专利名称：：一种酵母菌株,制备方法及其相关应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种酵母菌株及其制备方法，以及该酵母菌株的生物学培养物，组合物，以及一种酮基选择性还原的方法，尤其涉及一种对酮基立体选择性还原的酵母菌株及其制备方法，以及该酵母菌株的细胞培养物，组合物及其在对酮基立体选择性还原方法中的应用。
背景技术：
：目前，酮基还原通常采用两种主要方式化学法和生物催化还原法。1.化学技术目前，酮基还原催化加氢常用化学技术有三种方法A)直接加氢，B)铁粉还原，和C)硼氢化钠、硼氢化钾等作为还原剂还原。这些化学方法在生产安全性、环保性、立体专一性方面存在一些弊端。化学方法生产安全性方面的弊端有1)直接加氢往往需要高压条件，对设备、设施有较高要求，需要增加耐高压和防爆装置；2)硼氢化钠、硼氢化钾等作为还原剂进行还原时，硼氢化钠等还原物质极易爆炸，不仅存在很大安全隐患，同时对设施和设备要求高，生产车间需要合理布置，同时需要防爆等装置。生产环保性方面的弊端在于铁粉还原是最原始的方法，反应后废弃液污染很严重。立体专一性方面的弊端在于如果作用的底物是一个比较复杂的结构、或者拥有多个功能基团(或官能团)、或者对立体专一性要求高的物质，那么常规的还原加氢方法就显得力不从心，必须要选择高立体选择性的生物催化方法。2.生物催化还原技术针对结构比较复杂、或者拥有多个功能基团(或官能团)、或者对立体专一性要求高的底物，要进行安全、环保生产，迫切需要找到一种更适合特定物质手性还原加氢的方法，而利用生物细胞本身酶催化进行的生物催化就是目前手性还原最好的办法之一。生物催化方法进行加氢还原主要通过微生物全细胞和纯酶两种催化方式进行。全细胞的催化利用细胞内的手性识别环境和胞内相应的酶反应完成特定物质的手性还原。不同的底物需要筛选合适的微生物细胞。如今用在还原催化研究的菌种涉及到放线菌属、芽孢杆菌属、短杆菌属、假单胞菌属、红球菌属、链霉菌属、黄单胞菌属、曲霉属、假丝酵母属、汉逊酵母属、红酵母属、酵母属、根霉属、木霉属等。菌种来源有自然界筛选、诱变筛选、遗传育种筛选、基因工程育种筛选。其中应用于工业化大生产的菌株大多数都是天然菌株经过诱变筛选得到的，这种菌种比基因工程菌要稳定。酵母细胞生物还原的机理如下以酵母细胞中存在的氧化还原酶系作为手性合成催化剂，在合适的反应条件下在酵母胞内将酮基化合物催化还原成含有手性C原子具有光学活性的手性产物，同时在氧化还原过程中需要辅酶(NADH、NADPH)参与。在进行酵母全细胞催化过程中通过添加廉价的C源，利用细胞自身的代谢活动产生还原过程中需要的价格3昂贵的辅酶(NADH、NADPH)。利用酵母的手性识别对酮基进行立体选择性还原，可以得到不同手性的底物。在制药工业中的主要生物催化如下1)酮基的立体选择性还原；2)扁桃酸系列化合物的合成；3)外消旋2_辛醇的不对称转化；4)维生素A脂肪酸酯的合成；5)异麦芽酮糖醇的合成；以及6)腺苷甲硫氨酸的合成。采用现有化学方法立体选择性地还原一些特定结构底物，不仅在立体选择性方面达不到要求，在设备投入、基础设施建设等方面投入较大，而且存在很大的安全隐患。针对现有的酵母还原技术，大多数现有技术都是采用动态细胞培养法，而不是静态细胞催化。动态细胞培养法要求酵母细胞的培养和酮基还原同时进行，在细胞培养过程中进行酮基还原的生物催化反应。酵母的细胞培养需要专门的发酵技术、发酵设备和相应设施，一般的化工企业不可能实现工业化酵母生产和催化反应。另外在培养过程中涉及复杂的培养基成分和各种代谢中间产物，导致产物分离过程复杂困难。静态细胞催化则是酵母细胞的培养生长和酮基还原两步分开进行的，先进行酵母细胞的培养，制备催化用酵母。然后用该细胞在特定反应液中进行酮基立体选择性还原的生物催化反应。这种静态催化方式方便工业催化用户使用，同时反应液成分简单，杂质少，有利于产物的分离纯化。