一株诱导植物抗病抗逆的海洋生境芽孢杆菌的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于海洋微生物应用领域，具体的说是由海洋生境获得的芽孢杆菌CT2628 菌株（Bacillus sp.)通过人工诱变育种及培养发酵，活菌制剂对栽培植物具有防病、诱导 抗寒抗盐的作用。该菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)， 地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2014年3 月17日，保藏编号CGMCC No. 8921的CT2628菌株。
【背景技术】
[0002] 当前，环境保护和食品安全问题得到从中央到地方政府的普遍关注，减少化学农 药的使用无论对保护环境，还是对食品的源头农产品的安全，都具有重要的实际意义，生物 农药以其毒性低，与环境相容性好的特点，在世界范围受到重视，活菌制剂是生物农药的一 大种类，这些有益菌通过定殖在植物体或寄生在害虫体内，发挥抑菌和杀虫等作用。芽孢 杆菌是其中最著名的益生菌，作为各种酶的产生菌广泛应用于工业生产；作为饲料添加剂 和医药，可抑制常见肠道病原菌，提高动物抗病能力，降低抗生素用量；其无毒、成本低、杀 虫、抑菌能力强的特点，也为国内外研发生物农药所关注，是世界产量最大的生物农药，新 资源、新用途的发现更是国内外农药领域争夺的对象。
[0003] 我国是土壤盐渍化严重的国家之一，盐渍化土壤总面积达3460万公顷，相当于耕 地的1/3,鉴于人多地少的特点，这些盐渍化土壤仍被人们所利用栽种耐盐作物，同时，早春 和晚秋的倒春寒每年也造成农作物巨大损失。目前国内外开发微生物农药由于生防菌都来 源于陆地，在含盐量较高的土壤中难以存活、定殖，在盐渍地土传病害的防治效果较差；陆 地生防菌由于生境原因，较低的环境温度限制了其发挥作用。近几年受到国内外关注的新 资源一海洋微生物，由于其原始生境的低温高盐特性，使其更易在盐渍土壤和低温环境发 挥作用，在新农药开发领域显现其生境优势。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一株诱导植物抗病、抗盐、抗寒的海洋芽孢杆菌及可能在农 业生产的应用，发明充分利用了海洋微生物这一特殊生境的天然资源，野生菌株已通过人 工诱变育种，生物学特性和农药活性稳定，容易培养，培养周期短，操作方法简便可行，对环 境没有污染，所用原料廉价，生产成本低，开发前景好，容易实现产业化。
[0005] 本发明的目的是由以下技术方案实现的，为从海洋生境获得海洋芽孢杆菌CT2628 菌株（Bacillus sp.)，经人工诱变育种和培养条件优化，其适宜的人工培养发酵的条件 为：
[0006] 1)以其保藏编号为：CGMCC No. 8921的CT2628菌株，菌株经培养基优化测试，其 适宜的发酵培养液的配方为：牛肉膏l_3g，蛋白胨2-3g，酵母粉l-3g，葡萄糖l-3g，NaCl， 20-25g，KC10. 3-0. 5g，MgCl2 ·7Η201· 9-2. 5g，FePO40.0 1-0. 02g，水 1000ml，ρΗ7· 0-8. 0,上述 为培养液，加琼脂16_19g为固体培养基；
[0007] 2)菌株在上述固体培养基置23°C -28°C温箱培养3-5天，将固体培养基生长好的 菌体刮下，接入步骤1中的培养液培养3天为种子液，再将种子液按I : 10接入40-50L上述 培养液中，23°C _28°C，转速150rpm，振荡培养3-5天获得发酵物，根据需要可用相同方法扩 大到目标培养量。
[0008] 所述的一株诱导植物抗病抗逆的海洋生境芽孢杆菌，其特征在于：菌株特性为菌 落浊黄色，表面大多有褶，有时光滑，后期在蛋白胨培养基上产生深蓝色素；菌体杆状，革兰 氏染色阳性0. 6-1. 9 μ mX 2. 9-5. 9 μ m，无荚膜，周生鞭毛，芽孢中生，聚集成链状，水解淀 粉，明胶、接触酶、VP试验均为阳性，能利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖产酸，酪氨酸水解阴性， 不分解木质素，还原硝酸盐，利用柠檬酸盐。
[0009] 所述的一株诱导植物抗病抗逆的海洋生境芽孢杆菌，其特征在：经过海洋生境 芽孢杆菌CT2628菌株处理，在低温0°C _2°C条件下番茄电解质外渗率和丙二醛含量分 别降低了 98. 66%和63. 12%，可溶性糖、超氧化物歧化酶、过氧化物酶、脯氨酸分别提高 了 62.47%，62.16%，205.13%，342.11%，在盐害恥(：10.5-0.6%胁迫下，丙二醛降低了 72. 38%，可溶性糖、超氧化物歧化酶、过氧化物酶、脯氨酸分别提高了 80. 47%，89. 33%， 117. 44%，230. 53%，CT2628菌株诱导植物抗寒及抗盐效果显著。
