作用（A :空乩B :浇注SZ-3菌悬液）。 图13 :SZ-81对人参的促生长作羯（A ;空白，B :烧注SZ·-Sr菌悬液）。 【具体实施方式】 实施例i 甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methy]_otrophicus)SZ-3和SZ·-8丨的分离和保藏 该菌株自吉林省抚松县万良镇人参栽培基地多年生人参根际周围30cm以内的土壤分 离得到,采集1:述土壤样品，风干后过筛。称取样品IOg5放入装有玻璃珠和90mL无菌水的 三角瓶中，充分振荡l〇-30min,使样品与无菌水混合均勾，制得样品悬液，静置5min。在无 菌条件T取ImL上清液，加入9mL0. 05% SDS水溶液（十二烷基硫酸钠水溶液），40?保温 20roin，取iroL，加人9tnL无菌水，按梯度依次铜成10'10 ·、10 '的稀释液。分别吸取100μ丄 各稀释液加入到牛肉膏蛋白胨（NB)平板上，采用平板稀释法均匀涂布,每处理3次重复^ 34?培养箱培养1~2天。挑选单菌落转接到NB平板培养,长出菌落后，用接科环进行划 线分离纯化，纯化菌株于4°C保存。上述牛肉膏蛋白胨（NB)培养基配方为；牛肉膏3. 0g、蛋 白胨 10. 0g、NaC15. 0g，琼脂 17g,水 lOOOmL，pH6. 8 ~7. 2。 分离、纯化获得的菌株SZ-3在牛肉膏蛋白胨（NB)培养基上单细胞繁殖生长形成的菌 落为圆形，四周光滑，乳白色，表面有光泽,质地千燥,具鞭毛；细胞形状为杆状；厌氧生长； 革兰氏染色呈阳性r接触酶测定、脂肪酶反应为阳性；酪蛋白、酪氨酸反应为阳性；V--P试验 和硝酸盐还原反应为阳性；能利用D-葡萄糖木糖，L·-阿拉怡糖,甘露醇，不能利用柠檬 酸盐；能水解淀粉和明胶；菌株接入到含2% NaCl的NB培养液中发酵24h后混浊。菌株SZ-81在牛肉膏蛋白胨（NB)培养基上单细胞繁殖生长形成的菌落为圆形，四周光滑，乳白 色，表面有光泽，质地千燥,具鞭毛；细胞形状为杆状；厌氧生长；革兰氏染色呈阳性r接触 酶测定、脂肪酶反应为阳性；酪蛋白、酪氨酸反应为阳性；V--P试验和硝酸盐还原反应为阳 性；能利用D-葡萄糖，D-木糖，L-阿拉伯糖/甘露醇，不能利羯柠檬酸盐；能水解淀粉和明 胶；菌株接入到含5% NaCl的NB培养液中发酵24h后混浊。 上述2个菌株均于20丨3年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心,保藏编号分别为CGMCC No. 8275和CGMCC No. 8276分别命名SZ-3、SZ-81，分类命 名为甲基营养型芽孢?十菌（Bacillus methylotrophicus) c 实施倒I 2 SZ--3和SZ--81菌槔对人参真菌病害病原菌生长的抑制作用 采用滤纸片法分别测定菌株SZ-3、SZ-81对人参真菌病害病菌的拮抗作用：用直径8mm 的打孔器将活化好的人参病原菌菌落制成相应尺寸的菌饼,无菌接种至马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA)平板（直径90mm)的正中央，同时将4片直径为Icm的灭菌滤纸圆片粘于距平板中心 25mm处的4个角点上。将菌株SZ-3和SZ-81分别制成菌悬液（浓度约为IO8CiVmL),其中 3片滤纸圆片每片点接20 μ L菌悬液，1片滤纸圆片点接20 μ L无菌水，作为处理组,每个处 理重复3次；另在一块平板的4个角点的4片滤纸圆片上均分别点接20 μ L无菌水,作为对 照组，均置于28?培养箱培养6~7大，待对照组病原菌菌落长满平板，测量处理组病原菌 菌落直径（单位；fmnh并按照如下公式计算抑if率。