油脂降解菌群的制备方法及其应用

油脂降解菌群的制备方法及其应用
【专利摘要】本发明涉及生物降解处理技术领域，旨在提供一种油脂降解菌群的制备方法及其应用。油脂降解菌群的制备方法包括：将采集自餐厨泔脚垃圾油脂废水区的沉积物样品和油脂加入液体无机盐培养基中，在30℃、转速150r/min的搅拌条件下培养5天；按相同方法进行重复再培养2次后，最终得到的液体为含有油脂降解菌群的菌液；通过DNA测序确认，油脂降解菌群中包括嗜麦芽窄食单胞菌、金黄杆菌、无色杆菌和肠杆菌。本发明就地取样(低成本)，用简便快捷的方法富集筛选到油脂降解菌群，可有效地对餐厨泔脚垃圾油脂废水区的油脂废水进行降解；在与表面活性剂共同作用下对餐厨泔脚垃圾油脂废水区的油脂废水处理时，其降解效率大大提高。
【专利说明】
油脂降解菌群的制备方法及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物降解处理技术领域，具体涉及一种油脂降解菌群的筛选方法及其 与表面活性剂共同作用下对餐厨泔脚垃圾油脂废水区的油脂废水处理的应用。
【背景技术】
[0002] 随着我国经济的快速发展以及旅游业的不断兴起。近年来农家乐的数量正迅猛增 加，排放的泔脚垃圾(剩菜剩饭)及洗涤废水也越来越多。其成分复杂，有机含量高，首当其 冲：油脂。这类有机物如不经处理而排放到江河湖泊中，会对环境造成污染，油脂漂浮在水 面形成油膜，阻碍氧气传输，威胁水生动植物的生存。
[0003] 目前，生物处理方法来降解油脂废水是极具发展前景。利用微生物的生命活动过 程对油脂废水进行转移和转化，将油脂作为其生长所需的碳源和能源，并在酶的作用下水 解成甘油和脂肪酸，最终降解为H 20和C02等代谢产物，且具有成本低，无二次污染优点，而倍 受青睐。因此制备高效降解油脂菌以用于含油废水的处理，是一项非常有意义的工作，正广 泛受到国内外学者的重视。
[0004]同时，由于油脂多属于疏水性有机物，提尚油脂溶解于水中的含量能够提尚油脂 降解菌群的降解效率。一般降解菌群在降解过程中会产生生物表面活性剂，对疏水有机物 起到增溶、乳化的作用。但是微生物自身分解表面活性剂效率较低，所以通过外加表面活性 剂的形式促进其降解是一种可行方法，并且表面活性剂的种类也是很多的。
[0005] 虽然表面活性剂可以提高疏水性有机物在水系中的溶解度，不过，大多数表面活 性剂对于微生物都有毒性影响。若过低的表面活性剂浓度达不到临界胶束浓度而不能起到 增溶、乳化的作用，若过高的表面活性剂浓度又会毒害微生物。
[0006] 所以，研究不同种类、不同浓度的表面活性剂与微生物共同作用下的修复效果具 有非常重要的意义。

【发明内容】

[0007] 本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种油脂降解菌群的 制备方法及其在油脂废水处理中的应用。
[0008] 为解决技术问题，本发明的解决方案是：
[0009] 提供一种油脂降解菌群的制备方法，包括以下步骤：
[0010] (lM_65mgK2HP〇4、25.5mgKH2P〇4、133.8mgNa2HP〇4.12H2〇、500mgNH4Cl、82.5mg CaCl2、67.5mg MgS(k · 7H2〇、0.75mg FeCl3 · 6H2O与 1000mL去离子水进行混合；调节PH值为 7.0后，在121°C温度下灭菌20min，得到液体无机盐培养基；
[0011] (2)取5g采集自餐厨泔脚垃圾油脂废水区的沉积物样品，将其加入前述液体无机 盐培养基中，再加入占总体积〇. 5 %的采集自餐厨泔脚垃圾油脂废水区的油脂;然后将混合 物放置于恒温振荡箱中，在30°C、转速150r/min的搅拌条件下培养5天；
[0012] (3)按步骤（1)中所述方法获得新的液体无机盐培养基，取10ml步骤(2)中所得培 养液转移至新的液体无机盐培养基中，再加入占总体积ο. 5 %的所述采集自餐厨泔脚垃圾 油脂废水区的油脂;然后将混合物放置于恒温振荡箱中，保持温度30°C、转速150r/min的搅 拌条件下培养5天；
[0013] (4)取10mL步骤(3)中所得培养液，按照步骤(3)的方法进行再培养;重复再培养2 次后，最终得到的液体为含有油脂降解菌群的菌液；
