专利名称：突变体酵母及使用其的物质生产方法
技术领域：
本发明涉及对野生型酵母进行了使规定基因组成型表达这样的改变的突变体酵 母及使用其的物质生产方法。
背景技术：
使用酵母等生产目标生产物时，制作以能组成型表达的方式导入了与该目标生 产物生物合成相关的基因的突变体酵母，在适当的培养条件下培养突变体酵母，从菌体 内或菌体外回收目标生产物。另外，以乙醇以外的物质作为目标生产物时，优选减少大 量产生的乙醇。到现在为止，为了降低乙醇生产能力，已制作出破坏存在于乙醇生产路 径中的丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等基因的菌株。然而，尤其如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)这种具有葡萄糖效应(Crabtree effect)的菌中，降低乙醇生产量时其繁殖、发酵 能力也大幅度的下降，存在实用性低这样的问题。(非专利文献1: Ishida, N.etal.(2006) Biosci.Biotechnol.Biochem.70，pll48-1153 ；非专利文献 2 Flikweert，M.T.et al. (1996) Yeast 12，p247_257、非专利文献 3 Eri, A.etal. (1998) J.Ferment.Bioeng.86，p284_289 ； 专利文献1:特表2003-500062号公报；专利文献2 特表2001-516584号公报；非专利 文献 4:Skory，C.D. (2003) J.Ind.Microbiol.Biotechnol 30, p22_27)。另外，根据非专利 文献1、非专利文献3以及非专利文献4，即使通过破坏乙醇生产路径的基因而能大幅度 降低乙醇，所降低部分的大部分也未必都变成目标生产物。另一方面，也有通过将乙醇生产路径的阻断限于一部分，并增强目标生产物 的代谢路径，从而提高目标生产物收率的报告(非专利文献5: Saitoh，S (2005) Appl. Environ.Microbiol.71, p2789_2792)，然而，目标生产物的收率虽然得到了提高，但存在 乙醇的降低不充分，发酵速度也稍微下降这样的问题。
专利文献1 特表2003-500062号公报 专利文献1 特表2001-516584号公报
非专利文献1 非专利文献2 非专利文献3 非专利文献4 非专利文献5
Ishida, N.et al. (2006)Biosci.Biotechnol.Biochem.70, pll48_1153 Flikweert, M.T.et al. (1996) Yeast 12，p247-257 Eri, A.et al. (1998) J.Ferment.Bioeng.86, p284_289 Skory，C.D. (2003) J.Ind.Microbiol.Biotechnol 30，p22_27 Saitoh, S (2005) Appl.Environ.Microbiol.71, p2789_279
发明内容
所以，鉴于上述情况，本发明的目的在于提供一种突变体酵母及使用其的物质 生产方法，其在使用酵母生产目标生产物时，能大幅度提高目标生产物的生产率的同时 维持优良的生长速度以及发酵速度。为了达成上述目的，本发明人等进行锐意研究的结果，发现了通过导入与目标 生产物生产相关的基因并组成型表达HAP4基因，能够维持生长速度以及发酵速度的同时大幅度提高该目标生产物的生产率的事实，从而完成了本发明。本发明包括以下内容。(1) 一种突变体酵母，导入了编码与目标生产物的生产相关的酶的外来基因、和 能组成型表达的HAP4基因或其同源基因。上述(1)的突变体酵母优选的是与野生型相比醇生产率降低了的突变体。例 如，通过降低与醇合成相关的酶的酶活性而能降低醇生产率。在此，作为与醇合成相 关的酶可举出丙酮酸脱羧酶和/或醇脱氢酶。作为上述丙酮酸脱羧酶可举出选自PDCl 基因、PDC5基因和PDC6基因中的至少一个基因所编码的酶。作为上述醇脱氢酶，可 举出由ADHl基因所编码的酶。