专利名称：通过酵母生产非酵母的甾醇的制作方法
技术领域：
本发明涉及在酵母中例如Saccharomyces cerevisiae中生产甾醇,所述甾醇包括7-脱氢胆固醇、25-羟基-7-脱氢胆固醇和25-羟基麦角留醇。本发明还涉及在酵母中催化酵母留醇、胆留_7，24-二烯醇和胆留-5，7，24-三烯醇的24位置上的双键还原；催化麦角甾醇、7-脱氢胆固醇、胆留-8-烯醇和胆留-7-烯醇的25位置上的羟基化的多种酶。本发明还涉及编码胆固醇C25-羟化酶和留醇Λ 24-还原酶的多种核酸以及它们用来生产并羟基化7-脱氢胆固醇或麦角留醇的用途。本发明还涉及这样产生的酵母菌株和制造这些甾醇的方法，所述方法包括培养经转化的酵母细胞和收获产生的留醇(多种)的步骤。
背景技术：
酵母中的留醇途径包括许多步骤。酵母留醇途径的图表在
图14中列出且下面参考它讨论现有技术。US 5，460, 949 (Amoco)教导了用于增加角鲨烯和三烯醇在酵母中中累积的方法和组合物。该方法包括在其中基因ERG5和ERG6被失活的菌株中HMGl (调节该途径的单一的最重要的酶)的截短和过表达。ERG5和ERG6编码两种酶活性，所述两种酶活性区别麦角甾醇(酵母和真菌的主要留醇)生物合成与胆固醇生物合成。这些菌株优选地累积胆甾_5，7，24-三烯醇，其通常是胆固醇生物合成的中间产物。W003/064650 (Lang等人)(US2006/0240508)公开了在酵母中生产7-脱氢胆固醇和/或生物合成中间产物或随后的产物的方法。这里，来自小鼠和人的C-8留醇异构酶、C-5甾醇去饱和酶和甾醇Λ 24-还原酶的基因在其中ERG5和ERG6被失活并且HMGl基因被截短并过表达的酵母菌株中表达。这些酵母能合成7-脱氢胆固醇。W003/064652 (Lang 等人)(US2006/0088903)公开了通过增加羊毛甾醇-C14-脱甲基酶活性(ERGll)，在转基因的酵母中生产酵母留醇和/或生物合成中间产物和/或其随后的产物的方法。WO 2005/121315(Aventis)教导了胆固醇-生产酵母菌株及其用途。来自Arabidopsis thaliana的甾醇Δ 7还原酶基因和人甾醇Δ 24-还原酶基因被引进其中ERG6被失活和在一些情况下ERG5被失活的酵母宿主菌株中。新菌株能生产与其他中间产物混合的胆固醇。US 6，562，609 (Russel等人)教导了经分离人和小鼠胆固醇C25-羟化酶和基因。现有技术关于使用转基因的酵母生产25-羟基维生素原D3或25-羟基维生素原D2没有记载。发明详沭 根据本发明已发现，胆固醇C25-羟化酶(其底物通常是胆固醇)可对7-脱氢胆固醇和麦角留醇起作用，以分别生产25-羟基-7-脱氢胆固醇和25-羟基麦角甾醇。因而，本发明的一个方面是使用脊椎动物胆固醇C25-羟化酶来羟基化7-脱氢胆固醇或麦角留醇以分别生产25-羟基-7-脱氢胆固醇(也被称为25-羟基维生素原D3)或25-羟基麦角留醇(也被称为25-羟基维生素原D2)。胆固醇C25-羟化酶不是天然存在于酵母中的酶；事实上酵母通常不具有使可能在酵母中存在的7-脱氢胆固醇的侧链羟基化的能力。但是，根据本发明，可制得遗传改良的酵母，通过下述方法将胆留_5，7，24-三烯醇转化为25-羟基-7-脱氢胆固醇(25-羟基维生素原D3)提供具有编码胆固醇C25-羟化酶的核酸的酵母并在使得酵母羟基化7-脱氢胆固醇的条件下培养酵母，借以生产25-羟基-7-脱氢胆固醇(25-羟基维生素原D3)。在上述方法中，下述是优选的，酵母已使基因ERG5和ERG6失活且所述酵母还已被提供有编码编码脊椎动物留醇Λ24-还原酶的核酸，所述脊椎动物留醇Λ24-还原酶酶已针对酵母中的表达被优化。还已发现，根据本发明，可制得遗传改良的酵母，通过下述方法将麦角留醇转化为25-羟基麦角甾醇(也称为25-羟基维生素原D2)提供具有编码胆固醇C25-羟化酶的核酸的酵母并在使得酵母羟基化麦角留醇的条件下培养酵母，借以生产25-羟基麦角留醇(25-羟基维生素原D2)。