甲基营养型芽孢杆菌及其应用

甲基营养型芽孢杆菌及其应用
【专利说明】甲基营养型芽孢杆菌及其应用 技术领域 本发明涉及甲基营养型芽孢杆菌及其应用。 【背景技术】 人参（Panax ginsengC.A. Mey)为五加科人参属多年生宿根阴性双子叶药用植物，是 我国的名贵药材,有草之王"的美誉。人参在中国、韩国、朝鲜、俄罗斯等国家有大面积 种植，其中，中国东北是人参的主产区，已成为当地的重要支柱产业之一。人参的长期人工 种植,且品种选育难度大导致人参种质退化、病害严重、质量差、产量低。化学农药的大量使 用，导致农药残留和环境污染，降低了人参药材的安全性和商品价值。病害防控问题已成为 制约人参产业可持续发展的重大问题之一。 人参病害约有20~40种,其中，以下5类病原菌是导致人参常见病害并限制人参产业 发展的主要病原菌：腐皮镰孢菌（Fusarium solani)导致的人参根腐病一般发病率在30% 左右，严重时六年生人参根腐病造成的死亡率可达50%~80%,主要危害幼苗根部和根茎 部（地表以下茎部），腐烂的参根呈黑褐色湿腐状，后期糟朽状，仅存中空的根皮；恶疫霉 菌（Phytophthora cactonun)导致的人参疫病发柄率达70%，其症状为发病轻时叶片' 上产生不规则的暗绿色斑，重者茎叶枯萎，根部腐烂，植株成片枯死，减产严重；人参核盘菌 (Sclerotinia schinseng)导致的人参菌核病主要危害3年生以上参根,发病部位为芽苞、 根和根茎，参根侵染后，初期在表面生少许白色绒状菌丝体，以后，内部迅速腐败、软化,细 胞全部被消解殆尽,只留下坏死的外表皮，表皮内外形成许多鼠粪状的菌核；人参链格孢菌 (Alternaria panax)导致的人参黑斑病一般发病率20%-30%,严重时达到100%，造成早 期落叶，植株枯萎，不结实，参根和参籽减产；毁灭柱孢菌（!Cylindrocarpon destructans) 导致的人参锈腐病严重时发病率达70%以」::。该病发生于根的各部位，病斑呈铁锈色，H点 至面扩散至全根,土壤湿度大、透气不好、腐殖质层厚，发病重。 校期以来通过使用化学农药等化学防治措施来防治人参病害的结果远未达到人们预 想的效果，而且过量使用化学农药会破坏土壤的微生态环境，加重环境污染,也使有毒物质 在参根内大量积累，降低人参的使羯安全性和商品价值，因此，人们把防治重点逐步转向生 物防治措施和农业防治措施上。在农作物植物保护领域,利用作物根际土壤筛选对病原菌 具有显著拮抗效果的土壤微生物，并制成生物菌剂是生物防控研究的重要手段,也是有益 微生物资源开发的重要途径。 生物防治是以生态学原理为基础，利用生物物种间的相互作用，以一种或一类生物抑 制另一种或另一类生物。生物防治最大的优点的不污染环境,没有农药残留，这是农药等非 生物方法防治病虫害所无法比的。利用拮抗微生物防治病原微生物是生物防治技术的重要 组成部分，它避免了化学农药使用带来的一系列植保、环境和能源方面的问题，避免了农药 残留对人畜的危害,更重要的是促进了农业的可持续发展。 芽孢杆菌（Bacinus)是植物病害生物防治研究中的重要微生物类群，其种类多分 布广，是土壤和植物微生态的优势种群。主要有枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)、 解淀粉枯草芽孢杆菌（Bacillus amylolique+faciens)、甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus met.hylotrophicus)、蜡状芽孢杆菌（Baci:丨Ius cereus)、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)等。由于芽孢杆菌具有抑制植物病 害的能力，又是自然界+广泛存在的非致病细菌，对人畜无害，不污染环境，因而备受关注。 美国已有GB03、MBI600、QsIT 13和解淀粉枯草芽孢杆菌变种等4株枯草芽孢杆菌生防菌株 获得环保局商品化或有限商品化生产应用许可。在德国解淀粉枯草芽孢杆菌变种FZB24被 商业化生产,用于控制粮食作物的不同真菌病害。该类微生物通过分泌抗生物质和生长竞 争,在防治植物病害方面发挥多种有益作羯。目前利用甲基营养型芽孢杆菌防治人参真菌 性病害未见报道。