另外，作为上述(1)的突变体酵母优选使用属于酵母 (Saccharomyces)属的酵母，尤其是属于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的菌株的酵 母。另外，上述外来基因可举出编码具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质的基因。(2) —种使用酵母的物质生产方法，包含培养上述的本发明的突变体酵母， 在菌体内外生成目标生产物的工序；和回收上述目标生产物的工序。上述(2)的物质生产方法中，能以有机酸作为目标生产物。而且，特别优选的 是以乳酸作为目标生产物。并且，也能以乙醇以外的醇作为目标生产物。根据本发明，能够提供维持优良的生长速度以及发酵速度的同时还具有优良的 目标生产物生产率的突变体酵母，并且，通过使用本发明的突变体酵母能以低成本生产 目标生产物。本说明书包括作为本申请优先权基础的日本专利申请2008-113053号的说明书 和/或附图所记载的内容。
图1为表示构建LDH基因导入/PDCl基因破坏用DNA片段的流程的示意图。图2为表示构建PDC5基因破坏用DNA片段的流程的示意图。图3为表示构建HAP4基因过度表达用DNA片段的流程的示意图。图4为表示对于LDH基因导入/PDCl基因破坏株的、HAP4导入株以及HAP4 非导入株的发酵试验的结果的特性图。图5为表示对于LDH基因导入/PDCl以及PDC5基因破坏株的、HAP4导入株 以及HAP4非导入株的发酵试验的结果的特性图。
具体实施例方式下面详细说明本发明。本发明的突变体酵母导入了编码与目标生产物的生产相关的酶的外来基因、 和能组成型表达的HAP4基因或其同源基因。在此，HAP4基因是编码构成被半活性 化、葡萄糖抑制的Hap2p/3p/4p/5p CCAAT-结合性复合体的亚基的HAP4蛋白质。 已知该复合体具有各种各样的基因转录促进活性。在Gancedo JM(1998)Yeast carbon cataboliterepression.Microbiol.Mol.Biol.Rev.62 (2)，p334-61 中尤其对 HAP4 蛋白质以及上 述复合体进行了详细叙述。HAP4基因中的编码区域的碱基序列以及HAP4蛋白质的氨基酸序列分别表示于序列号1以及2。其中，作为以组成型表达的方式导入的HAP4基因并不限定于编码含序 列号2所示的氨基酸序列的蛋白质的基因，也可以编码包含相对于序列号2所示的氨基酸 序列，例如具有70%以上、优选80%以上、更优选90%以上、进一步优选95%以上、最 优选97%以上的同源性的氨基酸序列的、形成上述复合体并表现转录促进活性的蛋白质 的基因。在此，同源性是指使用收纳了安装有blast算法的计算机程序以及基因序列信息 的数据库，通过设定值(Default)的设定而求出的值。另夕卜，作为HAP4基因也可以是编码含序列号2所示的氨基酸序列中1或多个 (例如2 60个、优选2 50个、更优选2 40个、进一步优选2 30个、最优选2 15个)氨基酸缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列的、形成上述复合体并表现转录促 进活性的蛋白质的基因。进而，作为HAP4基因并不限定于含序列号1所示的碱基序列的基因，也可以是 对于由与序列号1所示的碱基序列互补的碱基序列构成的聚核苷酸的全部或连续的一部 分，在严格条件下杂交，编码形成上述复合体并表现转录促进活性的蛋白质的基因。在 此，严格条件下是指形成所谓的特异性杂交物，不形成非特异性杂交物的条件。例如， 可举出45°C、6XSSC(氯化钠/柠檬酸钠)下的杂交、其后的50 65°C、0.2 1XSSC、 0.1% SDS下的洗净，或者，作为这种条件还可以举出65 70°C、IX SSC下的杂交、其 后的 65 70°C、0.3XSSC 下的洗净。杂交能够以 J.Sambrooket al.Molecular Cloning，A Laboratory Manual, 2nd Ed.，Cold SpringHarbor Laboratory (1989)所记载的方法等现有公 知方法进行。