-3的试管种接种于用1000 mL :三角 瓶装的300mL NBP培养液中，在ISOr/minjOX：下培养36小时,获得发酵菌液； (2) 将发酵菌液在以种子罐体积10%接种于种子罐中的发酵培养液中发酵培养,溶氧 董为15~18%，搅拌速度200:rpro，种子罐的温度28~32*C，接种发酵菌敢4小时后，每隔 2小时对种子罐中的发酵液迸行发酵质量检测,直到发酵液菌体生长比较饱满即将出现芽 孢时，获得发酵菌种，种子罐中的发酵时间为14~18小时； (3) 将种子罐中发酵菌种的10%接种于发酵罐中的NBP培养液中发酵培养,溶氧量为 15~18%,抱样速度200_rpm,发酵罐的温度28~32 C，接神发酵囷种4小时j-rj，每丨邊2小 时对发酵罐进行发酵质量检测，观察菌含量,直到发酵罐中发酵液中的最终培养物（包含 菌和芽孢）生物量为10scfu/mL以上、芽孢含量大于或等于95%时,立即将发酵液出罐，进 行分装,获得SZ-3微生物制剂；发酵罐中的发酵时间为36~48小时。 优选地，所述的NBP培养液的配方为：牛肉膏3. 0g，蛋白胨10. 0g，酵母浸膏5. 0g，葡萄糖5. 0g,NaC:[5. 0g，水丨000mL,p[:!6. 8~7. 2 ;所述的发酵培养液的配方以重量百分比计为： 玉米松 2. 0 >〇 5 显'讲松 1 5 % ,症粉 %,酵?'技胃 0? 2 %，NfiCi8, 0 % ,MgSO4 * /s：].2〇0. 10 少6， 余直为水，pH6, 8~/, 0。 更优选地，所述的NBP培养液是这样配制的：称取牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、蔔萄糖、 NaCl放入1000 mL水中，充分混匀后将pH调整至6. 8~7. 2,丨OOOmL三角瓶中装量为30〇EnL 培养液，用双层封□膜封好:三角瓶口，mt:湿热灭菌30分钟,冷却后备用； 优选地，所述的发酵培养液是这样配制的：在种子罐中加入所需的水,按比例加入玉米 粉、豆饼粉、淀粉、酵母浸膏、NaCl、MgSO4 ? 7H20,充分搅拌,将发酵培养液pH调整到6。8~ 7. 0,密封加料孔，用1?;温蒸汽灭菌2小时，冷却后接种。 特别优选地，在种子罐或发酵罐的发酵中，当出现较多泡沫时，加入消泡剂，所述的消 泡剂为有机娃,加入量以种子罐或发酵罐中的泡沫不溢出为准；发酵罐发酵完成后,在发酵 罐中加入占罐中液体总体积万分之二的苯甲酸防腐剂,搅拌均勾，再出罐进行分装。6. -种微生物制剂,其特征在于,含有权利要求2的甲基营养型芽孢杆菌SZ-81的全培 养液培养物和甲基营养型芽孢杆菌SZ-81的孢子。 7。 如权利要求6所述的微生物制剂，其特征在于，其是通过以_F制备方法制备得到的： (1) 将如权利要求2所述的甲基营养型芽孢杆菌SZ-81的试管种接种于用1000 mL三角 瓶装的300mL NBP培养液中，在180r/mim3(n〕下培养36小时,获得发酵菌液； (2) 将发酵菌液在以种子罐体积10%接种于种子罐中的发酵培养液中发酵培养，溶氧 量为15~18%,搅拌速度200rpm,种子罐的温度28~32T：，接种发酵菌液4小时后,每隔 2小时对科子罐中的发酵液进行发酵质量检测，直到发酵液菌体生长比较饱满即将出现芽 孢时，获得发酵菌种，种子罐中的发酵时间为14~18小时； (3)将种子罐中发酵菌种的10%接种于发酵罐中的NBP培养液中发酵培养，溶氧量为 15~18%，搅拌速度200rpm,发酵罐的温度28~32°C,接种发酵菌种4小时后,每隔2小 时对发酵罐进行发酵质量检测，观察菌含量，直到发酵罐中发酵液中的最终培养物（包含 菌和芽孢）生物量为IC^cfu/mL以上、芽孢货量大于或等于95%时,立即将发酵液出罐，进 打分装，获得SZ_81微生物制剂;发酵罐中的发酵时间为36~48小时。 