附图简沭在下述图中，使用了这些缩写词TDH3p是TDH3启动子区(来自S. cerevisiae的甘油醛_3_磷酸脱氢酶同工酶3)；Ori-pBR 是来自 E. coll 的 pBR322 的 ColEl 复制起点；bla是在E. coli中赋予氨苄西林抗性的β _内酰胺酶基因；2 μ是携带S. cerevisiae的复制起点的2 μ多拷贝载体的大的片段；PGKlt是PGKl (来自S. cerevisiae的3_磷酸甘油酯激酶)的终止子区；URA3是针对尿嘧啶的S. cerevisiae URA3营养缺陷型标记；Bam HI.Eco RI.Hin dIII、Bgl II,Age I是指对应的限制性酶的限制性位点；在载体上的位点的定位从唯一的Bam HI位点的位置I开始以括号表示。图I :质粒 V51TDH-S24R1 的限制性图谱。S24R-1 是编码来自 Rattus norvegicus的推定甾醇Λ 24-还原酶的合成基因S24R1 ；图2 :质粒V51TDH-S24R2的限制性图谱。S24R-2是编码来自Danio rerio的推定甾醇Λ 24-还原酶的合成基因S24R2。图3 :质粒pFLAde_S24Rl的限制性图谱。S24R1是编码来自R. norvegicus的推定甾醇Λ 24-还原酶的合成基因S24R1 ;ARS_CEN是S. cerevisiae的着丝粒自主复制起点；ADE2 是 S. cerevisiaeADE2 基因。图4 :质粒 V51-C25H1 的限制性图谱。GALp 代表 GALIO-CYCI (Guarente et al.，1982)半乳糖可诱导的启动子区；C25H-1是编码来自Sus scrofa的推定胆固醇C25-羟化酶的合成基因C25H1。图5 :质粒 V51-C25H3 的限制性图谱。GALp 代表 GALIO-CYCI (Guarente et al.，1982)半乳糖可诱导的启动子区；C25H-3是编码来自Canis familiar is的推定胆固醇C25-羟化酶的合成基因C25H3 ；、
用如在实施例8中描述的制得的甾醇提取物，如实施例9中描述的，记录在UV282nm下的所有HPLC图谱。缩写词
C5，7，22，24 =胆甾 5,7,22,24-四烯醇；C5，7，24 =胆甾 5，7，24-三烯醇;C5，7，22 =胆甾 5，7，22_ 三烯醇;C5，7 =胆甾5，7- 二烯醇或7_脱氢胆固醇；250H-C5, 7_Ac = 25-羟基7_脱氢胆固醇乙酸酯；250H-E5，7，22_Ac :25-羟基麦角甾醇乙酸酯；E5，7，22，24 :麦角甾 5，7，22，24-四烯醇；E5，7，22 :麦角甾5，7，22-三烯醇(麦角甾醇)。图6 :来自表达推定甾醇C-24甾醇还原酶的菌株的甾醇提取物的HPLC洗脱图。使用了下述菌株A ERT/V51TDH 对照；BERT/V51TDH-S24R1 ；CERT/V51TDH-S24R2 ；D :ERT/pFLAde-S24Rl。图7 :来自表达推定胆固醇C25-羟化酶的erg6突变体的留醇提取物的HPLC洗脱图。使用了下述菌株CERT/pFLAde-S24Rl/V51 ；DERT/pFLAde-S24Rl/V51-C25Hl ；EERT/pFLAde-S24Rl/V51-C25H3.标准物为A,胆甾5,7-二烯醇(7-脱氢胆固醇,购自Sigma-Aldrich, St. Louis,MO 63103，USA) ;B，25_羟基7-脱氢胆固醇乙酸酯(如实施例9中描述的制备)。图8 :来自表达推定胆固醇C25-羟化酶的erg6突变体菌株的单峰的UV光谱。针对下述峰，如实施例9中描述的在HPLC期间使用PDA检测器在线测定在205和300nm之间UV光谱A :在11. 