动态细胞培养，需要化工企业掌握生物发酵技术和相应设备投资，培养后反应液组分复杂，增加下游提取难度和成本，工业规模不可能采用，而静态细胞催化操作方便，重复性好，另外减少副产物的产生，工业化规模催化基本采用静态细胞催化法，但这种催化方式需要专业公司生产酵母细胞催化剂。由于跨行业，要化工企业进行生物催化剂产品的生产非常不现实，这就需要专门的生物催化剂公司为化工企业提供稳定、能够工业化规模生产的催化剂产品。针对同一底物的酮基立体选择性还原有很多文献报道，不同属菌种作用的效果不同，目前只有酵母细胞和芽孢杆菌的工业化生产比较成熟，所以一些效果相对较好的菌种也只能小规模培养用于学术研究，离工业化菌体生产还有一段距离。另外一些关于酮基立体选择性还原的现有技术都泛泛而谈，只是初略地涉及到酵母菌株，而并没有具体披露具有这种功能的菌株种类以及将其工业化生产的具体步骤。针对以上情况，为了解决现有技术的缺点，本申请人针对特定底物进行了菌种筛选，优化筛选目的菌株的生产工艺，优化生产和制备还原催化用酵母产品，并对产品进行应用工艺研究，实现手性还原的工业化应用。
发明内容本发明的技术方案大体是酵母菌株通过诱变，筛选到适合酮基立体选择性还原的目的菌株，这种菌株经过工业化生产工艺，可以制备出酮基立体选择性还原用酵母生物催化产品，利用本发明可以大规模地生产酵母生物催化产品并可以进行工业规模的酮基立体选择性还原应用。本发明一方面提供了一种用于酮基立体选择性还原的酵母菌株，所述菌株选自由以下酵母菌株组成的组酵母菌株l，属于酿酒酵母(Z1.8)，保藏编号CCTCCNO:M207174;酵母菌株2，属于粘红酵母(Z6.2)，保藏编号CCTCCNO:M208092;酵母菌株3，属于产朊假丝酵母(Z3.l)，保藏编号CCTCCNO:M208090;酵母菌株4，属于异常汉逊氏酵母(Z4.l)，保藏编号CCTCCNO:M208091。本发明的另一方面提供了由本发明提供的酵母菌株所获得的生物学培养物。本发明的又一方面提供了一种酵母全细胞制备物，由本发明提供的酵母菌株经过以下步骤制备A)多次培养；B)发酵；C)分离，经过进一步加工制得鲜酵母，鲜酵母全细胞制备物水份含量在60-80%。本发明还涉及一种干酵母，由所述酵母菌株全细胞制备物进一步经过以下步骤D)干燥而制备。本发明所提供的干酵母，其特征在于，干酵母水份含量在4%8%。本发明的另一方面涉及本发明所提供的酵母菌株、酵母菌株培养物或其全细胞制备物在对酮基化合物中的酮基立体选择性还原中的应用。为了简化，在下文中将酵母菌株、酵母菌株培养物或其全细胞制备物统一称为酵母产品。在本发明所提供的应用中，所作用的酮基化合物可以是具有通式R^OI^的化合物，其中&和R2独立地代表甲基、乙基、直链烷基、苯基、苯磺酰基、或酯基，优选的酮基化合物为4-氯-乙酰乙酸乙酯、2_辛酮、1-苯基-1，2-丙酮、或1-氯-3-苯磺酰基-2-丙酮。本发明还提供了一种酵母组合物，其包括A)本发明所提供的酵母产品；B)微量铵盐，其中基于所述的酵母产品的重量，所述铵盐的含量在0.2-2.0wt%。本发明的另一方面涉及所提供的酵母组合物在对酮基化合物中的酮基立体选择性还原中的应用。本发明的还一个方面涉及一种对酮基化合物中的酮基立体选择性还原的方法，其特征在于，采用本发明所提供的酵母菌株作为催化剂来进行还原。在本发明提供的方法中，所作用的酮基化合物可以是具有通式RfOI^的化合物，其中&和R2独立地代表甲基、乙基、直链烷基、苯基、苯磺酰基、或酯基，优选的酮基化合物选自4-氯-乙酰乙酸乙酯、2-辛酮、1-苯基-1，2-丙酮、1-氯-3-苯磺酰基-2-丙酮。本发明所得到的有益效果主要有以下几点1)筛选得到的酵母菌株的催化特性优于现有酵母产品；2)通过酵母菌种工业化大生产实现酮基手性还原工业应用；3)通过添加微量盐提高催化效率。