每种病原菌重复3次，结果取平均值。 抑菌率（％)二[(A - B),/(A - 8)] X 100% 注：A为对照组病原菌菌落直径，即90mm ;B为处理组病原菌菌落直径。马铃薯葡萄糖 (PDA)培养基的制备方法：称取去皮马铃薯200g、葡萄糖20g，加入水1000 mU调节pH为 7. 0。在沸水洛上朋热20ni_in,纱布过滤;后足容到1000 mL,加:?脂22g给化丨rj分装湿热灭_ (12 Γ?, 30min) 〇 上述菌悬液的制备方法：保藏的菌株SZ-3和SZ-80分别通过平板划线方式活化2天 后，用接种环取3~4块直径Icm的细菌菌落，接入到200mL含50mL牛肉膏蛋白胨（NB)培 养液的:三角锥形瓶中，摇床32?, 180r/min培养48h后制成浓度约为IO8CiVmL的细菌菌悬 液。牛肉膏蛋白胨（NB)培养液的配方为冲肉膏3。0g、蛋白胨10. 0g、NaC15. Og5水1000 mL, pH6, 8 ~7。2〇 结果如表所示/菌株SZ-3对分别引起人参根腐病、黑斑病和菌核病的腐皮镰孢菌、人 参链格孢菌和人参核盘菌）均具有明显的抑制作用；而菌株SZ_81对分别弓丨起人参锈腐病、 疫病和黑斑病的毁灭柱孢菌、恶疫霉菌和人参链格孢菌均具有明显的抑制作用。 表1菌株SZ-3、SZ-81对人参病原真菌的抑制作用
实施例3 甲?营养型芽孢针菌SZ-_3和SZ-8!.对人参病菌的拮抗活性实验 釆用牛津杯法分别测定菌株SZ-3和SZ-81菌株对人参具菌病害病菌的措抗活性:将 SZ-3和SZ-81菌株分别制成菌悬液后收集（制备方法同实施例2),在4?条件T，12000r,/ Mn离心20min,收集上清液经0. 22 μ m微孔滤膜过滤，所得滤液4?保存备用。无菌条件下 在PDA平板中央接种直径为8mm的人参病菌菌饼,然后将4个无菌牛津杯放于距平板中心 约25丽!的4个对称角点，每杯内滴加100 μ 1滤液，每处理3次重复，28?培养5天后测量 抑菌带宽度。 结果表明，SZ--3对人参核盘菌、腐皮镰孢菌和人参链格孢菌的抑菌带分别为i3. 8mm、 6. 2mnK 1.0· Ir冊；SZ-81对人参链格抱_、毁灭柱抱國'和恶疫霉_的抑_带分别为2· 7mt丨、 8。5mti、10. 2min，表明这两株菌对人参病菌具有明显的抑制效果（表2)。 表2甲基营养型芽孢杆菌SZ-3、SZ-81对人参病原真菌的拮抗活性
[0055] 注：参考Vestberg法，" + "、"++"、"十++"分别表示抑菌带半径为<5勝、5-10羅、 > I Oirim。 实施例4 甲基营养型芽孢杆菌SZ-3和SZ-81对人参的促生作用 分别制备SZ-3和SZ-81的菌株菌悬液（32t\180r/m、48h，浓度约为IO8CfuZmL,制备 方法同买施例2)。将人参新杯土:蛭而按照2:〖比例配制基质，灭菌后填装t同体积花益 中。应用取于抚松万良县的3年生人参苗,小心抖落附着于根部的土壤，随机分组。将处理 组人参苗分别浸泡于预先配置好的SZ-3和SZ-81菌悬液中，25-30min后取出，分别移栽于 装有灭菌土的花盆中，分为SZ-3、SZ-81两组,每处理3盆，每盆5株。每组每盆各? SZ-3、 SZ-81菌悬液（含菌量约为108cfu/ntL)的100倍无菌水稀释液30mL灌根，随机排列，温室 保湿培养；对照组用无菌牛肉膏蛋白胨（NB)培养液浸苗，处理方式同上,每处理3盆^随机 排列,温室保湿培养，分别浇灌30mL的无菌培养液（除不含有SZ-3和SZ-81外，其余成分 与处理组相同）。待人参苗长至30天后，分别随机选取处理组和对照组各5株人参苗j、心 将苗整株挖出，洗去根部泥土，测量其株髙、根长、整株鲜重和根鲜重指标。然后180°C烘干 全恒重，测整棵干重和根干重。 室内盆栽测定结果表明（表3所示），接种SZ-3和SZ-81于灭菌土种楦人参时，人参 植株株高、整株鲜重、根鲜重、根长、整株干重及根干重较无菌培养液均有不同程度的增加^ 证明菌株SZ-3和SZ-81对人参生长均具有明显的促迸作用（如图11,12)。同捋^也说明 SZ-3和SZ-81对人参时安全的。 表3菌株SZ-3和SZ-81对人参生长的促进作用