8min下的7_脱氢胆固醇标准物峰(图7，谱图A)；B :在8. 5min下的25-羟基7_脱氢胆固醇乙酸酯标准物峰(图7谱图B);C :在 8. 5min 下的 ERT/pFLAde-S24Rl/V51_C25Hl 峰(图 7，谱图 D)。图9 :来自表达推定胆固醇C25-轻化酶的erg6突变体菌株的单峰的质谱图。对下述峰，如实施例9中描述的,在HPLC期间,用MicroMass ZQ检测器,在线测定来自m/z =350至450的质量碎裂谱图A : 11. 8min下的7_脱氢胆固醇标准物峰(图7，谱图A)；B :在8. 5min下的25-羟基7_脱氢胆固醇乙酸酯标准物峰(图7，谱图B);C :在 8. 5min 下的 ERT/pFLAde-S24Rl/V51_C25Hl 峰(图 7，谱图 D)。图10 :来自表达推定胆固醇C25-羟化酶的ERG6野生型菌株的留醇提取物的HPLC洗脱图。使用了下述菌株B W303/V51 ；
CW303/V51-C25H1 ；DW303/V51-C25H3o标准物为A，麦角甾醇(麦角甾5，7，22-三烯醇)，购自Sigma-Aldrich，St. Louis, MO 63103，USA。图11 :来自表达推定胆固醇C25-羟化酶的ERG6野生型菌株的单峰的UV光谱。针对下述峰，如实施例9中描述的，在HPLC期间，用PDA检测器，在线测定在205和300nm之间的UV光谱 A :在11. 9min下的麦角留醇标准物峰(图10，谱图A)；B :在 10. Omin 下的 W303/V51-C25H1 峰(图 10，谱图 C)；C :在 8. 7min 下的 W303/V51-C25H1 峰(图 10，谱图 C) ·图12 :来自表达推定胆固醇C25-羟化酶的ERG6野生型菌株的单峰的质谱图。针对下述峰，如实施例9中描述的，在HPLC期间，用MicroMass ZQ检测器从m/z = 350至450测定质量碎裂谱图A :在11. 9min下的麦角留醇标准物峰(图10，谱图A)；B :在 10. Omin 下的 W303/V51-C25H1 峰(图 10，谱图 C)；C :在 8. 7min 下的 W303/V51-C25H1 峰(图 10，谱图 C) ·图13 :较之其中ERG6被失活的酵母(胆甾-型甾醇)，野生型酵母(麦角型甾醇)的甾醇生物合成途径的晚期部分。酶以斜体字突出显示。实箭头代表在野生型酵母中发现的酶反应。虚箭头对应通过异源活性(推定的留醇Λ24-还原酶，推定的胆固醇C25-羟化酶)催化的步骤，对应的酶加下划线。图14 :是酵母甾醇途径图。图15 :是通过10种不同的25-羟化酶基因将7-脱氢胆固醇转化为25-羟基-7-脱氢胆固醇(HyDHC)的比较。含有如在实施例2中描述的经优化的来自猪的25-羟化酶的S. cerevisiae菌株Ecab HY (具有SEQ. ID. NO :26的基因的的整合构建体)、Ecab opt2. O (具有SEQ. ID. NO 25的基因的整合构建体)、Ptro opt 2. O (具有SEQ. ID. NO 19的基因的整合构建体)、Ptro HY(具有SEQ. ID. NO :20的基因的整合构建体)、ConHyD HY(具有的SEQ. ID. NO 31的基因的整合构建体)、ConHyD opt 2. O (具有SEQ. ID. NO 30的基因的整合构建体)、Rnor HY (具有SEQ. ID. NO 23的基因的整合构建体)、Rnor opt 2. O (具有SEQ. ID. NO 22的基因的整合构建体)、Sscr HY (具有SEQ. ID. NO 28的基因的整合构建体)、Sscr opt 2. O (具有SEQ. ID. NO 27的基因的整合构建体)和Scr Pompon,如实施例20中描述的进行培养。