[0014] (5)对油脂降解菌群进行16SrDNA分子鉴定以确定其菌群结构，通过DNA测序确认， 油脂降解菌群中包括嗜麦芽窄食单胞菌（stenotrophomonas)，金黄杆菌 ((^5^6(^(^1'；[11111)，无色杆菌（&(3]11'01]10匕&(^1')和月易杆菌（611七61'0匕&(^1^06&6) 〇
[0015] 本发明中，在不考虑步骤(4)所得菌液中的水分和矿物质的前提下，组成油脂降解 菌群的各组分质量占比分别是:嗜麦芽窄食单胞菌为45.38%，金黄杆菌为18.29%，无色杆 菌为15.82%，肠杆菌为14.43%，不动杆菌、人苍白杆菌及伯克氏菌占6.08%。
[0016] 本发明进一步提供了利用前述油脂降解菌群处理餐厨泔脚垃圾油脂废水区的油 脂废水的方法，是将该油脂降解菌群与表面活性剂共同作用以实现对餐厨泔脚垃圾油脂废 水区的油脂降解;具体步骤为：
[0017] (lM_65mgK2HP〇4、25.5mgKH2P〇4、133.8mgNa2HP〇4.12H2〇、500mgNH4Cl、82.5mg CaCl 2、67.5mg MgS〇4 · 7H20、0.75mg FeCl3 · 6H2O与 1000mL去离子水进行混合；然后调节pH 值为7.0，并在121°C温度下灭菌20min，得到液体无机盐培养基；
[0018] (2)取50mL液体无机盐培养基和2mL所述油脂降解菌群，放入到100mL的三角瓶中； 在该三角瓶中加入占总体积0.5%的餐厨泔脚垃圾油脂废水区的油脂后，再加入lmL表面活 性剂;将混合物放置在恒温振荡箱中，在30°C、转速150r/min的搅拌条件下培养3天，使所加 入的餐厨泔脚垃圾油脂废水区的油脂降解。
[0019] 本发明中，所述表面活性剂是下述任意一种:非离子表面活性剂、阴离子表面活性 剂、生物表面活性剂、非/阴离子表面活性剂或生物/阴表面活性剂。
[0020] 本发明中，所述非离子表面活性剂是浓度为22.27mg//L的聚氧乙烯脱水山梨醇单 油酸酯(Tw-80)。
[0021] 本发明中，所述阴离子表面活性剂是浓度2500mg/L的十二烷基硫酸钠(SDS)。
[0022]本发明中，所述生物表面活性剂是浓度1000mg/L的皂角苷。
[0023] 本发明中，所述非/阴离子表面活性剂是聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯与十二烷 基硫酸钠混合液(Tw-80+SDS)，其中聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯与十二烷基硫酸钠混合 液的摩尔比为1:30，聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯的浓度为26.30mg/L。
[0024] 本发明中，所述生物/阴表面活性剂是皂角苷与十二烷基硫酸钠混合液(皂角苷+ S D S )，其中皂角苷与十二烷基硫酸钠混合液的质量比为5 : 5，总的表面活性剂的浓度为 1000mg/L〇
[0025] 本发明与现有技术相比，其有益效果是：
[0026] 1、本发明就地取样(低成本），用简便快捷的方法富集筛选到油脂降解菌群，可有 效地对餐厨泔脚垃圾油脂废水区的油脂废水进行降解；
[0027] 2、本发明在与表面活性剂共同作用下对餐厨泔脚垃圾油脂废水区的油脂废水处 理时，其降解效率大大提高；
[0028] 3、本发明确定了油脂降解菌群与不同种类及不同浓度地表面活性剂共同作用对 餐厨泔脚垃圾油脂废水区的油脂废水降解效率有所差异性。
【附图说明】
[0029] 图1本发明中从样品中富集筛选的油脂降解菌群的降解效果示意图（空白组）；
[0030] 图2本发明中油脂降解菌群结构示意图；
[0031] 图3本发明中油脂降解菌群分别与表面活性剂Tw-80(C1、C2、C3)共同作用下降解餐 厨泔脚垃圾油脂废水区的油脂废水的降解率示意图（ C1浓度= 20.00mg/L、c2浓度= 22 · 27mg/L、C3浓度=26 · 30mg/L);
[0032] 图4本发明中油脂降解菌群分别与表面活性剂Tw_80、SDS、皂角苷共同作用下降解 餐厨泔脚垃圾油脂废水区的油脂废水的降解率示意图（浓度分别为26.30mg/L、2500mg/L、 1000mg/L)；
[0033] 图5本发明中油脂降解菌群分别与混合表面活性剂(Tw-80+SDS、皂角苷+SDS)共同 作用下降解餐厨泔脚垃圾油脂废水区的油脂废水的降解率示意图。