[0010] 所述的一株诱导植物抗病抗逆的海洋生境芽孢杆菌，其特征在于：CT2628菌株 采用常规的对峙培养法和抑菌率统计法筛选获得，靶标菌为在农业生产危害严重的9种 植物病原真菌：稻癌霉菌Pyricularia oryzae、爺链孢菌Alternaria solani、镰孢霉菌 Fusarium oxysporum、灰葡萄抱菌Botrytis cinerea、大而轮枝菌Verticillium dahliae、 芽枝霉菌 Cladosporium fulvum、辣椒疫霉菌 Phytophthora capsici、丝核菌 Rhizoctonia solani赤霉菌Fusarium graminearum作为祀标菌进行抑菌测试，对峙培养法抑菌圈 26-35mm，抑菌率统计法抑菌率78. 00-88. 20%，均属于强抑菌活性。
[0011] 所述的一株诱导植物抗病抗逆的海洋生境芽孢杆菌，其特征在于：海洋芽孢杆菌 菌株在普通耕作土及海滨盐渍土的栽种的黄瓜、番茄、辣椒、甘蓝、甜瓜、茄子均可以正常 定殖，浸根栽种4-6天后在植物根、茎、叶的最高定植数分别可达6. OOX 103、8. 30X 103、 4. 65X 103,定殖群体数可维持15-20天。
[0012] 所述的一株诱导植物抗病抗逆的海洋生境芽孢杆菌，其特征在于：海洋生 境芽孢杆菌菌株对黄瓜、番茄、辣椒的白粉、早疫、疫霉、灰霉4种病害，预防效果可达 77. 1% -89. 0%，治疗效果59. 0% -62. 4%，防与治的效果均高于传统的化学农药多菌灵。
[0013] 本发明的有益效果：具有诱导植物抗病、抗盐、抗寒的海洋生境芽孢杆菌及在农业 生产的应用，充分利用了海洋微生物这一特殊生境的天然资源，野生菌株已通过人工诱变 育种，生物学特性和农药活性稳定，容易培养，培养周期短，操作方法简便可行，对环境没有 污染，所用原料廉价，生产成本低，开发前景好，容易实现产业化。
【具体实施方式】
[0014] 本发明的保护范围不仅局限于以下实施例中，本发明的具体技术步骤如下：
[0015] 实施例1 :CT-2628菌株的人工培养及发酵
[0016] 以保藏编号为：CGMCC No. 8921的CT-2628菌株，经培养基优化测试，牛肉膏l-3g， 蛋白胨 2-3g，酵母粉 l-3g，葡萄糖 l-3g，NaCl，20-30g，KC10. 3-0. 5g，MgCl2 ·7Η201· 9-2. 5g， FePO40.0 1-0. 02g，水1000ml，pH7. 0-8. O上述为培养液，加琼脂16-19g为固体培养基；
[0017] 在上述固体培养基上培养，并用常规方法测试其理化特征，菌株特性如下：菌株特 性为菌落浊黄色，表面大多有褶，有时光滑，后期在蛋白胨培养基上产生深蓝色素；菌体杆 状，革兰氏染色阳性0. 6-1. 9 μ mX 2. 9-5. 9 μ m，无荚膜，周生鞭毛，芽孢中生，聚集成链状， 水解淀粉，明胶、接触酶、VP试验均为阳性，能利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖产酸，酪氨酸水解 阴性，不分解木质素，还原硝酸盐，利用柠檬酸盐。
[0018] 菌株在上述固体培养基置23°C -28°C温箱培养3-5天，将固体培养基生长好的菌 体刮下，接入步骤1中的培养液培养3天为种子液，再将种子液按I : 10接入40-50L上述培 养液中，23°C _28°C，转速150rpm，振荡培养3-5天获得发酵物，根据需要可用相同方法扩大 到目标培养量；
[0019] 实施例2 :CT_2628菌株对多种植物病原真菌的离体抑菌活性：
[0020] 发酵液采用常规的对峙培养法、抑菌率统计法，靶标菌为在农业生产危害严重的9 种植物病原真菌：稻癌霉菌Pyricularia oryzae、爺链孢菌Alternaria solani、镰孢霉菌 Fusarium oxysporum、灰葡萄抱菌Botrytis cinerea、大而轮枝菌Verticillium dahliae、 芽枝霉菌 Cladosporium fulvum、辣椒疫霉菌 Phytophthora capsici、丝核菌 Rhizoctonia solani赤霉菌Fusarium graminearum进行抑菌测试结果显示如下：
[0021] 表1CT-2628对植物病原菌抑菌活性
[0028] 测试1,简称Tl :对峙培养测试，以抑菌圈大小表示菌株活性，" + "表示抑菌圈为 20-25mm "++"表示抑菌圈为26-30mm "+++"表示抑菌圈为30-35mm ;
[0029] 测试2,简称T2 :对病原菌的抑制率，抑制率=(对照菌落半径-处理菌落半径）/ 对照菌落半径X 100%
[0030] 由上表数据可知，CT-2628菌株对9种农业危害严重的病原真菌，具有很好的抑菌 效果，在对峙培养法中，除丝核菌Rhizoctonia solani赤霉菌Fusarium graminearum抑菌