一种用于养殖池塘有机磷分解的解淀粉芽孢杆菌psbhy-3及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种用于养殖池塘有机磷分解的解淀粉芽孢杆菌PSBHY?3，该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，保藏名称为解淀粉芽孢杆菌PSBHY?3(Bacillus amyloliquefaciens PSBHY?3)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期：2015年4月28日，保藏编号：CCTCC NO：M 2015260。本发明中的解淀粉芽孢杆菌菌株PSBHY?3具有较强的解有机磷能力；还公开了上述用于养殖池塘有机磷分解的解淀粉芽孢杆菌PSBHY?3在降解养殖池塘沉积物中的有机磷中的应用。CCTCC NO： M 201526020150428
【专利说明】
一种用于养殖池塘有机磷分解的解淀粉芽孢杆菌PSBHY-3及 其应用
技术领域
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种用于养殖池塘有机磷分解的解淀粉芽 孢杆菌PSBHY-3及其应用。
【背景技术】
[0002] 磷是养殖池塘微藻生长必需的营养元素之一(Jana，2007)。在养殖生产过程中，为 在养殖水体中营造优良的藻相和良好的生态环境，通常需施加磷肥以促进浮游微藻的生长 (Hu et al.，2010)。然而，磷元素进入池塘后，大多成为难溶性磷沉积在底泥中，其底泥沉 积量可占总输出量的50%以上(齐振雄等，1998;常杰等，2006)，只有极小部分参与到池塘 生态系统的磷循环，导致水体活性磷含量低，磷利用效率低下，磷循环受阻，这样既造成池 塘底质污染，又导致水体营养失衡(刘孝竹等，2009;Briggs，1994)。
[0003] 研究表明，微生物是控制和影响底泥释磷的重要因素之一（Goedkoop and Pettersson，2000 ;Tomblom and Rydin，1998)，解磷菌具有将难溶性磷转化为可利用磷的 功能(Maitra et al.，2015;P6rez et al.，2007)。近年来的研究证实在养殖池塘底泥中存 在可分解难溶性磷的菌株，但数量较少(Clavero，1999;胡晓娟，2010)。如11 &和?&丨61(1984) 对不同养殖模式鱼池中解磷菌的数量调查中发现，底泥中解磷菌数量少且受到投入的肥料 量及底泥中有机质含量等的影响。正因为养殖池塘中解磷菌数量稀少，不足以转化池底的 沉积磷，所以应考虑分离筛选高效解磷菌株，通过外源施加，将沉积在底部的难溶性磷释放 出来，加速池塘养殖系统中的磷循环，以解决养殖池塘底泥总磷含量高而水体有效磷含量 低的问题。
[0004] 目前，对解磷菌的研究多集中于种植业，分离筛选高效解磷菌株，用以提高农作物 或其他植物对磷肥的利用率（Amanullah and Adil，2015;Poonguzhali et al. ,2008)。 Anandham等（2007)从根际土壤中分离到的菌株Burkholderia sp.，其48h的解无机磷能力 高达363mg/L。李文红和施积炎（2006)分离得到的两株解有机磷菌具有较强的分解有机磷 的能力，培养3d后培养液中水溶性磷含量比对照增加38.53和64.53倍。Bakhshandeh等 (2015)通过在水稻种植过程中施用高效解磷菌，大幅减少了化肥的使用量(约67%)，提高 了肥料的利用效率。由此可见，分离筛选高效解磷菌，并在农业生产中施用，可达到促进磷 循环、提高磷利用率的目标。
[0005] 解磷菌在水产养殖中的应用尚少见报道(Jana et al. ,2007)。养殖池塘环境与种 植土壤环境存在巨大差异，环境营养、人工技术措施等均不具可比性。因此，本发明拟进行 用于水产养殖中的解磷菌方面的研究。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种用于养殖池塘有机磷分解的解淀粉芽孢杆菌PSBHY-3,该菌株具有高效降解有机磷的能力，并可在养殖池塘中应用。
[0007] 本发明的目的还在于提供上述用于养殖池塘有机磷分解的解淀粉芽孢杆菌 PSBHY-3在降解养殖池塘沉积物中的有机磷的应用。