甾醇从细胞球团中分离出并且总甾醇的HyDHC含量、HyDHC比例以及7-DHC向HyDHC的转化与通过整合25-羟化酶C25H1获得的值比较。所有的新羟化酶基因被表达并且所述基因的基因产物能将7-DHC羟基化为HyDHC。定义说明书和权利要求通篇中，应用了下述定义“酵母”指Saccharomyces cerevisiae,以及适于商业规模生产的其他酵母,例如 Schizosaccharomyces spp.、Pichia spp、Klyuveromyces spp.、Hansenula spp.和Yarrowia Iipolytica0杂交的“标准条件”在本发明的上下文中表示下述条件，所述条件通常由本领域技术人员用于检测特异性杂交信号并且描述于例如Sambrook et al. , " MolecularCloning" , second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989,New York(其通过引用被并入本文)中。“严格杂交条件”的例子是在下述溶液中于42°C下过夜孵育(例如15个小时)后在O. Ix SSC中于约65°C下洗涤杂交支持物，所述溶液含有50%甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7·6)、5χ Denhardt; s溶液、10%硫酸葡聚糖和20 μ g/ml经变性、剪切的鲑精DNA。如本领域中已知的，术语“ ％同一性”表示多肽或多核苷酸序列之间的相关程度，视情况而定，如通过此类序列的字符串(strings)之间的匹配测定的。“同一性”可以通过已知方法容易地确定，例如，使用下述参数缺口产生罚分8，缺口延伸罚分2(缺省参数)用程序 BESTFIT (GCG Wiscon sin Package, version 10. 2, Accelrys Inc. , 9685 ScrantonRoad, San Diego, CA 92121—3752，USA)来确定。“功能性”酶表示在典型的酵母培养条件下，酶在酵母内实现期望的活性。例如，"功能性胆固醇C25-羟化酶"表示酵母细胞体内，胆固醇C25-羟化酶将7-脱氢胆固醇转化为25-羟基-7-脱氢胆固醇。“功能性”核酸序列表示核酸序列包括必要的序列(除了编码多肽的那些外)，以便酵母以一定的浓度表达多肽至它发挥作用的地方。此类序列可包括启动子、终止序列，增强子等等。3曰固醇25-羟化酶本发明的一个方面因而是在酵母细胞中生产25-羟基-7-脱氢胆固醇或25-羟基麦角留醇的方法，所述方法包括使7-脱氢胆固醇或麦角留醇与胆固醇C25-羟化酶接触并获得25-羟基-7-脱氢胆固醇或25-羟基麦角留醇。优选地胆固醇C25-羟化酶是来自脊椎动物来源，更优选地来自大鼠、猪、狗、马、人、黑猩猩、Macaca mulata、小鼠、Gallusgallus、Xenopus laevis、Danio rerio 或 Ornithorynchus anatinus 的酶。另夕卜，可以使用这些天然酶的衍生物，即其中氨基酸序列不再与天然酶相同的那些酶，只要它们保留它们起作用的能力即可。例如，本发明包括下述酶的用途，所述酶与天然脊椎动物C25-羟化酶共有至少90%同一性和优选地具有至少95%同一性和更有优选地具有至少99%同一性的那些酶，条件是衍生酶保留其功能。类似地，可被用在本发明中的核酸是编码上述肽序列的那些和在严格条件下与编码上述肽序列的那些核酸杂交的核酸。优选地它们是经分离的。另外，在一些实施方式中，编码C25-羟化酶酶的核酸是已经密码子优化的，以更好地适于酵母环境。在优选的实施方式中，核酸来自猪、大鼠、狗、黑猩猩或马并且已针对酵母经密码子优化。特别优选的核酸是这样的核酸已经密码子优化使得它们至少在酵母宿主中表达的那些以及参考核酸序列“Sscr Pompon SEQ ID NO :5”,更优选地核酸序列比“Sscr Pompon”更好地被表达。核酸优选地是DNAs。特别优选的核酸是被命名为下述的那些C25H1 (基于猪羟化酶；SEQ. ID NO 5),C25H3 (基于狗羟化酶SEQ. ID. NO :8)，Ecab_HY 或 Ecab 250H_opt2. O (基于马羟化酶SEQ ID NOS :25 和 26)，ConHYD opt 20 (SEQ ID NO :30)