其中，如上所述的具有规定的同源性的氨基酸序列、具有氨基酸的缺失、取代 或添加的氨基酸序列等可通过对具有编码含序列号2所示的氨基酸序列蛋白质的碱基序 列(例如，序列号1所示的碱基序列)的聚核苷酸，以该技术领域公知的手法进行改变 而进行。另外，对于由与序列号1所示的碱基序列互补的碱基序列构成的聚核苷酸的全 部或连续的一部分，在严格条件下杂交的聚核苷酸，同样可通过将具有序列号1所示的 碱基序列的聚核苷酸，以该技术领域公知的手法进行改变而进行。向碱基序列导入变异 时可通过Kunkel法或Gapped duplex法等的公知手法或以其为基准的方法进行，例如使 用利用定点突变诱导法的变异导入用试剂盒(例如Mutant-K、Mutant-G(均为商品名、 TAKARA Bio公司制))等，或者使用LA PCR in vitro Mutagenesis系列试剂盒(商品名、 TAKARA Bio公司制)导入变异。另外，作为变异导入方法也可以是使用EMS(乙基甲 烷磺酸盐)、5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤、羟胺、N-甲基-N’ -硝基-N亚硝基胍、其他 的以致癌性化合物为代表的化学诱变剂的方法，也可以是利用X射线、阿尔法射线、贝 塔射线、伽马射线、离子束为代表的放射线处理、紫外线处理的方法。另外，对于某蛋白质是否形成上述复合体并具有转录促进活性，例如可通过利 用 David S.McNabb 等、Eukaryotic Cell，November 2005，p.1829-1839, Vol.4, No.ll 所 公开的实验系进行确认。即，该文献中记载有通过构建Hap2p/Hap3p/Hap5p杂合三聚体 之后起到Hap4蛋白质作用而形成上述复合体的同时表现上述转录促进活性。因此，利用 该文献所记载的实验系，可容易地考察某蛋白质是否具有与HAP4蛋白质同等的功能。而且，上述的HAP4基因可通过现有公知的手法从酿酒酵母分离使用。并 且，本发明中，代替上述的HAP4基因也可以使用HAP4基因的同源基因。作为
5HAP4基因的同源基因可举出乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)来源HAP4同源 基因(参照 Bourgarel，D.et al.，1999.Mol.Microbiol.31 1205-1215)以及汉逊酵母 (Hansenulapolymorpha)来源HAP4 同源基因(参照 Sybirna，K.etal.，2005.Curr.Genet.47
172-181)。这些HAP4同源基因的碱基序列以及该基因编码的HAP4同源蛋白质的氨基 酸序列可以从Genbank等的公知数据库获取。对于以上说明的HAP4基因或其同源基因在宿主内的组成型表达，例如可举出 利用组成型表达启动子的方法。即，可以采用在组成型表达启动子的控制下构建配置了 HAP4基因或其同源基因的表达载体，使用该表达载体将宿主转化的方法。在此，组成型 表达启动子是具有与宿主细胞的生长条件无关联地表达下游基因的功能的启动子。对于 组成型表达启动子，可无特别限定地使用，根据宿主细胞的种类或所控制基因的种类等 适宜选择即可。例如，作为酿酒酵母中的组成型表达启动子可举出ADHl启动子、HIS3 启动子、TDH3启动子、CYC3启动子、CUPl启动子以及HOR7启动子等。其中，含上述的组成型表达启动子和HAP4基因或其同源基因的表达载体被导 入于宿主时还可以具有调整HAP4基因或其同源基因表达的其他序列，具体有操纵基 因、增强子、沉默子、核糖体结合序列、终止子等。在此，作为用于将HAP4基因或其同源基因以组成型表达的方式导入的宿主， 只要是酵母就无特别的限定。作为可用作宿主的酵母例如可举出子囊菌门(Ascomycota) 的子囊菌酵母、担子菌门(Basidiomycota)的担子菌酵母、或不完全菌纲(Fungi Imperfecti)的不完全菌酵母。优选为子囊菌酵母、尤其使用作为出芽酵母的酿酒酵母、 产朊假丝酵母(Candidautilis)或毕赤酵母(Pichiapastris)等、作为裂殖酵母的粟酒裂殖酵 母(Shizosaccharomycespombe)等。