本发明酵母的保藏信息酵母菌株l，属于酿酒酵母，拉丁学名Saccharomycescerevisiae，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期2007-11-8，保藏编号CCTCCN0:M207174。酵母菌株2，属于粘红酵母，拉丁学名Torulopsiscandida，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期2008-6-16，保藏编号CCTCCN0:M208092。5酵母菌株3，属于产朊假丝酵母，拉丁学名Candidautilis，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期:2008-6-16，保藏编号CCTCCNO:M208090。酵母菌株4，属于异常汉逊氏酵母，拉丁学名Hansenulaanomala，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期2008-6-16，保藏编号CCTCCNO:M208091。具体实施例方式根据本发明的一个方面，涉及对酮基(特别是4-氯-乙酰乙酸乙酯)还原立体选择性高的酵母菌株。通过传统紫外诱变方法筛选得到一系列酮基(特别是4-氯_乙酰乙酸乙酯)还原立体选择性高的酵母菌株。通过筛选，得到了四种对酮基还原立体选择性较高的酵母菌株，它们的保藏号码分别是CCTCCM207174、M208090、M208091、M208092。I.真菌学性质本发明酵母的真菌学性质如下表所示。表1-1本发明酿酒酵母CCTCCM207174的真菌学性质(I)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本发明的红酵母CCTCCM208092具有上述真菌学性质，与《Theyeasts，ATaxonomicStudy》(酵母，分类学研究)(1998年，荷兰，LodderJ主编，第4版)比较，结果确定上述菌株属于粘红酵母属。表3-1本发明产朊假丝酵母CCTCCM208090的真菌学性质(I)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表3-2本发明产朊假丝酵母CCTCCM208090的真菌学性质(II)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>本发明的产朊假丝酵母CCTCCM208090具有上述真菌学性质，与《Theyeasts，ATaxonomicStudy》(酵母，分类学研究)(1998年，荷兰，LodderJ主编，第4版)比较，结果确定上述菌株属于假丝酵母属。表4-1本发明异常汉逊氏酵母CCTCCM208091的真菌学性质(I)营养细胞的形态圆形、椭圆形或腊肠形增殖方式多边芽殖生长情况发酵液面有白色菌醭，培养液混浊，有菌体沉淀于管底。在麦芽汁琼脂斜面上，菌落平坦，乳白色，无光泽，边缘丝状。在加盖玻片马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，能形成发达的树枝状假菌丝。子囊孢子不易产生子囊孢子最适宜生长条件pH4.5-5.5，温度30-32。C，12Brix麦芽汁培养基表4-2本发明异常汉逊氏酵母CCTCCM208091的真菌学性质(II)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>本发明的异常汉逊氏酵母CCTCCM208091具有上述真菌学性质，与《Theyeasts，ATaxonomicStudy》(酵母，分类学研究)(1998年，荷兰，LodderJ主编，第4版)比较，结果确定上述菌株属于异常汉逊氏酵母属。II.培养条件本发明所提供的酵母菌株的培养方法可以采用普通面包酵母中所使用的常规方法，无特殊限制。