Rnor HY(基于大鼠羟化酶 EQ ID NO 23)Sscr HY (SEQ ID NO 28)Sscr opt 20 (SEQ ID NO :27)Sscr Pompon (SEQ ID NO :5)本发明的另一方面是包含功能性胆固醇C25-羟化酶的酵母细胞。本发明的另外方面是能将-脱氢胆固醇或麦角留醇分别转化为25-羟基7-脱氢胆固醇或25-羟基麦角甾醇的酵母本发明的另外方面是在酵母中生产25-羟基7-脱氢胆固醇的方法，所述方法包括在容许羟基化反应发生的条件下，存在7-脱氢胆固醇时，允许脊椎动物胆固醇C25-羟化酶的表达，导致25-羟基7-脱氢胆固醇的生产。本发明的其他方面是在酵母中生产25-羟基麦角留醇的方法，所述方法包括在容许羟基化反应发生的条件下，存在麦角留醇时，允许脊椎动物胆固醇C25-羟化酶的表达，导致25-羟基麦角留醇的生产。表达载体中存在基因的多拷贝在是优选的。在优选的实施方式中，使用了 2-5个拷贝。用于将任何上面提到的基因克隆进酵母宿主的载体可以是已知用于克隆的任何类型的载体，特别是携带C25-羟化酶基因和相关的表达和/或整合序列(包括本领域中常用的启动子和增强子)的质粒和着丝粒质粒，并且这些载体构成了本发明的另一方面。在能生产7-脱氢胆固醇的酵母中，例如在US 2006/0242508中描述的酵母中，下述是优选的基因ERG5和ERG6被失活且源自脊椎动物的留醇Λ 24-还原酶被表达，例如在下文进一步描述的那些。而且，在一些情况下，在此类酵母中过表达HMGl的截短版本是有优势的。具有失活的ERG5和ERG6且截短的HMGl基因的此类菌株已在本领域中描述过。使用已知的UV光照程序，25-羟基维生素原D3或25-羟基维生素原D2可分接着分别被转化为25-羟基维生素D3或D2、第一代谢产物和维生素D3或D2的循环形式。25-羟基维生素D3在骨形成中发挥重要作用并在商业上在家禽和其他动物饲料中用作维生素补充剂，其可以商标ROVMIX HY-D 商购自DSM Nutritional Products。25-羟基维生素D2在体内显示了与25-羟基维生素D3相当的作用并且可以类似于25-羟基维生素D3的使用的方式使用。甾醇Λ 24-还原酶本发明的另一方面是新颖核酸，所述核酸编码留醇△ 24-还原酶，所述酶可被酵母表达并可使选自羊毛留醇、二甲基酵母留醇、甲基酵母留醇、酵母留醇、胆留_7，24-二烯醇或胆留-5，7，24-三烯醇的底物转化为选自3 β -羟基-8-羊毛留-8-烯，4，4- 二甲基-胆甾-8-烯醇、4α-甲基-胆留-8-烯醇、胆留-8-烯醇、胆留-7-烯醇(lathosterol)和7-脱氢胆固醇的产物，条件是核酸序列不是人或小鼠核酸序列。优选地，酵母细胞是其中ERG6和ERG5被失活的酵母细胞。优选地那些核酸是针对宿主细胞经密码子优化的来自脊椎动物来源的经修饰的DNAs，条件是所述核酸不是小鼠(mouse)的也不是人的。优选地甾醇Δ 24-还原酶来自猪、狗、黑猩猩、Macaca mulata、小鼠，大鼠、马、Gallus gallus、Xenopus laevis、Danio rerio或Ornithorynchus anatinus。在特别优选的实施方式中，核酸是大鼠(Rattus norvegicus)或斑马鱼(Daniorerio)DNAs,且在更优选的实施方式中，它们已经密码子优化用于在Saccharomycescerevisiae中表达。