甲基营养型芽孢杆菌及其应用_2

文档序号:9300418阅读:来源:国知局
测,观察菌含量,直到发酵罐中发酵液中的最终培养物(包含 菌和芽孢)生物量为10scfu/mL以上、芽孢含量大于或等于95%时,立即将发酵液出罐,进 行分装5获得SZ-3微生物制剂;发酵罐中的发酵时间为36~48小时。 根据本发明的微生物制剂,其特征在于,所述的NBP培养液的配方为:牛肉膏3。0g,蛋 白胨U). Og,酵母浸膏5. Og,葡萄糖5. 0g,NaC:丨5. 0g,水!OOOmU pH6. 8~7. 2 ;所述的发酵培 养液的配方以重量百分比计为:玉米粉2. 0%,豆饼粉1. 5 %,淀粉0. 5 %,酵母浸膏0. 2%, NaClS. 0%, MgSO4 * 7H200. 10%,余量为水,pH6. 8 ~7. 0。 根据本发明的微生物制剂,其特征在于,所述的NBP培养液如下配制;称取+肉膏、蛋 白胨、酵母浸膏、葡萄糖、NaCl放入1000 mL水中,充分混匀后将pH调整至6. 8~7, 2, 1000 snL 角瓶中装量为300就培养液,用双层封口膜封好:三角瓶口,121?湿热灭菌30分钟,冷却 后备用。 所述的发酵培养液如下配制:在科子罐中加入所需的水,按比例加入玉米粉、豆饼粉、 淀粉、酵母浸膏、NaCl、MgSO^ 7Η20,充分搅拌,将发酵培养液pH调整到6. 8~7. 0,密封加 料孔,用尚温蒸汽灭 2小时,冷却后?即接种。 根据本发明的的微生物制剂,其特征在于,在种子罐或发酵罐的发酵中,当出现较多 泡沫时,加入消泡剂,所述的消泡剂为有机硅,加入量以种子罐或发酵罐中的泡沫不溢出为 准;发酵罐发酵完成后,在发酵罐中加入占罐中液体总体积万分之二的苯甲酸防腐剂,搅拌 均匀,再出罐进行分装。 本发明还涉及微生物制剂,含有甲基营养型芽孢杆菌SZ-81的全培养液培养物和甲基 营养型芽孢杆菌SZ-81孢子,其可通过以T制备方法制备得到: (丄)将甲基营养型芽孢杆菌SZ-81的试管种接种于用1000 mL三角瓶装的300mL NBP培 养液中,在180r'/min,30°C下培养36小时,获得发酵菌液; (2) 将发酵菌液在以种子罐体积10%接种于种子罐中的发酵培养液中发酵培养,溶氧 量为15~18%,搅拌速度200rpm,科子罐的温度28~32Γ,接种发酵菌液4小时后,每隔 2小时对种子罐中的发酵液进行发酵质量检测,直到发酵液菌体生长比较饱满即将出现芽 孢时,获得发酵菌种,种子罐中的发酵时间为14~18小时: (3) 将种子罐中发酵菌种的10%接种于发酵罐中的NBP培养液中发酵培养,溶氧量为 15~18%,搅拌速度200rpm,发酵罐的温度28~32?,接科发酵菌种4小时后,每隔2小 时对发酵罐进行发酵质量检测,观察菌含量,直到发酵罐中发酵液中的最终培养物(包含 菌和.芽孢)生物量为lOVfu/n1 上以上、芽孢含量大于或等于95%时,立即将发酵液出罐,进 行分装,获得SZ-81微生物制剂;发酵罐中的发酵时间为36~48小时。 根据本发明的含有SZ-8!的微生物制剂,其特征在于,所述的NBP培养液的配方为:牛 肉膏 3. Og,蛋白胨 10.0 g,酵母浸膏 5. Og,葡萄糖 5. 0g,NaCI5. Og,水 1000mL,pH6. 8 ~7. 2 ; 所述的发酵培养液的配方以重量百分比计为:玉米粉2。0 %,豆饼粉1. 5 淀粉0. 5 酵 母浸膏 0, 2 %, NaC18, 0 %, MgSO4 ? 7H200. 10 %,余量为水,pH6. 8 ~7. 0。 根据本发明的所述的微生物制剂,其特征在于,所述的NBP培养液是这样配制的:称取 牛肉膏,蛋白胨、酵母浸膏,葡萄糖、NaCl放入1000 mL水中,充分混匀后将pH调整至6. 8~ 7。