另外，作为宿主可以使用乳酸克鲁维酵母以及汉逊 酵母。另外，作为宿主使用的酵母特优选为使用醇生产率降低了的突变株。在此，醇 生产率降低了是指与野生型酵母相比、醇生产率显著降低了的意思。例如，可通过以降 低与醇合成相关的酶的酶活性的方式对野生型酵母导入变异，从而降低醇生产率。作为 与醇合成相关的酶可举出丙酮酸脱羧酶以及醇脱氢酶。这些丙酮酸脱羧酶以及醇脱氢酶 中，通过降低其一或两个酶活性而能降低醇生产率。作为编码酿酒酵母来源丙酮酸脱羧 酶的基因可举出PDCl基因、PDC5基因以及PDC6基因。作为编码酿酒酵母来源醇脱氢 酶的基因可举出ADHl基因。通过使这些基因中的1个或多个基因缺损而能降低醇生产率。其中，作为基 因的缺损方法无特别的限定，可举出使该基因缺失的方法、向该基因导入变异而表达非 活性型酶的方法、使该基因的表达调节区域(例如启动子)缺失或变异的方法。另外， 基因的缺损方法还包括在宿主细胞内表达该基因的siRNA(small interfering RNA)、反义 RNA,核酶的方法。另外，本发明的突变体酵母具有编码与目标生产物的生产相关的酶的外来基 因，能用于生产该目标生产物。作为目标生产物只要是能够以酵母生物合成的物质则无 特别的限定，例如可举出乳酸、丙烯酸、乙酸、丙酮酸、3-羟丙酸、富马酸、琥珀酸、 衣康酸、乙酰丙酸、己二酸、抗坏血酸以及柠檬酸等的有机酸以及1-丙醇、2-丙醇、 1-丁醇、异丁醇、2-甲基-1-丁醇以及3-甲基-1-丁醇等的醇。
6
其中，以乳酸为目标生产物时，作为外来基因可举出与乳酸合成相关的乳酸脱 氢酶(LDH)基因。换言之，通过以LDH基因作为外来基因进行导入而对突变体酵母 赋予乳酸生产能力。作为LDH根据生物的种类或者在生物体内存在各种同族体。作 为本发明中所使用的LDH除了天然来源LDH以外还包括化学合成或者基因工程学人 工合成的LDH。作为LDH优选为瑞士乳杆菌株(Lactobacillus helveticusK)、益生菌 (Lactobacillus casei)、热克鲁维酵母(Kluyveromyces · thermotolerans)、德尔布有孢酵母 (Torulaspora · delbraeckii)、粟酒裂殖酵母、米根霉(Rhizopusoryzae)等的原核生物或者 霉菌等的真核生物来源，更优选为植物、动物、昆虫等的高等真核生物来源。例如，优 选使用牛来源LDH (L-LDH)。通过将这些基因导入上述的酵母而能向该微生物赋予乳酸 生成能力。另外，上述的外来基因可以是在组成型表达启动子的控制下导入的，也可以是 在表达诱导型启动子的控制下导入的。其中，上述的外来基因无需在含Hap2p/3p/4p/5p CCAAT-结合性复合体识别而结合的CCAAT共有序列的启动子的控制下导入。根据本发明的突变体酵母，由于组成型表达HAP4基因或其同源基因，所以大 幅度提高目标生产物的生产率。尤其是降低了醇生产率的突变体酵母中通过组成型表达 HAP4基因或其同源基因而能不导致生长速度以及发酵速度的降低就能够提高目标生产物 的生产率。如此，通过利用本发明的突变体酵母而能大幅度提高目标生产物的收率，能 显著削减目标生产物的生产成本。实施例下面使用实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明的技术范围并不被以下 的实施例所限定。〔实施例1〕LDH基因导入/PDCl基因破坏用DNA片段的制作首先，对成为宿主的酵母导入乳酸脱氢酶(LDH)基因作为外来基因的同时，制 作了用于破坏与醇合成相关的丙酮酸合成酶基因(PDC1基因)的DNA片段。具体为，以特开2003-259878号公报所公开的质粒pBTrp-PDCl-LDHKCB为模 板，将融合了 PDCl启动子、LDH基因以及TDH3终止子的DNA片段，以PCR进行扩 增。该 PCR 中作为引物使用了 TB215(5' -GAAACAGCTATGACCATGATTACG-3‘ 序列号 3)和 TB1497 (5 ‘ -AAGCTCTTAAAACGGGAATTCCCCTAAGAAACCAT-3 ‘序 列号4)(参照图1)。另一方面，以质粒pRS403(可从ATCC获取)为模板，扩增HIS3基因。