特别优选的核酸被命名为S24R1 (经修饰的大鼠基因，SEQ ID NO I的核苷酸10至1563)和S24R2(经修饰的斑马鱼基因，SEQ ID NO 3的核苷酸10至1563)。本发明另一方面是脊椎动物核酸序列，优选地DNA，其已经密码子优化用于在酵母宿主中表达并且其编码功能性留醇△ 24-还原酶酶，使得在酵母宿主细胞内，所述酶可使羊毛留醇转化为3 β -羟基-8-羊毛留-8-烯，或将二甲基酵母留醇转化为4，4- 二甲基-胆甾-8-烯醇；甲基酵母甾醇转化为4α-甲基-胆甾-8-烯醇；酵母甾醇转化为胆甾-8-烯醇；胆甾-7，24- 二烯醇转化为胆甾-7-烯醇；或胆留-5，7，24-三烯醇转化为7-脱氢胆固醇；且编码酶的核酸可在严格条件下与S24R1或S24R2杂交，条件是该脊椎动物核酸序列不是分离自人或小鼠的核酸序列。本发明的另一方面是由上述提到的核酸序列编码的酶。本发明的优选的酶是如SEQ ID NO. 2和4给出的那些和展示与SEQ ID NO. 2和4至少90%和优选地至少95%同一性的那些，其在酵母细胞环境内还可将羊毛甾醇转化为3 β -羟基-8-羊毛甾-8-烯，二甲基酵母甾醇转化为4，4-二甲基-胆甾-8-烯醇，甲基酵母甾醇转化为4α-甲基-胆甾-8-烯醇，酵母甾醇转化为胆甾-8-烯醇，胆甾-7，24- 二烯醇转化为胆甾-7-烯醇，或胆甾-5，7，24-三烯醇转化为7-脱氢胆固醇。本发明的另一方面是含有如上文所述的功能性核酸序列的酵母宿主，特别是包含S24R1、S24R2或在严格条件下与S24R1、S24R2杂交的核酸序列的酵母宿主例如S. cerevisiae,条件是核酸不是人序列也不是小鼠序列。在优选的实施方式中,酵母宿主已使ERG5和ERG6失活；在特别优选的实施方式中，酵母宿主还过表达HMGl基因的截短版本。还本发明的另一方面是在酵母细胞内生产3 β -羟基-8-羊毛留-8-烯、4，4- 二甲基-胆留-8-烯醇、4 α -甲基-胆留-8-烯醇、胆留-8-烯醇、胆留-I-烯醇或7_脱氢胆固醇的方法，其包括使羊毛留醇、二甲基酵母留醇、甲基酵母留醇、酵母留醇、胆留_7，24-二烯醇或胆留-5,7,24-三烯醇与下述酵母接触，所述酵母包含已经密码子优化用于在酵母宿主中表达并且编码功能性留醇△ 24-还原酶酶的核酸序列，条件是该核酸序列不是人序列也不是小鼠核酸序列，且所述酵母使 羊毛甾醇转化为3 β -羟基-8-羊毛甾-8-烯，二甲基酵母甾醇转化为4，4-二甲基-胆甾-8-烯醇，甲基酵母甾醇转化为4 α -甲基-胆甾-8-烯醇，酵母甾醇转化为胆甾-8-烯醇，胆甾-7，24- 二烯醇转化为胆甾-7-烯醇，或胆留-5，7，24-三烯醇转化为7_脱氢胆固醇。在该方法中，核酸优选地是S24R1、S24R2或在严格条件下与S24R1或S24R2杂交的核酸，条件是该脊椎动物核酸序列不是人或小鼠核酸序列。
本发明的另一方面包括载体，所述载体包括质粒，所述载体包含已经密码子优化用于在酵母宿主中表达且编码功能性留醇△ 24-还原酶酶的功能性核酸序列，条件是该核酸序列不是人序列也不是小鼠核酸序列。优选地，载体包含核酸S24R1、S24R2或在严格条件下与S24R1或S24R2杂交的核酸，条件是该脊椎动物核酸序列不是人或小鼠核酸序列。载体可包含通常在质粒或其他载体中发现的调节转录、翻译或整合进酵母染色体的通常的序列。某闵构律体编码C25-羟化酶或留醇Λ 24还原酶的本发明的所有基因构建体，典型地是表达盒的一部分，所述表达盒典型地具有已知的启动子控制下的外源基因，所述启动子可用标准方法调节，启动子例如控制感兴趣的基因的ADHl启动子、TEFl启动子、酵母GPD(TDH3)启动子、酵母HXT7启动子、酵母GAL1/10启动子或酵母PGKl启动子。额外地，表达盒可包含与上文所述的基因的至少一个的编码序列可操地连接的上游和下游序列，例如终止子序列和/或其他调节元件。使用常规方法，携带本发明的基因构建体的载体可被引进酵母中。下述实施例仅是示例性的，并不意图以任何方式限制本发明的范围。本申请通篇引用的所有参考文献、专利申请、专利和公布的专利申请的内容通过引用并入本文。