2, 1000 mL _三角瓶中装量为300mL培养液,用双层封口膜封好H角瓶口,121?湿热灭菌30 分钟,冷却后备用; 所述的发酵培养液是这样配制的;在种子罐中加入所需的水,按比例加入玉米粉、豆饼 粉,淀粉、酵母浸膏、NaCKMgSO4 ?ΥΙΟ,充分搅拌,将发酵培养液pH调整到6. 8~7. 0,密封 加料孔,用高温蒸汽灭菌2小捋,冷却后立即接种。 根据本发明所述的微生物制剂,其特征在于,在种子罐或发酵罐的发酵过程中,当出现 较多泡沫捋,加入消泡剂,所述的消泡剂为有机硅,加入量以种子罐或发酵罐中的泡沫不溢 出为准:发酵罐发酵完成,在发酵罐中加入占罐中液体M体积万分之-的本甲酸防腐·?H), 搅拌均匀,再出罐进行分装。 本发明还涉及微生物制剂,含有甲基营养型芽孢杆菌SZ-3和SZ-81的全培养液培养 物和?基营养型芽孢杆菌SZ-3和SZ-8i的孢子,其可通过将上述SZ-3微生物制剂和上述 SZ--81微生物制剂混合制备得到,二者的体积比为各占总体积的50%。或者通过以下制备 刀法制备得到: (1) 将甲基营养型芽孢杆菌SZ-3的试管种和甲基营养型芽孢杆菌SZ-81的试管种分别 接种于用1000 mL三角瓶装的300mL NBP培养液中,在!80r/min,30rT培养36小时,获得 发酵菌液; (2) 将SZ-3发酵菌液和SZ-81发酵菌液以各占总体积的50 %混合均匀后,在以种 子罐体积10%接种于种子罐中的发酵培养液中发酵培养,溶氧量为15~18%,搅拌速度 200rpm,种子罐的温度28~32°C ,接种发酵菌液4小时后,每隔2小捋对种子罐中的发酵液 进行发酵旗量检测,直到发酵液菌体生长比较饱满即将出现芽孢时,获得发酵菌种,种子罐 中的发酵时间为14~18小时; (3) 将种子罐中发酵菌种的10%接种于发酵罐中的NBP培养液中发酵培养,溶氧量为 15~18%,搅拌速度200rpm,发酵罐的温度28~32 °C,接种发酵菌种4小时后,每隔2小 时对发酵罐进行发酵质量检测,观察菌含量,直到发酵罐中发酵液中的最终培养物(包含 菌和芽孢)生物量为IO9CfuZmL以上、芽孢含量大于或等于95%时,立即将发酵液出罐,进 行分装,获得SZ-3和SZ-81微生物制剂;发酵罐中的发酵时间为36~48小时。 上述NBP培养液的配方为:年肉膏3. Og,蛋白胨10.0 g,酵母浸膏5. Og,葡萄糖5. Og, NaC〖5. Og,水1000 mUρΗ6. 8~7, 2t,其制备方法为:称取牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、 NaCl放入1000 mL水中,充分混匀后将pH调整至6. 8~7, 2, 1000 mL :三角瓶中装量为300biL 培养液,用双层封□膜封好三角瓶口,m ?湿热灭菌30分钟,冷却后备?。 上述发酵培养液的配方以重量百分比计为:玉米粉2. 0%,豆饼粉1. 5%,淀粉0. 5%, 酵母浸雷0· 2%,NaC18. 0%,MgSO4 * 7.h200, 10%,宋童为水,ρ?].6· 8~7. 0。制备力法刃:在 种子罐中加入所需的水,按比例加入玉米粉、豆馈粉、淀粉、酵母浸膏、NaCI、MgSO4 * 7Η20,充 分拨拌,将发酵培养液pH调整到6. 8~7. 0,密封加料孔,用高温蒸汽灭菌2小时,冷却后立 即接种。 在种子罐或发酵罐的发酵中,当出现较多泡沫时,可以加入消泡剂,所述的消泡剂为有 机硅,加入量以种子罐或发酵罐中的泡沫不溢出为准;发酵罐发酵完成后,在发酵罐中加入 占罐中液体总体积万分之二的苯甲酸防腐剂,搅拌均匀,再出罐进行分装。 通过上述发酵工艺得到的发酵液即为一种微生物杀菌剂。本发明的微生物制剂可以以 稀释液的形式在人参真菌病害发病初期均匀地施加到土壤中,微生物制剂与水的稀释体积 比为1:200。