该 PCR 中作为引物使用了 TB1421 (5' -ATGGTTTCTTAGGGGAATTCCCGTTTTAAGAGCT T-3'序列号 5)禾口 TB422(5' -GACCAAGTTAGCTGGTCGAGTTCAAGAGAAAAAAA AAG-3'序列号 6)。另外，以上述pBTrp-PDCl-LDHKCB为模板，对PDCl基因的下游区域DNA 片段以PCR进行了扩增。该PCR中作为引物使用了 TB1147(5' -CCAGCTAACTTGGT CGACTTG-3 ‘序列号 7)和 TBO 19(5' -GCGCGTAATACGACTCACTAT-3 ‘序列号8)。以如上扩增的3种类的PCR产物为模板，利用Shevchuk，N.Α.等的方法(Shevchuk, N.A.et al. (2004) Construction of long DNA moleculesusing long PCR-based fusion of several fragments simultaneously.Nucleic Acids Research 32 (2) el9),结合 3 禾中类 的 PCR产物。该 PCR 中作为引物使用了 TB151(5' -CCTATCTCTAAACTTCAACACC-3'序列号 9)和 TB152(5' -TCAGCAATAGTGGTCAACAACT-3‘序列号 10)。其
中，所得DNA片段含有PDCl启动子、LDH基因以及TDH3终止子以该顺序融合的区 域、和作为选择标记的LEU2基因、以及作为重组用区域的PDCl基因的下游区域。以 下、将该DNA片段称为「LDH基因导入/PDCl基因破坏用DNA片段」。PDC5基因破坏用DNA片段的制作另外，本实施例中制造了用于破坏PDC5基因的DNA片段。具体是以酿酒酵母 BY4742株(Invitrogen社)的基因组DNA为模板，分别将PDC5基因的5 ‘上游非翻译区 域DNA片段和3'下游非翻译区域DNA片段以PCR进行了扩增(参照图2)。使用的 PCR 用引物为，前者是 TB604(5' -TTCGCATCTAAGGGGTGGTG-3 ‘序列号 11)和 TB607(5' -GCGTGTACGCATGTAACTTTGTTCTTCTTGTTATT-3'序列号 12)，后者 是 TB599(5' -CTAACATTCAACGCTAGACGGTTCTCTACAATTGA-3'序列号 13)和 TB501(5' -TAAGAAGGCATGTTGGCCTCTGT-3‘序列号 14)。另外，以特开2003-259878号公报公开的质粒ρΒΗΡΗ_ΡΤ为模板，将潮霉素抗 性基因的表达盒以PCR进行了扩增。使用的PCR用引物为ΤΒ606 (5 ‘ -AATAACAAGA AGAACAAAGTTACATGCGTACACGC-3 ‘序列号 15)和 ΤΒ598 (5 ‘ -TCAATTGTAGA GAACCGTCTAGCGTTGAATGTTAG-3 ‘序列号 16)。以如上扩增的3种PCR产物为模板，利用上述的Shevchuk， N.A.等的方法，结合了 3种类的PCR产物。该PCR中作为引物使用了 TB070(5' -GGAGACCCACTGTACAAC-3 ‘序列号 17)禾口 TB210 (5 ‘ -GCAGCTGAA AGATAATAAGGTATG-3 ‘序列号18)。以下将该DNA片段称为「PDC5基因破坏用 DNA片段」。HAP4基因过度表达用DNA片段的制作另外，本实施例中制作了用于将酿酒酵母来源HAP4基因过度表达的DNA片 段。具体是以酿酒酵母BY4742株的基因组DNA为模板，将含PDC6基因的一部分和其 5'上游非翻译区域的DNA片段、含HAP4基因和其终止子区域的DNA片段、含TDH2 启动子区域的DNA片段、含CTTl基因的5'上游非翻译区域的DNA片段，以PCR进 行了扩增(参照图3)。