例如，可以用糖蜜的连续添加方式制造菌体。糖蜜可以用其它同化作用糖蜜代替。还可以加入生长促进剂。将培养获得的酵母收集、洗涤后，脱水，可以得到本发明的鲜酵母(压縮酵母)。酵母的培养方法在本领域是熟知，在此不再赘述。本领域技术人员应理解，本领域熟知的酵母培养方法都可以用在本发明的各酵母菌株的培养中。本发明还通过将上述酵母进行干燥而提供干酵母。本发明的一个方面涉及对酮基(特别是4-氯-乙酰乙酸乙酯，COBE)还原立体选择性高的酵母菌株的生产方法。本发明的紫外诱变过程为先将待诱变酵母菌株在斜面培养基上进行斜面培养(3(TC培养23天)，取斜面菌体，采用生理盐水稀释酵母细胞浓度到1061(f个/mL，取5mL菌悬液于无菌空平皿中，并进行磁力搅拌，在紫外灯(30W，2537A波长)距离2030cm下照射1530s，取处理过的100iiL菌液于50mL新鲜液体种子培养基中，3(TC恒温避光中间培养一天。中间培养液涂布于筛选平板中进行筛选，获得一系列对酮基化合物(特别是4-氯-乙酰乙酸乙酯)还原立体选择性高的酵母菌株。所述斜面培养基(g/L)为20g葡萄糖，20g蛋白胨，10g酵母膏，和20g琼脂，溶解在800mL水中，然后调节pH到6.0，0.lMPa灭菌15min。所述种子培养基(g/L)为20g葡萄糖，20g蛋白胨，和10g酵母膏，溶解在800mL水中，然后调节pH到6.0，0.lMPa灭菌15min。本发明的另一方面涉及由上述酵母菌株获得的培养物。本发明的培养物可以是酵母菌株经过多次培养、发酵、分离洗涤、干燥而成的干酵母，也可以是不经干燥而获得的鲜酵母。本发明的干酵母的制备方法，包括如下步骤由酵母菌株经过多次培养、发酵、分离洗涤、干燥而成。多次培养分别为试管斜面培养、培养瓶液体培养、旁氏罐液体培养、纯培养罐培养和种子罐培养。发酵条件为pH5.56.5、发酵温度2832°C、通氧量0.51.5克02/克酵母X分钟、发酵时间2022小时、酵母浓度170250克/升。补料方式采用指数流加方式，在1520小时后控制葡萄糖浓度不能过高，细胞湿重控制在170250g/L。所述干燥可采用喷雾干燥或低温快速干燥工艺。所述低温快速干燥采用沸腾床进行干燥处理。物料的最高温度不超过35°C，干酵母的水份含量控制在4%8%。具体地说，所述对酮基还原立体选择性高的干酵母的制备方法包括如下步骤首先将菌种置于盛有麦芽汁琼脂的斜面、3(TC培养4050小时，然后在以麦芽汁为培养基在培养瓶中接种、3(TC培养4050小时，再以麦芽汁和糖蜜混合液为培养基在旁氏罐中接种、3(TC培养4050小时，再以糖蜜为培养基在纯培养罐中接种、培养1520小时，再以糖蜜为原料，添加(NH》2S04，磷源以及微量元素为培养基在种子罐中接种、培养2030小时，培养温度为2832"，风量为0.51.5克02/克酵母X分钟，含糖量为0.11克/100毫升，最终酵母浓度为150200克/升，再以糖蜜为主要原料，添加(NH》2S(V磷源以及微量元素为培养基在商品罐中接种培养2022小时，发酵温度为2832t:，ra值为5.56.5，风量为0.51.5克02/克酵母X分钟左右，酵母浓度为170250g/L，再将商品罐的发酵液分离洗涤，用真空转鼓抽滤，然后用滤得的酵母进行造粒，最后用沸腾干燥床进行低温快速干燥，物料的最高温度不超过35t:，干酵母的水份含量控制在4%8%。本发明的干酵母对COBE的催化效率可以达到68%，产物光学纯度达到97%。本发明的另一方面涉及一种酵母组合物，包括A)本发明所提供的酵母产品；B)铵盐，基于所述的酵母产品的重量，含量为0.2_2wt%。本发明组合物中的铵盐优选为(NH4)2S04。本发明发现，微量的(NH》^04可以提高酵母的催化效率。根据本发明的一种具体实施，(NH4)2S04的含量基于100重量份的酵母，为0.22重量份。