另外,稀释液中还可以添加助剂有机娃,有机硅与稀释液的体积比为1:5000。 含有甲基营养型芽孢杆菌SZ…81的全培养液培养物和甲基营养型芽孢杆菌SZ-81 的孢子的微生物制剂如上所述的应用,其特征在于,所述真菌为腐皮镰孢菌(Fusarium. solani)、人参链格孢菌(Alternaria panax)和人参核盘菌(Sclerotinia schinseng)中 的一种或多种。 本发明的含有甲基营养型芽孢杆菌SZ--3和SZ-~8i的全培养液培养物和甲基营养型芽 孢杆菌SZ-3和SZ-81的孢子的微生物制剂在防治人参真菌病害中的应用。优选地,可以 同时防治引起人参的根腐病的腐皮镰孢菌(F. solani)、引起人参黑斑病的人参链格孢菌 (A. panax)、引起人参菌核病的人参核盘菌(S. schinseng)、引起人参疫病的恶疫霉菌(Ph. cactorum)和引起人参锈腐病的毁灭柱孢菌(C. destructans)中的一种或多种,具有广谱 性,Ji表现出比单一微生物制剂更好的防治效果。 根据本发明,在人参真菌病害发病初期,将所述微生物制剂的稀释液均匀地施加到土 壤中,所述的稀释液中微生物制剂与水的稀释体积比为i : 200。 根据本发明,其特征在于,所述的稀释液中还添加了助剂有机娃,所述助剂有机硅与稀 释液的体积比为1:5000。 本发明的优点在于:保藏号为CGMCC No, 8275和CGMCC No. 8276的甲基营养型芽孢杆 菌SZ-3和SZ-81均对分别由腐皮镰孢菌(F, solani)、人参链格孢菌(A, panax)、人参核盘 菌(S. ginseng)、恶疫霉菌(Ph. cactorum)和毁灭柱孢菌(C. destructans)弓丨起的人参的根 腐病、黑斑病、菌核病、疫病和锈腐病均具有良好的防治效果,并且对人参具有促生长作用, 无毒无致病性,对人畜安全,不污染环境。特别是,SZ-3和SZ-81的混合微生物制剂表现出 比单一微生物制剂更好的防治效果。本发明的生防菌剂稀释后直接施加到土壤中对楦物进 行灌根处理即可发挥其杀菌作用,能显著改善人参根际环境中微生物群落的合理结构,形 成一个生物多样化的人参根际土壤微生态环境,从而有效地、持久地控制人参真菌性病害 的流行。 【附图说明】 图1:本发明的甲基营养型芽孢杆菌SZ-3菌株对人参核盘菌(Sclerotinia schinseng)菌丝的生长平板抑制作用。 图2 :本发明的甲基营养型芽孢杆菌SZ-81菌株对毁灭柱孢菌(Cylindrocarpon destructan s)菌丝的生长平板抑制作羯。 图3 :本发明的甲基营养型芽孢杆菌SZ-81菌株对恶疫霉菌(Phytophthora cactoruin) 菌丝的生长平板抑制作用。 图4 ;本发明的甲基营养型芽孢杆菌SZ-3菌株对腐皮镰孢菌(Fusarium solani)菌丝 的生长平板抑制作用。 图5 :本发明的甲基营养型芽孢杆菌SZ-81菌株对人参链格孢菌(Alternaria panax) 菌丝的生长平板抑制作用。 图6 :本发明的甲基营养型芽孢杆菌SZ-3菌株对人参链格孢菌(Alternaria panax)菌 丝的生长平板抑制作用。 图7 ;:混合发酵液对腐皮镰孢菌引起的人参根腐病的防治效果。 图8 :混合发酵液对恶疫霉菌引起的人参疫病病的防治效果。 图9 :混合发酵液对人参孩盘菌引起的人参菌核病的防治效果。 图10 :混合发酵液对毁灭柱孢菌弓丨起的人参锈腐病的防治效果。 图11 :混合发酵液对人参链格孢菌引起的人参黑斑病的防治效果。 图12 :SZ-3对人参的促生长
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