使用的PCR用弓丨物分别为TB1021 (5 ‘ -CCTTGATGCGTGCGTA ACC-3 ‘序列号 19)禾口 TB910(5' -AAACGCGTGTACGCATGTAATCTCATAAACCTAT GCACTG-3 ‘序列号 20)、TB911(5' -TCATATTCGACGATGTCGTCCGAACTACAGT TATCGCCTC-3 ‘:序列号 21)和 TB679(5' -CACACAAACAAACAAAACAAAATGACC GCAAAGACTTTTCTAC-3 ‘序列号 22)、TB680(5' -GTAGAAAAGTCTTTGCGGTCA TTTTGTTTTGTTTGTTTGTGTG-3 ‘序列号 23)禾口 TB900 (5 ‘ -ATATATCTGCAGGGAT CCCTTGACGGGTATTCTGA-3 ‘序列号 24)、TB899(5' -TCAGAATACCCGTCAAGG GATCCCTGCAGATATAT-3 ‘序列号 25)和 TB349 (5 ‘ -CCATATTTTCGTTAGGTCATT T-3'序列号26)。另外，以特开2003-259878号公报所公开的质粒pBble-LDHKCB为模板，将腐草霉素表达盒以PCR进行了扩增。使用的PCR用引物为TB909 (5 ‘ -CAGTGCATAGGT TTATGAGATTACATGCGTACACGCGTTT-3 ‘序列号 27)和 TB912 (5 ‘ -GAGGCGATA ACTGTAGTTCGGACGACATCGTCGAATATGA-3'序列号 28)。以含如上扩增的PDC6基因的一部分和其5'上游非翻译区域的PCR产物、腐 草霉素表达盒为模板，利用上述的Shevchuk，N.A.等的方法以PCR进行了结合。使 用的 PCR 用引物为 TB315 (5 ‘ -ACCAGCCCATCTCAATCCATCT-3 ‘序列号 29)和 TB912。另外，以含如上扩增的HAP4基因和其终止子区域的PCR产物、含TDH2启动 子区域的PCR产物以及含CTTl基因的5'上游非翻译区域的PCR产物为模板，同样以 PCR 进行 了 结合。使用的 PCR 用引物为 TB911 和 TB316 (5 ‘ -AGCGTATGGGTGATGA GAGTAC-3'序列号 30)。然后，进一步将如上结合的2个片段的DNA为模板，同样以PCR进行了结合。 该 PCR 中作为引物使用了 TB948(5' -GTTGAAGTCGCCTGGTAGCC-3‘序列号 31) 和 TB734(5' -TGTCCAGGCTACGTCGAATC-3 ‘序列号 32)。将最终获得的 DNA 片 段称为“HAP4基因过度表达用DNA片段”。LDH基因导入/PDCl基因破坏株的制作使用Frozen-EZ Yeast Transformation II 试剂盒(ZYMORESEARCH 公司制)， 将上述LDH基因导入/PDCl基因破坏用DNA片段导入于BY4742株进行了转化。该转 化是按照试剂盒所附带的操作指南进行的。转化后、在亮氨酸选择性培养基(SD-Leu)板 上播种，在30°C下培养3天，选取转化体。由转化体调制基因组DNA，以PCR法确认 了 LDH基因导入/PDCl基因破坏用DNA片段整合到染色体。该PCR中作为位于LDH 基因导入/PDCl基因破坏用DNA片段的外侧的引物使用了 TB324 (5 ‘ -CTCATACATGTT TCATGAGGGT-3 ‘序列号 33)和 TB304(5' -ACACCCAATCTTTCACCCATCA-3 ‘ 序列号34)。其结果、破坏了 BY4742株中的PDCl基因，确认到了 LDH基因整合到染 色体中。以下，将该转化酵母称为“LDH基因导入/PDCl基因破坏株”。LDH基因导入/PDCl以及PDC5基因破坏株的制作接着，使用PDC5基因破坏用DNA片段，对LDH基因导入/PDCl基因破坏株 进行了转化。其中，转化方法与上述相同。转化后，向200 μ g/ml的含潮霉素的YPD 培养基板播种，在30°C下培养3天，选取转化体。由转化体调制基因组DNA，以PCR 法确认了 PDC5基因破坏用DNA片段整合到染色体中。该PCR中作为位于PDC5基因 破坏用DNA片段的外侧的引物使用了 TB077 (5 ‘ -GGAACCCATAGATGAAGAGG-3 ‘ 序列号35)和作为位于PDC5基因破坏用DNA片段内部的引物使用了 TB434(5' -ATCC GCTCTAACCGAAAAGG-3 ‘序列号36)。