优选地5所述的NBP培养液的配方为：牛肉膏3,Og,蛋白胨10。Og,酵母浸膏5。Og,葡萄 糖5, 0g,NaC15,Og,水1000 mL,pH6. 8~7. 2 ;所述的发酵培养液的配方以重量H分比计为： 玉米粉 2. 0%,豆饼粉i.5%,淀粉 0, 5%,酵母浸膏 0? 2%，Na,C18. 0%,MgSO4*7H200. 10%, 余量为水KP丨-丨6, 8~L0。 更优选地,所述的NBP培养液是这样配制的：称取牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、蔔萄糖、NaCl放入1000 mL水中，充分混匀后将pH调整至6, 8~7. 2,1000 mL三角瓶中装量为300mL 培养液，用双展封口膜封好三角瓶口，121/C湿热灭菌30分钟，冷却后备用。 优选地，所述的发酵培养液是这样配制的：在种子罐中加入所需的水,按比例加入玉米 粉、豆饼粉、淀粉、酵母浸膏、NaCl、MgSO4 * 7H20,充分搅拌;将发酵培养液pH调整到6. 8~ 7. 0,密封加料孔,用高温蒸汽灭菌2小齡，冷却后立即接种。 特别优选地,在种子罐或发酵罐的发酵过程中，当出现较多泡沫时，加入消泡剂,所述 的消泡剂为有机硅，加入量以种子罐或发酵罐中的泡沫不溢出为准；发酵罐发酵完成后,在 发酵罐中加入占罐中液体总体积万分之二的苯甲酸防腐剂，搅拌均匀，再出罐进行分装。8. -种微生物制剂,其特征在于，含有甲基营养型芽孢杆菌SZ-3和SZ-_8〗_的全培养液 培养物和甲基营养型芽孢杆菌SZ-3和SZ-81的孢子。 优选地,所述生物制剂是通过以下制备方法制备得到的：将如权利要求4或5中任一项 所述的微生物制剂和如权利要求6或7中任一项所述的微生物制剂混合，二者的体积比为 各占总体积的50%。或者，所述生物制剂是通过以卜制备力法制备得到的： (1) 将如权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌SZ-3的试管种和如权利要求2所述的 甲基营养型芽孢杆菌SZ-81的试管种分别接种于用1000 mL :三角瓶装的300mL NBP培养液 中，在180r/min,3(rC下培养36小射，获得发酵菌液； (2) 将SZ-3发酵菌液和SZ-81发酵菌液以各占总体积的50%混合均匀后，在以种 子罐体积10%接种于种子罐中的发酵培养液中发酵培养，溶氧量为15~丨8%,搅拌速度 200rpm，种子罐的温度28~32°C，接种发酵菌液4小时后,每隔2小捋对种子罐中的发酵液 进行发酵质量检测,直到发酵液菌体生长比较饱满即将出现芽孢时,获得发酵菌种，种子罐 中的发酵时间为14~18小时； (3) 将种子罐中发酵菌种的10%接种于发酵罐中的NBP培养液中发酵培养，溶氧量为 15~18%，搅拌速度200rpm,发酵罐的温度28~32°C,接种发酵菌种4小时后,每隔2小 时对发酵罐进行发酵质量检测，观察菌含量，直到发酵罐中发酵液中的最终培养物（包含 菌和芽孢）生物量为IC^cfu/mL以上、芽孢货量大于或等于95%时,立即将发酵液出罐，进 行分装,获得SZ--3和SZ-81微生物制剂；发酵罐中的发酵时间为36~48小时。 优选地5所述的NBP培养液的配方为：牛肉膏3, Og,蛋白胨10。Og,酵母浸膏5。Og,葡萄 糖5, 0g, NaC15, Og,水1000 mL, pH6. 8~7. 2 ;所述的发酵培养液的配方以重量H分比计为： 玉米粉 2. 0%,豆饼粉 i. 5%,淀粉 0, 5%,酵母浸膏 0? 2%，Na,C18. 0%, MgSO4 * 7H200. 10%, 余量为水KP丨-丨6,8~L0。 