[0008] 本发明的第一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种用于养殖池塘有机磷分 解的菌株PSBHY-3,该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，保藏名称为 解淀粉芽抱杆菌?313]^-3(1^(3；[11113&1]171〇119116€&(^6113?313]^-3)，保藏单位：中国典型培 养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期：2015年4月28日，保藏编号:CCTCC NO:Μ 2015260。
[0009] 本发明中的解淀粉芽孢杆菌菌株PSBHY-3的筛选分离鉴定过程为:从对虾养殖池 塘采集泥样，通过涂布于有机磷固体平板(有机磷固体培养基），分离筛选溶磷圈较大的菌 落。再通过液体复筛，筛选出解磷效果最好的菌株。对菌株进行菌种鉴定，明确在不同温度、 盐度和pH条件下菌株的解磷效果。
[0010] 本发明的第二个目的是通过以下技术方案来实现的：上述用于养殖池塘有机磷分 解的解淀粉芽孢杆菌PSBHY-3在降解养殖池塘沉积物中的有机磷中的应用。
[0011] 本发明中的解淀粉芽孢杆菌PSBHY-3分离于对虾养殖池塘，并对养殖池塘沉积物 具有良好的解磷效果，可在养殖池塘环境中应用。
[0012] 本发明与现有技术相比具有以下优点：
[0013] (1)本发明中的解淀粉芽孢杆菌菌株PSBHY-3具有高效降解有机磷的能力；
[0014] (2)本发明中的解淀粉芽孢杆菌菌株PSBHY-3作用于养殖池塘沉积物取得良好效 果，能有效促进池塘沉积磷分解为可溶性磷酸盐。
【附图说明】
[0015] 图1是实施例5中水体活性磷酸盐含量的变化；
[0016] 图2是实施例5中实验结束时各组底泥总磷含量的比较。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合实例对本发明做进一步说明。
[0018] 实施例1用于养殖池塘有机磷分解的解淀粉芽孢杆菌菌株PSBHY-3的筛选方法
[0019] -、材料准备
[0020] 1、菌株来源
[0021 ]取自广东茂名某对虾养殖场对虾养殖池塘沉积物。
[0022] 2、培养基
[0023]有机磷固体培养基：葡萄糖 10.0g，（NH4)2S〇4 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MgS〇4 · 7H20 0.3g，FeS〇4.7H20 0.03g，MnS〇4.4H20 0.03g，琼脂20.0g，蒸馏水 1000mL，pH 7.0,灭 菌后冷却到60 °C左右加入1 OmL蛋黄配制液(生理盐水:蛋黄液=1:1)。
[0024]有机磷液体培养基：葡萄糖 10.0g，MgCl2 · 6H20 5.0g，MgS〇4 · 7H20 0.25g，KCl 0.2g，（NH4)2S〇4 O.lg，蒸馏水1000mL，pH 7.0,灭菌后冷却到60°C左右加入lOmL的蛋黄配制 液。
[0025]二、菌株的分离与筛选 [0026] 1.解磷菌的初筛
[0027] 准确称取lOg对虾养殖池塘底泥样品，置于装有90mL无菌水及适量玻珠的250mL三 角瓶中，摇床震荡30min，十倍梯度稀释，取合适的稀释度涂布到有机磷固体平板，30°C培养 4d。选取有溶磷圈的菌落，划线纯化，获得单个纯菌落，划线于营养琼脂斜面保存。菌株 PSBHY-3在初筛中表现出较强的溶磷能力，其在有机磷固体平板上溶磷圈的直径比可达 4.00以上。
[0028] 2.解磷菌的复筛
[0029]将菌株PSBHY-3的单菌落接种到装有50mL营养肉汤培养液的三角瓶中，置于转速 为150~200r/min，温度30°C摇床培养24h。取lmL培养液接种至装有100mL有机磷液体培养 基的三角瓶中，对照组接入等量无菌水，置于转速为150~200r/min，温度30°C摇床培养5d， 实验结束时取培养液测定活性磷含量以进一步评价菌株的溶磷能力。结果表明，经过5d的 培养，菌株PSBHY-3的培养液中的活性磷含量分别为56.85mg/L，显著高于对照组(4.06mg/ L)(P〈0.05)〇
[0030] 通过初筛和复筛，得到具有解有机磷能力的菌株PSBHY-3。
[0031] 实施例2用于养殖池塘有机磷分解的解淀粉芽孢杆菌菌株PSBHY-3的鉴定 [0032]本发明对具有有机磷分解能力的菌株PSBHY-3进行了16S rDNA分子生物学鉴定和 利用Biolog细菌自动鉴定系统对菌株进行鉴定，确定菌株的种属。
[0033] 一、菌株PSBHY-3的16S rDNA分子生物学鉴定
[0034] 1.细菌基因组DNA的提取：
[0035] (1)将菌株PSBHY-3接种于LB培养液中，振荡培养过夜。
[0036] (2)取细菌培养液1 · 5mL，10000rpm( 11，500 X g)离心1分钟，尽量吸净上清。