【发明内容】
本发明的目的在于，针对人参生产上主要真菌性病害，尤其是人参土传病害发生面积 日益扩大,化学药剂防治易造成环境污染和农药残留外，防效也不理想的实际情况，提出2 个甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus met+hylotrophicus)菌株，分另[]为SZ-3和SZ-81，及其在 分别引起人参的根腐病、黑斑病、菌核病、疫病和锈腐病的腐皮镰孢菌（Fusarium solani)、 人参链格孢菌（Alternaria panax)、人参核盘菌（Sclerotinia schinseng)、恶疫霉菌 (Phytophthora cactoruro)和毁灭柱孢菌（Cylindroca+rpon destructans) 5 种病原菌防控 上的应用。 本发明提供了 2个对上述5种病原菌具有良好防控作S的甲基营养型芽孢杆菌菌株， 分别为 Bacillus methylotrophicus SZ-3 和 Bacillus me thy I 〇 troph icus SZ-81,并且 2 个甲基营养型芽孢杆菌菌株的混合发酵液对上述5种人参病原菌的联合防控效果史加显 -自c: 本发明通过如下技术方案实现： 上述菌株的物种鉴定是这样迸行的：通过16SrDNA序列分析,测定2株细菌的16Srf)NA 序列长度分别为H64bp和1420bp,具体如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示。 其中dBQ丨:]〕No. 1如下所示：
应用BLAST软件和DNAMAN软件等进行分析,将所测16SrDNA序列通过BLAST比对，能 在GenBank中找到同源性非常高的相近菌株序列。与SZ-3和SZ-81菌株相似性最高的是 Bacillus属菌种，同源性达到99%。根据MEGA5. 10Beta2软件以UPGMA法构建系统发育树 发现/菌株SZ-3和SZ-81与Bacillus methyIotrophicus同属一Iv遗传分枝，亲缘关糸十 分接近,亲源性达到了 99. 2%和99. 3%。结合形态学和生理生化性状的鉴定结果，可以确 认分离到的菌株SZ-3和SZ-81均为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus)。 上述菌株的保臧名称分别为甲基营养型芽孢杆菌SZ…3和甲基营养型芽孢杆菌SZ-~8i,分类 命名分别为 Bacillus methylotrophicus SZ-3 和 Bacillus met+hylotrophicus SZ-81，保 藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院 3号,保藏日期为2013年9月25日，保藏编号分别为CGMCC No, 8275和CGMCC No, 8276。 即， -种甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methy:丨otrophicus)SZ-3,其特征在于，其保藏号 为 CGMCC No. 8275 ;和 --种甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus) SZ-81，其特征在于，其保藏 号为 CGMCC No, 8276。 