素、氨水或液氨调节控制pH在微酸性，pH6.4左右，流加50％葡萄糖控制发酵液葡萄糖浓度2～5g/dL，发酵时间48～72小时；(6)分离提取将步骤(5)培养好的发酵液，通过发酵液预处理得到的上清液采用离子交换法等分部提取得到15N稳定性同位素标记L-谷氨酰胺溶液，通过真空浓缩赶氨并采用活性炭脱色、乙醇低温结晶、真空干燥得到产品。
2.如权利要求1所述的15N稳定性同位素标记L-谷氨酰胺的生产工艺，其特征在于，步骤(1)中所述的黄色短杆菌是指黄色短杆菌(Brevobacteriumflavum)ATCC14067、AS1.495、AS1.582和它们的突变株之一，谷氨酸棒杆菌是指谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13286、ATCC14751、ATCC13032、AS1.805、ACCC11063、IFFI10056、IFFI10052和它们的突变株之一，北京棒杆菌是指北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)AS1.299和其突变株之一，钝齿棒杆菌是指钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)AS1.452和其突变株之一。
3.如权利要求1所述的15N稳定性同位素标记L-谷氨酰胺的生产工艺，其特征在于，步骤(4)中所述的发酵培养基中，玉米浆、菌体水解液有机氮源添加0～0.5mL/dL，使用的有机氮源中氨基氮浓度5～20g/dL，以使其对15N丰度的影响降低到最低限度；通过直接添加VH、VB1、VB6、泛酸、尼克酸、对氨基安息香酸维生素复合物，来促进生长，减少有机氮源的缺乏对菌体生长的影响，同时强化L-谷氨酰胺代谢流。
4.如权利要求1所述的15N稳定性同位素标记L-谷氨酰胺的生产工艺，其特征在于，步骤(5)中所述的溶解氧的控制通过调整搅拌转速、通气量、罐压实现。
5.如权利要求1所述的15N稳定性同位素标记L-谷氨酰胺的生产工艺，其特征在于，步骤(5)中所述的发酵培养中后期通过提高转速或通风，促进L-谷氨酰胺的生成。
6.如权利要求1所述的15N稳定性同位素标记L-谷氨酰胺的生产工艺，其特征在于，步骤(5)中所述的发酵摇瓶通过添加CaCO3控制pH在微酸性，发酵罐上通过流加15N标记尿素、氨水或液氨来控制pH在微酸性。
7.如权利要求1所述的15N稳定性同位素标记L-谷氨酰胺的生产工艺，其特征在于，步骤(5)中所述的发酵罐发酵，通过流加50g/dL葡萄糖溶液控制发酵液中葡萄糖浓度2～5g/dL。
全文摘要
本发明涉及一种
文档编号C12P13/14GK1626666SQ20031010931
公开日2005年6月15日 申请日期2003年12月12日 优先权日2003年12月12日
发明者谭青乔, 吕志贤, 梅丛笑, 杜晓宁, 李良君 申请人:上海化工研究院