实施例5 甲基营养型芽孢杆菌SZ-3与SZ-81在土壤中的定殖 将用利福平（300 μ g/mL)标记过的甲基营养型芽孢杆菌SZ-3和SZ-81分别接种于NB 培养液，32?，180r/min，摇床振荡24b，分别制成含菌釐约为108cfu/mL的标记菌株菌悬液。 分别把自然土及灭菌土装于花盆中，每盆Ikg土，各自向土壤中注入IOiML标记过的甲基营 养型芽孢杆菌SZ-3和SZ-81菌悬液拌土。室温_F放置，每隔7天分离1次土壤内的细菌 (土壌先经梯度稀释后，取i〇 3、i〇 4、i〇 5的土壤稀释液进行平板涂布），计算含菌量。结果 表明，28天后自然土和灭菌土中SZ-3和SZ-81的定殖菌量均能达到IO5CfuZg 土以上。这 说明SZ-3和SZ-81在土壤中均具有较强的定殖能力。 实施例6 SZ-3和SZ-81发酵菌液的制备 甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus SZ-3和SZ-81的试管种分别接种 于用1000 niL :三角瓶装的300就NBP培养液中，在丨80r/min,30°C下培养36小时，获得发酵 菌液。 NBP培养液的制备方法为：称取牛肉膏3. Og,蛋白胨10。0g，酵母浸膏5。0g，葡萄糖 5. 0g, NaC〗_5, Og,放入1000 mL水中，充分混匀后将pll调整至6, 8~7. 2, !OOOmL三角瓶中装 量为30iML培养液,用双层封口膜封好::::〔角瓶□, 121?湿热灭菌30分钟，冷却后备用。 实施例7 甲基营养型芽孢杆菌SZ-3微生物制剂的制备 甲基营养型芽孢杆菌SZ…3微生物制剂含有甲基营养型芽孢杆菌SZ…3的全培养物和甲 基营养型芽孢杆菌SZ-3的孢子，制备方法如下： (1) 将实施例6中培养好的SZ-3发酵菌液在以种子罐体积10%接种于种子罐中的发 酵培养液中发酵培养,溶氧量为15~18%,搅拌速度ZOOrpm,种子罐的温度28~32°C，接 种发酵菌液4小时后，每隔2小时对种子罐中的发酵液进行发酵质量检测，直到发酵液菌体 生长比较饱满即将出现芽孢时:> 获得发酵菌种，种子罐中的发酵时间为14~18小时； (2) 将种子罐中发酵菌种的10%接种于发酵罐中的NBP培养液中发酵培养,溶氧量为 15~18%，搅拌速度200rpm,发酵罐的温度28~32°C,接种发酵菌种4小时后,每隔2小 时对发酵罐进行发酵质量检测，观察菌含量，直到发酵罐中发酵液中的最终培养物（包含 菌和芽孢）生物量为IOsCfuZmL以上、芽孢含量大于或等于95%时，立即将发酵液出罐,迸 行分装，获得SZ-3微生物制剂；发酵罐中发酵时间为36~48小时。 上述NBP培养液的配方为：牛肉膏3, Og,蛋白胨10.0 g,酵母浸膏5. Og,葡萄糖5. Og, NaC15. Og,水1000 mU pH6. 8~7. 2 ;制备方法为：称取4:肉膏、蛋白胨，酵母浸膏、葡萄 糖、NaCl放入1000 mL水中，充分混匀后将pH调整至6。8~7" 2, 1000 mL :三角瓶中装量为 300mL培养液,用双层封□膜封好三角瓶□, 湿热灭菌30分钟，冷却后备用；发酵培 养液的配方以重量百分比计为：玉米粉2. 0%,豆饼粉1. 5%,淀粉0. 5%,酵母浸膏0. 2%, NaC〖8. 0%，