酵母的还原催化应用本发明的另一方面涉及酮基(特别是4-氯_乙酰乙酸乙酯)立体选择性还原的方法。可以用本发明的酵母进行酮基立体选择性还原的化合物可以是具有以下化学式的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>其中和R2独立地代表甲基、乙基、直链烷基、苯基、苯磺酰基、酯基。例如，可以用本发明的酵母进行酮基立体选择性还原的化合物有4-氯_乙酰乙酸乙酯(COBE)、2-辛酮、1-苯基-1，2-丙酮、1-氯-3-苯磺酰基-2-丙酮。在一种优选的具体实施方式中，本发明的酵母用于4-氯_乙酰乙酸乙酯(COBE)的手性还原，还原反应的条件如下酵母用量为100200g/L，反应温度254(TC，5-20X的蔗糖或者葡萄糖溶液中进行催化反应，催化过程中添加一定量的微量盐(如硫酸铵)，反应在224小时左右完成。反应液离心或者板框过滤得到清液，然后用3倍清液体积的乙酸乙酯进行二次萃取，萃取液旋转蒸发，浓縮液通过气相色谱检测底物C0BE和产物4-氯-3-羟基-丁酸乙酯(CHBE)的含量。实例1将4-氯-乙酰乙酸乙酯(C0BE)3g溶于100mL的10%的蔗糖溶液中，加入本发明提供的酵母CCTCCM207174产品使得其含量为200g/L，按酵母的量的2wt^添加(NH4)2S04盐。反应温度35t:，进行催化反应12小时。将反应液离心得到清液，然后用3倍清液体积的乙酸乙酯进行二次萃取，将萃取液旋转蒸发，通过Agilent公司的6890型号气相色谱检测浓縮液，测得产物(S)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯(CHBE)的含量为68%(Agilent-6890型号气相色谱仪测定)，产物CHBE光学纯度为97%(Agilent-6890型号气相色谱仪，手性柱测定)。实例2将2-辛酮3g溶于100mL的10%的葡萄糖溶液中，加入本发明提供的酵母CCTCCM208092产品使得其含量为200g/L，按酵母量的2wt^添加(朋4)2504盐。反应温度30。C，进行催化反应24小时。将反应液离心得到清液，然后用3倍清液体积的乙酸乙酯进行二次萃取，将萃取液旋转蒸发，通过Agilent公司的6890型号气相色谱检测浓縮液，测得产物(R)-4-辛醇的含量为50%(Agilent-6890型号气相色谱仪测定)，产物光学纯度为97%(Agilent-6890型号气相色谱仪，手性柱测定)。实例3将l-苯基-l，2-丙酮3g溶于100mL的10%的葡萄糖溶液中，加入本发明提供的酵母CCTCCM208090产品使得其含量为200g/L，按酵母的量的2wt^添加(朋4)2504盐。反应温度32t:，进行催化反应12小时。将反应液离心得到清液，然后用3倍清液体积的乙酸乙酯进行二次萃取，将萃取液旋转蒸发，通过Agilent公司的6890型号气相色谱检测浓縮液，测得产物(S)-2-羟基-l-苯基-l-丙酮的含量为77X(Agilent-6890型号气相色谱仪测定)，产物光学纯度为95%(Agilent-6890型号气相色谱仪，手性柱测定)。实例4将1-氯-3-苯磺酰基-2-丙酮3g溶于100mL的10%的葡萄糖溶液中，加入本发明提供的酵母CCTCCM208091产品使得其含量为200g/L，按酵母的量的2wt^添加(NH4)2S04盐。反应温度3(TC，进行催化反应12小时。将反应液离心得到清液，然后用3倍清液体积乙酸乙酯进行二次萃取，将萃取液旋转蒸发，通过Agilent公司的6890型号气相色谱检测浓縮液，测得产物(2R)_1-氯-3-苯磺酰基-2-丙醇的含量为76%(Agilent-6890型号气相色谱仪测定)，产物光学纯度为96%(Agilent-6890型号气相色谱仪，手性柱测定)。比较例1采用购自梅山马利(MAURI)的酵母，其它条件与实施例l相同。