本发明的甲基营养型芽孢杆菌SZ…3在牛肉膏蛋白胨（NB)培养基上单细胞繁殖生长形 成的菌落为圆形，四周光滑,乳白色，表面有光泽,质地干燥，具鞭毛；细胞形状为杆状；厌 氧生长；革兰氏染色呈阳性；接触酶测定、脂肪酶反应为卩日性；酪蛋白、酪氨酸反应为阳性； V-P试验和硝酸盐还原反应为阳性；能利用D-葡萄糖，D-木糖，L·-阿拉伯糖，甘露醇,不能 利用村I家酸盐；能水解淀粉和_,;囷株接入到含2% NaCl的NB :1??养液中发酵24h后混 洩。甲基营养型芽孢杆菌SZ-81在牛肉膏蛋白胨（NB)培养基上单细胞繁殖生长形成的菌 落为圆形，四周光滑,乳白色，表面有光泽,质地千燥,具鞭毛；细胞形状为杆状；厌氧生长； 革兰氏染色呈阳性；接触酶测定、脂肪酶反应为阳性；酪蛋白、酪氨酸反应为阳性；V…P试验 和硝酸盐还原反应为阳性；能利用[)-葡萄糖，D-木糖α-阿拉伯糖，甘露醇,不能利用柠檬 酸盐；能水解淀粉和明胶；菌株接入到含5% NaCl的NB培养液中发酵24h后混洩。 所述的牛肉膏蛋白胨（NB)培养基的配方为：牛肉膏3. Og,蛋白胨10.0 g, NaC15. Og,琼 脂 i7g,水 1000 mU ρΗ6· 8 ~7. 2。 本发明的甲基营养型芽孢杆菌SZ-81，其特征在于，该菌株在牛肉膏蛋白胨（NB)培养 基上单细胞繁殖生长形成的菌落为圆形，四周光滑，乳白色,表面有光泽,质地干燥,具鞭 毛；细胞形状为杆状；厌氧生长；革兰氏染色呈阳性；接触酶测定、脂肪酶反应为阳性；酪 蛋白、酪氨酸反应为阳性；V-P试验和硝酸盐还原反应为阳性；能利用D-葡萄糖，D…木糖， L-阿拉伯糖，甘露醇，小能利用朽酸盐；能水解淀粉和明胶；國株接入$!|含5% NaCi的NB 培养液中发酵24h后混洩。 根据本发明，所述的甲基营养型芽孢杆菌SZ-Si的NB培养基的配方为：牛肉膏3. Og^ 蛋白胨 10. 0g，NaC15. 0g，琼脂 17g,水！OOOmU pH6. 8 ~7. 2。 本发明还涉及上述甲基营养型芽孢杆菌SZ--3或SZ--81在防治植物真菌病害中的应用， 或在制备防治植物真菌病害的微生物制剂中的应用。所述植物优选为人参。其中^甲基营 养型芽孢杆菌SZ-3优选用于防治引起人参的根腐病的腐皮镰孢菌（R solani)、引起人参 黑斑病的人参链格孢菌（A. panax)和引起人参菌核病的人参核盘菌（S. schinseng)中的一 种或多种。所述甲基宫养型芽抱杆囷SZ-81优选用十防治引起人参疫病的恶&霉國' (Ph, cactorum)、引起人参锈腐病的毁灭柱孢菌（C. destructans)和引起人参黑斑病的人参链 格孢菌（A.panax)中的一种或多种。本发明的甲基营养型芽孢杆菌SZ-3和SZ-81对人参 还具有促生长作用。 本发明还涉及微生物制剂，含有甲基营养型芽孢杆菌SZ-3的全培养液培养物和甲基 营养型芽孢杆菌SZ-3孢子，其可通过以下制备方法制备得到： (1) 将甲基营养型芽孢杆菌SZ-3的试管种接种于用U)()0mL：￡角瓶装的300mL NBP培 养液中，在180r/mi_n，30°C下培养36小捋，获得发酵菌液； ⑵将发酵菌液在以种子罐体积10%接种于种子罐中的发酵培养液中发酵培养，溶氧 量为15~18%,搅拌速度200rpm，种子罐的温度28~32°C,接种发酵菌液4小时后，每隔 2小时对种子罐中的发酵液进行发酵质量检测,直到发酵液菌体生长比较饱满即将出现芽 ?包时!·获得发酵菌种，种子罐中的发酵时间为14~18小时； ⑶将种子罐中发酵菌种的10%接种于发酵罐中的NBP培养液中发酵培养，溶氧量为 15~18% ,搅拌速度200j：pm，发酵罐的温度28~32?,接种发酵菌种4小时后,每隔2小 时对发酵罐进行发酵质量检