[0037] (3)采用天根生化科技（北京）有限公司提供的细菌基因组DNA提取试剂盒 (TIANamp Bacteria DNA Kit)提取菌株PSBHY-3的总DNA。
[0038] (4)DNA浓度及纯度检测:取5yL DNA样品经浓度为1.0% (w/v)的琼脂糖凝胶检测， 并取lyL样品用NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Scientific)测定DNA的浓度，-20°C保 存待用。
[0039] 2. 16S rDNA基因的PCR扩增
[0040] 16S rDNA的扩增所采用的细菌通用引物由上海生工生物工程有限公司合成，正向 引物（8〇为：5'-八6八61'1'丁6八1'(：(^66(：1'〇八6-3'；反向引物（1492『）为 ：5'-GGTTACCTTGTTACGACm'jOyL PCR反应体系包括：10XPCR buffer 5yL，dNTPs(2.5mmol/ L)4yL，上下游引物各lyL，Taq酶0.25yL，DNA模板1~2yL，灭菌双蒸水补足。PCR反应条件:95 °C预变性4min;95°C变性lmin，48°C退火lmin，72°C延伸2min，共30个循环；最后72°C延伸 10min〇
[0041] 3. 16S rf)NA序列测定与比对
[0042] 扩增结束后，PCR产物用1.0%(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测，送上海美吉生物医药科 技有限公司测序。测得其序列为：
[0043]
[0045] 所测序列在GenBank数据库中进行BLAST比对，得到的鉴定结果为菌株PSBHY-3属 于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，相似度为100%。
[0046] 二、菌株 PSBHY-3 的 Biolog 鉴定
[0047]通过16S rDNA分析可将菌株鉴定到属的水平，根据以上结果，选用Biolog的GP2微 孔鉴定板，采用Biolog公司的细菌自动鉴定系统，基于菌株对不同碳源利用的生理生化特 性将菌株鉴定到种的水平。
[0048]将菌株PSBHY-3的单菌落接种至鉴定专用的BUG平板上，30 °C培养16~24h。待平板 上长出可见菌落后，通过干管分散技术将菌株制成菌悬液，利用Bio log的浊度计，调整菌悬 液浊度，再将菌液接种到鉴定板上，在30 °C下培养16~24h。在此期间通过将菌株PSBHY-3对 95种碳源的利用情况与数据库比对，得出鉴定结果(表1)。经鉴定菌株PSBHY-3为解淀粉芽 抱杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)，可能性为98% 〇 [0049] 表1菌株PSBHY-3的生理生化特性-碳源利用(反应24h)
[0050]
[0051]
[0052] 注："+"表示阳性反应，表示阴性反应，"B"表示边界反应。
[0053] 三、菌株PSBHY-3的菌种保藏
[0054]根据16S rDNA分子生物学鉴定和Biolog鉴定结果，菌株PSBHY-3鉴定为解淀粉芽 抱杆菌（Bacillus amyloliquefaciens) 〇
[0055]解淀粉芽孢杆菌PSBHY-3为新的菌株，已于2015年4月28日保藏于中国典型培养物 保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号:CCTCC Ν0:Μ 2015260,保藏地址：中国武汉武汉大学。 [0056]实施例3不同温度、盐度和pH条件下解淀粉芽孢杆菌PSBHY-3的解磷效果 [0057]将实施例1获得的解淀粉芽孢杆菌PSBHY-3接种到有机磷液体培养基中，摇床培养 120h，研究在不同的温度条件下(5 °C、10 °C、15 °C、20 °C、25 °C、30 °C、35 °C )解淀粉芽孢杆菌 PSBHY-3的解磷效果。结果发现，5~20 °C时解磷效果不明显，培养液中活性磷含量一直保持 在5mg/L以下;在25~35°C条件下，解磷量变化趋势较一致，其中以35°C时菌株PSBHY-3的解 磷效果最好，在120h，解磷量可达46.25mg/L，其次是30°C和25°C时，解磷量分别达到 41.65mg/L和37.51mg/L。该研究结果表明，菌株PSBHY-3在25~35°C条件下，具有较好的解 磷效果。