反应完毕后，测得产物(S)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯(CHBE)的含量为50%(Agilent-6890型号气相色谱仪测定)，产物CHBE光学纯度为95%(Agilent-6890型号气相色谱仪，手性柱测定)。比较例2采用购自梅山马利(MAURI)的酵母，其它条件与实施例l相同。反应完毕后，测得产物(R)-4-辛醇的含量为40%(Agilent-6890型号气相色谱仪测定)，产物光学纯度为<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>权利要求一种用于酮基立体选择性还原的酵母菌株，其中所述酵母菌株选自由酵母菌株1，酵母菌株2，酵母菌株3和酵母菌株4组成的组，所述酵母菌株1的保藏编号为CCTCCNOM207174，所述酵母菌株2的保藏编号为CCTCCNOM208092，所述酵母菌株3的保藏编号为CCTCCNOM208090，所述酵母菌株4的保藏编号为CCTCCNOM208091。2.由任一种权利要求1所述的酵母菌株获得的生物学培养物。3.—种酵母全细胞制备物，由任一种权利要求1所述的酵母菌株经过以下步骤制备A)多次培养；B)发酵；C)分离，经过进一步加工制得鲜酵母，鲜酵母全细胞制备物水份含量在60-80%。4.根据权利要求3所述的酵母全细胞制备物，其特征在于，所述酵母全细胞制备物为干酵母，干酵母由任一种权利要求l中所述的酵母菌株进一步经过步骤D)干燥而制备。5.根据权利要求4所述的酵母全细胞制备物，其特征在于，所述干酵母全细胞制备物水份含量在4%8%。6.权利要求1-4中任一项所述的酵母菌株、酵母菌株培养物或其全细胞制备物在对酮基化合物中的酮基立体选择性还原中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述酮基化合物是具有通式I^COI^的化合物，其中&和R2独立地代表甲基、乙基、直链烷基、苯基、苯磺酰基、或酯基。8.根据权利要求7所述的应用，所述酮基化合物选自由4-氯-乙酰乙酸乙酯，2-辛酮，1-苯基-1，2-丙酮和1-氯-3-苯磺酰基-2-丙酮组成的组。9.一种酵母组合物，包括A)权利要求1至4中任一项所述的酵母菌株、酵母菌株培养物或其全细胞制备物；B)铵盐，基于所述的酵母菌株、酵母菌株培养物或其全细胞制备物的重量含量在0.2-2wt%。10.根据权利要求9所述的酵母组合物在对酮基化合物中的酮基立体选择性还原中的应用。11.一种对酮基化合物中的酮基立体选择性还原的方法，其特征在于，在反应过程中加入的催化剂选自权利要求1至4中任一项所述的酵母菌株、酵母菌株或其全细胞制备物。12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述酮基化合物是具有通式R^01^的化合物，其中&和R2独立地代表甲基、乙基、直链烷基、苯基、苯磺酰基、或酯基。13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述酮基化合物选自由4-氯-乙酰乙酸乙酯，2-辛酮，1-苯基-1，2-丙酮和1-氯-3-苯磺酰基-2-丙酮组成的组。全文摘要本发明提供了对酮基立体选择性还原的酵母菌株，其制备方法，培养物，组合物及在对酮基立体选择性还原方法中的应用。通过紫外诱变筛选出活性较好的酵母菌株作为本发明的对酮基立体选择性还原的酵母菌株，然后将这些酵母菌株经培养后得到的酵母产物及组合物应用到酮基立体选择性还原中。文档编号C12P7/02GK101760436SQ20081018731公开日2010年6月30日申请日期2008年12月26日优先权日2008年12月26日发明者余华顺,余明华,俞学锋,姚鹃,李知洪,杨海珍,熊茂盛申请人:安琪酵母股份有限公司