【具体实施方式】
[0034] 本发明所述油脂降解菌群的制备方法，包括如下具体步骤：
[0035] (lM_65mgK2HP〇4、25.5mgKH2P〇4、133.8mgNa2HP〇4.12H2〇、500mgNH4Cl、82.5mg CaCl 2、67.5mg MgS〇4 · 7H20、0.75mg FeCl3 · 6H2O与 1000mL去离子水进行混合；调节pH值为 7.0后，在121°C温度下灭菌20min，得到液体无机盐培养基；
[0036] (2)取5g采集自餐厨泔脚垃圾油脂废水区的沉积物样品，将其加入前述液体无机 盐培养基中，再加入占总体积〇. 5 %的餐厨泔脚垃圾油脂废水区的油脂;然后将混合物放置 于恒温振荡箱中，在30°C、转速150r/min的搅拌条件下培养5天；
[0037] (3)按步骤（1)中所述方法获得新的液体无机盐培养基，取10ml步骤(2)中所得培 养液转移至新的液体无机盐培养基中，再加入占总体积〇. 5%的餐厨泔脚垃圾油脂废水区 的油脂;然后将混合物放置于恒温振荡箱中，保持温度30°C、转速150r/min的搅拌条件下培 养5天；
[0038] (4)取10mL步骤(3)中所得培养液，按照步骤(3)的方法进行再培养;重复再培养2 次后，最终得到的液体为含有油脂降解菌群的菌液；
[0039] (5)对该油脂降解菌群进行16SrDNA分子鉴定以确定其菌群结构，通过DNA测序确 认油脂降解菌群主要有以下四种菌属：嗜麦芽窄食单胞菌（8七611〇1：1'(^11〇1]1〇1^8:45.38%)， 金黄杆菌（chryseobacterium: 18 · 29 % )，无色杆菌（achromobacter :15.82%)，肠杆菌 (enterobacteriaceae: 14.43%);不动杆菌、人苍白杆菌及其他菌属占6.08%。这是在不考 虑步骤(4)所得菌液中的水分和矿物质的前提下，组成油脂降解菌群的各组分质量占比。
[0040] 利用前述油脂降解菌群处理油脂废水的方法，是将该油脂降解菌群与表面活性剂 共同作用以实现对餐厨泔脚垃圾油脂废水区的油脂降解;具体步骤为：
[0041] (lM_65mgK2HP〇4、25.5mgKH2P〇4、133.8mgNa2HP〇4.12H2〇、500mgNH4Cl、82.5mg CaCl 2、67.5mg MgS〇4 · 7H20、0.75mg FeCl3 · 6H2O与 1000mL去离子水进行混合；然后调节pH 值为7.0，并在121°C温度下灭菌20min，得到液体无机盐培养基；
[0042] (2)取50mL液体无机盐培养基和2mL所述油脂降解菌群，放入到lOOmL的三角瓶中； 在该三角瓶中加入占总体积0.5%的餐厨泔脚垃圾油脂废水区的油脂后，再加入lmL表面活 性剂;将混合物放置在恒温振荡箱中，在30°C、转速150r/min的搅拌条件下培养3天，使所加 入的餐厨泔脚垃圾油脂废水区的油脂降解。
[0043] 实施例1:
[0044]本例用油脂降解菌群与表面活性剂Tw-80(C1浓度、c2浓度、C3浓度)共同作用降解 采集自餐厨泔脚垃圾油脂废水区的油脂，具体步骤如下：
[0045]取所述液体无机盐培养基50mL，取所述油脂降解菌群2mL，一并放入到100mL的三 角瓶中；然后在该三角瓶中加入含有总体积0.5%的餐厨泔脚垃圾油脂废水区的油脂;再加 入表面活性剂Tw-80 (C1浓度、c2浓度、C3浓度）lmL;放置在恒温振荡箱中，保持在温度30 °C、 转速150r/min条件下进行培养以降解所加入的餐厨泔脚垃圾油脂废水区的油脂含量。 [0046] 按上述步骤设置三角瓶，分成三组;三组处理对应加入如下表所设置不同浓度的 不同表面活性剂，除加入的表面活性剂不同，其余条件均相同：
[0047] 表1 C1浓度Tw-80、c2浓度Tw-80、c3浓度Tw-80实验组设计
[0048]
[0049] 培养过程中，每隔12h采用破坏性取样(样品体积全部倒入容器中进行称重试验） 的方式，共取样3天。用称重法测定其餐厨泔脚垃圾油脂废水区的油脂含量。