[0058]将实施例1获得的解淀粉芽孢杆菌PSBHY-3接种到有机磷液体培养基中，摇床培养 120h，研究在不同的盐度条件下（0、10、20、30、40)解淀粉芽孢杆菌PSBHY-3的解磷效果。结 果发现，盐度为〇的条件下，解磷量较低，培养120h解磷量为17.28mg/L;在盐度为10~40的 条件下表现出较好的解磷效果，其中，盐度为10的条件下，24h后解磷量呈线性增长，每24h 解磷量增加值均超过9mg/L，在盐度为20~40的条件下，24~96h解磷量呈现较快的增长，此 后增长趋势变缓，120h时培养液中活性磷含量均高于50mg/L。解磷效果最好的为高盐度条 件(盐度40)，在120h时，解磷量为56.94mg/L。该研究结果表明，菌株PSBHY-3在盐度10~40 条件下，具有较好的解磷效果。
[0059] 将实施例1获得的解淀粉芽孢杆菌PSBHY-3接种到有机磷液体培养基中，摇床培养 120h，研究在不同的初始pH条件下(pH 6、7、8、9、10)解淀粉芽孢杆菌PSBHY-3的解磷效果。 结果发现，在初始pH为6~8的条件下，菌株PSBHY-3表现出较好的解磷效果，其中初始pH为7 时效果最好，在120h，解磷量可达64 · 53mg/L，初始pH为6和8时，120h解磷量分别为50 · 27mg/ L和49.23mg/L。初始pH为9和10的条件下，菌株PSBHY-3解磷效果不明显，解磷量一直低于 6mg/L。该研究结果表明，菌株PSBHY-3在初始pH 6~8的条件下，具有较好的解磷效果。
[0060] 上述结果表明，解淀粉芽孢杆菌PSBHY-3在25~35°C，pH 6~8,盐度10~40的条件 下具有较好的解磷效果。该菌株具有较广泛的适应范围，可适用于海水养殖池塘。
[0061] 实施例4解淀粉芽孢杆菌PSBHY-3的最高解磷量
[0062] 将实施例1获得的解淀粉芽孢杆菌PSBHY-3接种到有机磷液体培养基中，摇床培养 15d，测定其生长情况及解磷效果。结果发明，菌株PSBHY-3在3d后进入稳定期，细菌数量一 直维持在5.80 X 108~6.73 X 109cfu/mL之间，至实验结束时(第15d)细菌数量并未呈现明显 下降趋势。菌株PSBHY-3的解磷量呈现先升高后降低的变化趋势，在第9d时达到最高，为 118.92mg/L〇
[0063] 上述结果表明，解淀粉芽孢杆菌PSBHY-3具有高效降解有机磷的能力。
[0064]实施例5解淀粉芽孢杆菌PSBHY-3的应用
[0065]将实施例1获得的解淀粉芽孢杆菌PSBHY-3配制成不同浓度的（103Cfu/mL、104cfu/ mL和106cfu/mL)的解淀粉芽孢杆菌PSBHY-3施用于养殖池塘泥水环境中，实验10d，检测水 体活性磷酸盐的变化规律及实验结束时底泥的总磷含量，评价解淀粉芽孢杆菌PSBHY-3对 养殖池塘沉积物的解磷效果。结果表明，各实验组水体活性磷酸盐的变化呈现先升高后降 低的变化趋势。实验第4d，J-3组(初始菌量为10 3cfu/mL)、J-4组(初始菌量为104cfu/mL)及 】-6组（初始菌量为10 6(^11/11^)的水体活性磷含量分别较对照组提高了 1069.77%、 1116.28 %和697.67 % (图1)。实验结束时，J-3组、J-4组和J-6组底泥总磷的含量较对照分 别降低了73.33mg/kg、95mg/kg和136.67mg/kg(图2)。
[0066]上述结果表明，本发明中的解淀粉芽孢杆菌PSBHY-3对养殖池塘沉积物具有良好 的解磷效果。
[0067]本发明不局限于上述【具体实施方式】，根据上述内容，按照本领域的普通技术知识 和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，本发明还可以做出其它多种形式 的等效修改、替换或变更，均落在本发明的保护范围之中。
【主权项】
1. 一种用于养殖池塘有机磷分解的解淀粉芽孢杆菌PSBHY-3，其特征是:该菌株为解淀 粉芽孢杆菌（Baci I Ius amylol iquef aciens)，保藏名称为解淀粉芽孢杆菌PSBHY-3 (Bacillus amyloliquefaciens PSBHY-3)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中 国武汉武汉大学，保藏日期：2015年4月28日，保藏编号:CCTCC N0:M 2015260。2. 权利要求1所述的用于养殖池塘有机磷分解的解淀粉芽孢杆菌PSBHY-3在降解养殖 池塘沉积物中的有机磷中的应用。
【文档编号】C02F3/34GK105907664SQ201610248842
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月20日
【发明人】胡晓娟, 曹煜成, 李卓佳, 文国樑, 杨铿, 徐创文, 胡百文
【申请人】中国水产科学研究院南海水产研究所