实施例文献全部的引用文献在实施例的结尾处刊出。所有的文献通过引用并入本文。:! 养基:表I :最低培养基的组成
权利要求
1.酵母，其包含胆固醇C25-羟化酶或编码胆固醇C25-羟化酶的核酸。
2.胆固醇C25-羟化酶的用途，所述胆固醇C25-羟化酶用来羟基化7-脱氢胆固醇或麦角甾醇，以分别生产25-羟基-7-脱氢胆固醇或25-羟基麦角甾醇。
3.根据权利要求2的用途，其中所述生产在酵母细胞内发生。
4.根据权利要求2或3的用途，其中所述酵母细胞选自由Saccharomycescerevisiae、Pichia spp、Klyuveromyces spp.、Hansenula spp. Schizosaccharomycesspec.和 Yarrowia Iipolytica 组成的组。
5.在经遗传改良的酵母中生产25-羟基-7-脱氢胆固醇的方法，其包括 a)使7-脱氢胆固醇与通过所述酵母生产的胆固醇C25-羟化酶接触， 借以生产25-羟基-7-脱氢胆固醇。
6.根据权利要求5的方法，其中所述酵母不具有有活性的Erg5p和Erg6p酶，并且所述酵母还表达留醇Λ 24-还原酶。
7.根据权利要求5或6的方法，其中所述酵母表达HMGl的截短版本。
8.根据权利要求5的方法，还包括在步骤a)之前 使胆留_5，7，24-三烯醇与包含编码功能性留醇Λ 24-还原酶酶的核酸序列的酵母接触， 由此所述酵母使羊毛留醇、二甲基酵母留醇、甲基酵母留醇、酵母留醇、胆留-7，24-二烯醇或胆留-5，7，24-三烯醇分别转化为3β-羟基-8-羊毛留-8-烯，4，4_ 二甲基-胆甾-8-烯醇、4α_甲基-胆留-8-烯醇、胆留-8-烯醇、胆留-7-烯醇或7_脱氢胆固醇。
9.在经遗传改良的酵母中生产25-羟基麦角留醇(25-羟基维生素原D2)的方法，其包括 a)使通过所述酵母生产的麦角留醇与通过所述酵母生产的胆固醇C25-羟化酶接触， 借以生产25-羟基麦角甾醇。
10.根据权利要求9的方法，其中所述酵母过表达HMGl的截短版本。
11.编码胆固醇C25-羟化酶的经分离的核酸。
12.包含编码胆固醇C25-羟化酶的核酸的载体。
13.编码留醇Λ24-还原酶的经分离的核酸，所述酶可被酵母表达且可使羊毛留醇、二甲基酵母留醇、甲基酵母留醇、酵母留醇、胆留_7，24-二烯醇或胆留-5,7,24-三烯醇转化为3 β -羟基-8-羊毛甾-8-烯，4，4- 二甲基-胆甾-8-烯醇、4 α -甲基-胆甾-8-烯醇、胆甾-8-烯醇、胆留-7-烯醇或7-脱氢胆固醇，条件是所述核酸序列不是人或小鼠核酸序列。
全文摘要
本发明涉及在酵母例如Saccharomyces cerevisiae中生产7-脱氢胆固醇、25-羟基-7-脱氢胆固醇和25-羟基麦角甾醇。本发明还涉及催化羊毛甾醇、二甲基酵母甾醇、甲基酵母甾醇、酵母甾醇、胆甾-7，24-二烯醇、或胆甾-5，7，24-三烯醇的24位置上的双键还原；或催化麦角甾醇、7-脱氢胆固醇、胆甾-8-烯醇、和胆甾-7-烯醇的25位置上的羟基化的多种酶。本发明还涉及编码胆固醇C25-羟化酶和甾醇Δ24-还原酶的多种核酸和它们用来生产并羟基化7-脱氢胆固醇或麦角甾醇的用途。本发明还涉及这样产生的酵母菌株和制造这些甾醇的方法，所述方法包括培养经转化的酵母细胞的步骤并收获产生的(一种或多种)甾醇。
文档编号C12P33/06GK102639696SQ201080055130
公开日2012年8月15日 申请日期2010年11月24日 优先权日2009年12月3日
发明者丹尼斯·波姆波, 汉斯-彼得·霍曼, 穆里尔·莫卡姆, 马丁·莱玛恩 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司