更优选地,所述的NBP培养液是这样配制的：称取牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、蔔萄糖、 NaCl放入1000 mL水中，充分混匀后将pH调整至6, 8~7. 2, 1000 mL三角瓶中装量为300mL 培养液，用双展封口膜封好三角瓶口，121/C湿热灭菌30分钟，冷却后备用； 还更优选地,所述的发酵培养液是这样K制的：在种子罐中加入所需的水，按比例加 入玉米粉、豆饼粉、淀粉、酵母浸膏、NaC:U MgSO4 * 7H20,充分搅拌,将发酵培养液pH调整到 6. 8~7. 0,密封加料孔,用高温蒸汽灭菌2小时,冷却后立即接种。 特别优选地，在种子罐或发酵罐的发酵过程中，当出现较多泡沫时，加入消泡剂，所述 的消泡剂为舍机娃，加人重以种子罐或发酵罐中的泡沫不溢出为准；发酵罐发酵完成泪，在 发酵罐中加入占罐中液体总体积万分之二的苯甲酸防腐剂，搅拌均匀，再出罐进行分装。9. 如权利要求4-7中任一项所述的微生物制剂在防治人参真菌病害中的应用。 优选地，所述真菌为腐皮镰孢菌（Fusa+rium. solani)、人参链格孢菌（Alternaria panax)和人参核盘菌（Sclerotirda schinseng)中的一?种或多种。 优选地5其特征在于，所述真菌为毁灭柱孢菌（Cylindrocarpon. destructans)、恶疫霉 菌（Phytophthora cactorum)和人参链格孢菌（Alternaria panax)中的一种或多种。 还优选地,在人参真菌病害发病初期,将所述微生物制剂的稀释液均匀地施加到土壤 中，所述的稀释液中微生物制剂与水的稀释体积比为1:200。 更优选地，所述的稀释液中还添加了助剂有机娃,所述助剂有机硅与稀释液的体积比 为 i:5000。10.如权利要求8所述的微生物制剂在防治人参=具H'柄害中的应用。 优选地，所述真菌为腐皮镰孢菌（Fusariura. solani)、毁灭柱孢菌（Cylindrocarpon. destructans)、恶疫霉菌（Phytophthora cactorum)、人参链格抱菌（Alternaria pa.nax)和 人参核盘菌（Sclerotinia schinseng)中的一种或多种。 还优选地,在人参真菌病害发病初期,将所述微生物制剂的稀释液均匀地施加到土壤 中，所述的稀释液中微生物制剂与水的稀释体积比为1:200。 更优选地，所述的稀释液中还添加了助剂有机娃,所述助剂有机硅与稀释液的体积比 为 i:5000。
【专利摘要】本发明提供甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus？methylotrophicus)SZ-3和SZ81，其保藏号分别为CGMCC？No.8275和CGMCC？No.8276。甲基营养型芽孢杆菌SZ-3对引起人参根腐病，黑斑病和菌核病的病原菌均具有显著拮抗作用。甲基营养型芽孢杆菌SZ-81对引起人参疫病、锈腐病和黑斑病的病原菌均具有显著拮抗作用。本发明还提供甲基营养型芽孢杆菌SZ-3和SZ81在防治植物真菌病害中的应用，或在制备防治植物真菌病害的微生物制剂中的应用。<pb pnum="1" />CGMCC No827620130925
【IPC分类】A01N63/02, A01P3/00, A01N63/00, C12N1/20, C12R1/07
【公开号】CN105018366
【申请号】CN201410163871
【发明人】杨利民, 孙卓, 韩梅, 张永刚, 刘翠晶
【申请人】吉林农业大学
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2014年4月22日