[0050] 用称重法测锥形瓶体系中油脂含量的变化，并检验其降解效果。向培养的三角瓶 中添加三氯甲烷10mL，于分馏烧瓶中萃取2次，合并萃取液，于70°C下水浴加热去除溶剂，重 量法测定水样中油脂的含量，计算油脂的降解率。初始加入的油脂质量为mo,初始三角瓶重 量血，水浴、蒸干后三角瓶重量m 2，则三角瓶体系中的油脂重量为mzim-nn，油脂的降解率为 v= (m〇-m)/m〇〇
[0051] 本例中，油脂降解菌群与Tw-80共同作用降解餐厨泔脚垃圾油脂废水区的油脂废 水，使用20.00mg/L、22.27mg/L、26.30mg/L浓度的Tw-80，使用浓度均在该表面活性剂的临 界胶束浓度以上。作用3天油脂达到的降解效率分别为62.39%、75.46%、61.47%。其中 22.27mg/L的Tw-80与菌群共同作用降解效果最好，降解效率达到75.46%。
[0052] 实施例2:
[0053]本例用油脂降解菌群分别与表面活性剂Tw_80、SDS、皂角苷共同作用降解采集自 餐厨泔脚垃圾油脂废水区的油脂，具体步骤如下：
[0054]取所述液体无机盐培养基50mL，取所述油脂降解菌群2mL，一并放入到100mL的三 角瓶中；然后在该三角瓶中加入含有总体积0.5%的餐厨泔脚垃圾油脂废水区的油脂;再加 入表面活性剂lmL;放置在恒温振荡箱中，保持在温度30°C、转速150r/min条件下进行培养 以降解所加入的餐厨泔脚垃圾油脂废水区的油脂含量。
[0055] 按上述步骤设置三角瓶，分成三组;三组处理对应加入如下表所设置不同浓度的 不同表面活性剂，除加入的表面活性剂不同，其余条件均相同：
[0056] 表2 Tw-80、SDS、皂角苷实验组设计
[0057]
[0058]
[0059] 培养过程中，每隔12h采用破坏性取样的方式，共取样3天。用称重法测定其餐厨泔 脚垃圾油脂废水区的油脂含量。
[0060] 用称重法测锥形瓶体系中油脂含量的变化，并检验其降解效果。具体步骤与实例1 相同。
[0061] 本例中，油脂降解菌群分别与Tw_80、SDS、皂角苷共同作用降解餐厨泔脚垃圾油脂 废水区的油脂废水，使用浓度均在表面活性剂的临界胶束浓度以上。达到的降解效率分别 为61.47%、60.31 %、83.21 %。其中皂角苷与菌群共同作用降解效果最好，降解效率达到 83.21%〇
[0062] 实施例3:
[0063]本例用油脂降解菌群分别与混合表面活性剂(Tw_80+SDS、SDS+皂角苷)共同作用 降解采集自餐厨泔脚垃圾油脂废水区的油脂，具体步骤如下：
[0064]取所述液体无机盐培养基50mL，取所述油脂降解菌群2mL，一并放入到100mL的三 角瓶中；然后在该三角瓶中加入含有总体积0.5%的餐厨泔脚垃圾油脂废水区的油脂;再加 入表面活性剂(Tw-80+SDS、SDS+皂角苷）lmL;放置在恒温振荡箱中，保持在温度30 °C、转速 150r/min条件下进行培养以降解所加入的餐厨泔脚垃圾油脂废水区的油脂含量。
[0065] 按上述步骤设置三角瓶，分成三组;三组处理对应加入如下表所设置不同浓度的 不同表面活性剂，除加入的表面活性剂不同，其余条件均相同：
[0066] 表3 Tw-80+SDS、SDS+皂角苷实验组设计
[0067]
[0068] 培养过程中，每隔12h采用破坏性取样的方式，共取样3天。用称重法测定其餐厨泔 脚垃圾油脂废水区的油脂含量。
[0069] 用称重法测锥形瓶体系中油脂含量的变化，并检验其降解效果。具体步骤与实例1 相同。
[0070] 本例中，石油降解菌群分别与混合表面活性剂(Tw-80+SDS、SDS+皂角苷)联合降解 餐厨泔脚垃圾油脂废水区的油脂废水，使用浓度均在表面活性剂的临界胶束浓度以上。达 到的降解效率分别为82.83%和89.25%。其中两种混合表面活性剂与菌群联合降解效果都 明显，降解效率达到82.83%和89.25%。
【主权项】
1. 一种油脂降解菌群的制备方法，其特征在于，包括如下具体步骤： (1) 将65mg K2HP〇4、25.5mg KH2P〇4、133.8mg Na2HP〇4·12H20、500mg NH4Cl、82.5mg CaCl2、67.5mg MgS〇4 · 7H20、0.75mg FeCl3 · 6H2O与1000 mL去离子水进行混合；调节pH值为 7.0后，在121°C温度下灭菌20min，得到液体无机盐培养基； (2) 取5g采集自餐厨泔脚垃圾油脂废水区的沉积物样品，将其加入前述液体无机盐培 养基中，再加入占总体积〇. 