其结果，确认到LDH基因导入/PDCl基因 破坏株中的PDC5基因被破坏。以下、将该转化酵母称为“LDH基因导入/PDCl以及 PDC5基因破坏株”。HAP4基因导入株的制作接着，使用上述的HAP4基因过度表达用DNA片段，对上述LDH基因导入/ PDCl基因破坏株以及LDH基因导入/PDCl以及PDC5基因破坏株进行了转化。其中， 转化方法与上述相同。转化后，向100 μ g/ml的含腐草霉素YPD培养基板播种，30°C下 培养3-5天，选取转化体。由转化体调制基因组DNA，以PCR法确认HAP4基因过度表达用DNA片段整合到染色体。该PCR使用了作为位于HAP4基因过度表达用DNA片段 外侧的引物TB315和作为位于HAP4基因过度表达用DNA片段内部的引物TB1020 (5 ‘-TCCTGCGCCTGATACAGAAC-3 ‘序列号37)。其结果、确认到LDH基因导入/PDCl 基因破坏株以及LDH基因导入/PDCl以及PDC5基因破坏株的染色体中已导入了 HAP4 基因过度表达用DNA片段。增殖试骑对导入了如上制作的LDH基因导入/PDCl基因破坏株(本项中为HAP4非导入 株)以及HAP4基因过度表达用DNA片段的LDH基因导入/PDCl基因破坏株(本项中 为HAP4导入株)进行了比增殖速度的计算。具体为注入了 YPD(酵母提取物1%、蛋白 胨2%以及葡萄糖2%)液体培养基IOOml的500ml容积带挡板烧瓶中植菌测定株，30°C、 120rpm(振幅35mm)下15 20小时振荡培养后，在菌体浓度0.7 1.0%的状态下进行 了收集。再次以相同条件下将测定株以菌体浓度0.01%的浓度进行植菌，增殖开始后约 每2小时采样测定菌体浓度。比增殖速度是在增殖开始2 10小时之间，确认对数增殖 期，以下式算出的。[数学式1]
权利要求
1.一种突变体酵母，其特征在于，导入编码与目标生产物的生产相关的酶的外来基 因、和能组成型表达的HAP4基因或其同源基因。
2.根据权利要求1所述的突变体酵母，其特征在于，与野生型相比醇生产率降低了的 突变株。
3.根据权利要求1或2所述的突变体酵母，其特征在于，与醇合成相关的酶的酶活性 降低了。
4.根据权利要求3所述的突变体酵母，其特征在于，所述与醇合成相关的酶是丙酮酸 脱羧酶和/或醇脱氢酶。
5.根据权利要求4所述的突变体酵母，其特征在于，所述丙酮酸脱羧酶是由选自 PDCl基因、PDC5基因和PDC6基因中的至少一个基因编码的。
6.根据权利要求4所述的突变体酵母，其特征在于，所述醇脱氢酶是由ADHl基因编 码的。
7.根据权利要求1 6中任一项所述的突变体酵母，其特征在于，属于酵母属。
8.根据权利要求1 6中任一项所述的突变体酵母，其特征在于，属于酿酒酵母的菌种。
9.根据权利要求1 8中任一项所述的突变体酵母，其特征在于，所述外来基因是编 码具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质的基因。
10.—种使用酵母的物质生产方法，其特征在于，包含培养权利要求1 8中任一项所述的突变体酵母，在菌体内外生成目标生产物的工 序；禾口回收所述目标生产物的工序。
11.根据权利要求10所述的物质生产方法，其特征在于，所述目标生产物是有机酸。
12.根据权利要求10所述的物质生产方法，其特征在于，所述目标生产物是乳酸。
13.根据权利要求10所述的物质生产方法，其特征在于，所述目标生产物是乙醇以外的醇。
全文摘要
根据本发明，使用酵母生产目标生产物时，能够维持优良的生长速度以及发酵速度的同时还具有优良的目标生产物生产率。对于成为宿主导入编码目标生产物生产相关酶的外来基因、和能组成型表达的HAP4基因或其同源基因。突变体酵母优选的是与野生型相比降低了醇生产率的突变体。
文档编号C12N15/00GK102016024SQ20098011416
公开日2011年4月13日 申请日期2009年4月23日 优先权日2008年4月23日
发明者保谷典子, 多田宣纪, 大西彻, 嶋村隆, 松下响, 石田亘广 申请人:丰田自动车株式会社