5%的采集自餐厨泔脚垃圾油脂废水区的油脂;然后将混合物放 置于恒温振荡箱中，在30°C、转速150r/min的搅拌条件下培养5天； (3) 按步骤（1)中所述方法获得新的液体无机盐培养基，取IOml步骤(2)中所得培养液 转移至新的液体无机盐培养基中，再加入占总体积〇. 5 %的所述采集自餐厨泔脚垃圾油脂 废水区的油脂;然后将混合物放置于恒温振荡箱中，保持温度30°C、转速150r/min的搅拌条 件下培养5天； (4) 取IOmL步骤(3)中所得培养液，按照步骤(3)的方法进行再培养;重复再培养2次后， 最终得到的液体为含有油脂降解菌群的菌液； (5) 对油脂降解菌群进行16SrDNA分子鉴定以确定其菌群结构，通过DNA测序确认，油脂 降解菌群中包括嗜麦芽窄食单胞菌（stenotrophomonas)，金黄杆菌（chryseobacterium)， 无色杆菌（&(：111'01]1(^(^1')和肠杆菌（611七61'(^(^1^06&6) 〇2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在不考虑步骤(4)所得菌液中的水分和矿 物质的前提下，组成油脂降解菌群的各组分质量占比分别是：嗜麦芽窄食单胞菌为 45.38 %，金黄杆菌为18.29 %，无色杆菌为15.82 %，肠杆菌为14.43 %，不动杆菌、人苍白杆 囷及伯克氏囷占6.08%。3. 利用权利要求1所述油脂降解菌群处理采集自餐厨泔脚垃圾油脂废水区的油脂的方 法，其特征在于，是将该油脂降解菌群与表面活性剂共同作用以实现对所述油脂的降解;具 体步骤为： (1) 将65mg K2HP〇4、25.5mg KH2P〇4、133.8mg Na2HP〇4·12H20、500mg NH4Cl、82.5mg CaCl2、67.5mg MgS〇4 · 7H20、0.75mg FeCl3 · 6H2O与1000 mL去离子水进行混合；然后调节pH 值为7.0，并在121°C温度下灭菌20min，得到液体无机盐培养基； (2) 取50mL液体无机盐培养基和2mL所述油脂降解菌群，放入到IOOmL的三角瓶中；在该 三角瓶中加入占总体积0.5%的采集自餐厨泔脚垃圾油脂废水区的油脂后，再加入ImL表面 活性剂;将混合物放置在恒温振荡箱中，在30°C、转速150r/min的搅拌条件下培养5天，使所 加入的油脂降解。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述表面活性剂是下述任意一种：非离子 表面活性剂、阴离子表面活性剂、生物表面活性剂、非/阴离子表面活性剂或生物/阴表面活 性剂。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述非离子表面活性剂是浓度为22.27mg/ L的聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述阴离子表面活性剂是浓度2500mg/L的 十^烷基硫酸纳。7. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述生物表面活性剂是浓度1000mg/L的皂 角苷。8. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述非/阴离子表面活性剂是聚氧乙烯脱 水山梨醇单油酸酯与十二烷基硫酸钠混合液，其中聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯与十二烷 基硫酸钠混合液的摩尔比为1:30，聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯的浓度为26.30mg/L。9. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述生物/阴表面活性剂是皂角苷与十二 烷基硫酸钠混合液，其中皂角苷与十二烷基硫酸钠混合液的质量比为5:5，总的表面活性剂 的浓度为l〇〇〇mg/L。
【文档编号】C12R1/01GK105907666SQ201610254888
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月22日
【发明人】赵和平, 钟亮, 温丽莲, 张吟, 陈嘉娴
【申请人】浙江大学