专利名称：一种二甲基甲酰胺降解菌及其生产的菌剂的制作方法
一种二甲基甲酰胺降解菌及其生产的菌剂
技术领域：
本发明提供一种二甲基甲酰胺降解菌及其生产的菌剂，属于生物高技术领域，是 利用微生物的方法降解二甲基甲酰胺这种常用化工溶剂废水处理。
背景技术：
二甲基甲酰胺(DMF)是一种化学性质稳定、沸点高、性能优良的有机溶剂，密度为 0.94，沸点152.8°C，凝固点-61°C。除卤代烃以外，能与水及多数有机溶剂以任意比互溶， 由于其良好的溶解能力，有“万能溶剂”之称。且DMF又是一种重要的农药医药中间体，多种 气体的吸收剂在农药上，用以合成杀虫脒；在医药上，用以合成磺胺嘧啶、强力霉素、可的 松和维生素B6等药物；在石油化工中，用作气体吸收剂，用以分离和精制气体，如丁二烯抽 提；在聚胺脂合成革生产、聚丙烯腈抽丝工艺中用DMF作为溶剂，用DMF作为溶剂生产的腈 纶疏水性好，覆盖性强等优点。因此在以上化工产品生产过程排出的废水中含有大量DMF， 每年仅制革行业排放的含DMF废水约1亿吨，对环境造成严重污染。DMF性质稳定，生物 降解性差，能够刺激损害人的眼睛，并造成肝功能障碍，美国已确定DMF为人体可能致癌物 质。DMF在我国地面水质标准中允许最高浓度为25mg/L。目前对于中低浓度DMF废水主要 以回收和生物降解去除为主。
发明内容
技术问题本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，开发研制出一种 二甲基甲酰胺降解菌剂，使用本菌剂可以使一定浓度的DMF废水中DMF的残留量降低95% 以上，具有较广的降解谱，生产和使用成本较低。技术方案下面为本发明的主要内容本发明提供一种二甲基甲酰胺的降解菌(图1)，其菌株是一株革兰氏染色反应 阴性菌DMF3，于2010年5月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO. 3854，经鉴定为变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)菌体为不规则杆状，大 小约0. 5 1. 0 μ mX 1. 5 5. 0 μ m，没有菌柄也没有鞘，不产生芽孢，需氧，进行严格的呼吸 性代谢，氧化酶阳性，接触酶阳性，能以二甲基甲酰胺为唯一碳源、氮源进行生长，并将其彻 底矿化释放出氨氮。使用上述二甲基甲酰胺降解菌生产菌剂的工艺为斜面种一摇瓶种一种子罐一生 产罐一产品(包装剂型为液体菌剂或固体吸附菌剂)。本发明的详细实施步骤为1)将二甲基甲酰胺降解菌DMF3的试管种接种于LB培养基摇瓶中，振荡培养至对 数期；2)将上述培养好的菌种按10%的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生 长期。种子罐所用的培养基配方为葡萄糖0.8%，(NH4)2SO4 1%, K2HPO4 0.2%, MgSO40. 05%, NaCl 0. 01%, CaCO3 0. 3%，酵母膏 0. 02%，pH 值 7. 2-7. 5。3)将种子液按10%的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养 基相同。在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1 0.6-1.2，搅拌速度为 180-240转/分，培养温度为30-35°C，整个工艺流程培养时间为48-60小时。发酵完成后 培养液即为菌剂。
使用该发明生产的二甲基甲酰胺降解菌剂具有生产使用成本低、使用方便、去除 效果好的优点，适合在含有DMF的废水处理中推广使用。本发明对于保护生态环境，保护人 类的身体健康，降低废水处理的成本具有重要的意义。降解菌DMF3可以在以二甲基甲酰胺 为唯一碳源的无机盐培养基中生长；按2%的接种量于含二甲基甲酰胺的无机盐培养基中 接入降解菌DMF3，于30°C、pH7. 0条件下，振荡培养3天后，能使废水中一定浓度的DMF残 留量降低95%以上，具有很好的降解效果(图6)，降解菌DMF3具有较广的降解谱，在甲酰 胺、甲胺、二甲胺等有机胺中也可以生长。大大降低了生产和使用过程中的工作量，降低了 生产和使用成本。
四
图1菌株DMF3菌落照片图2降解菌DMF3生长情况与对DMF降解情况的关系图3不同接种量对DMF降解效率的影响图4初始pH对DMF降解效率的影响图5不同装液量对DMF降解效率的影响图6菌株DMF3对DMF降解的液相色谱图
五具体实施例方式1实验室生物降解实验 1.1接种量对DMF降解效率的影响菌株DMF3在LB培养基(LB培养基配方g/L 酵母膏5. 00，蛋白胨10. 00，NaCl 10. 00, pH 7.0)中培养至对数后期，按0.5、1、2、5、10、15%的接种量分别接入无机盐培养 基(DMF 400mg/L, NaCl 1. 00g/L, K2HPO4 2. 50g/L, KH2PO4 1. 00g/L, pH 7.0。下文同)中， 30°C、160r/min摇床培养，每隔12小时测定一次DMF的含量，结果如图3所示。接种量的大 小对DMF的降解效率有直接的关系，在小于2%的接种量下，接种量越大，DMF的降解效率就 越高；当接种量大于2%时，再增大接种量对DMF降解影响不大。1. 2初始pH对DMF降解效率的影响菌株DMF3在LB培养基中培养至对数后期，按2%接种至不同pH的无机盐培养基 中，30°C、160r/min摇床培养，72h后测定其中DMF的含量，结果如图4所示。在pH5. 0 9. 0的条件下，菌株DMF3对DMF的降解率差距较大；当pH为7. 0，降解率几乎为100%。当 pH为5. 0时，DMF几乎不被降解；当pH在碱性条件下随着pH的升高DMF的降解率快速下 降。
1. 3装液量对解DMF降解效率的影响在5个250mL的三角瓶中分别装入50、70、100、120、150mL无机盐培养基。菌株 DMF3在LB培养基中培养到对数后期，按2%的接种量接种到上述各培养基中，30°C、160r/ min摇床培养，48小时后测定DMF的降解率，结果如图5。48小时的测定结果表明装有50、 70、100、120、150mL培养液的三角瓶中DMF的降解率分别为86%、80%、70%、66%和63%， 菌株DMF3降解DMF的过程是个好氧过程，大通气量有助于DMF的降解。2生产实施例 将本发明的DMF降解菌DMF3的原种在培养皿上活化，并测定降解性能，接种于 试管斜面上备用。试管种接种于含200ml的LB培养基1000ml摇瓶中，恒温振荡培养至 对数期，准备接种种子罐。种子罐500升，投料量400升，培养基配方为葡萄糖0. 8 %， (NH4)2SO4 1%, K2HPO4 0. 2%, MgSO4 0. 05%, NaCl 0. 01%, CaCO3 0. 3%，酵母膏 0. 02%， pH值7. 2-7. 5。投料完毕后121°C高压湿热灭菌，冷却至33°C后，将上述培养好的摇瓶菌种 按10%的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为220转/分，无菌空 气通入量为1 0.8。将到达对数期的种子液按10%的接种量接入生产罐培养，生产罐 所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4. 5吨。投料后的生产罐 1. lkg/cm2的压力下，121°C高压湿热灭菌，灭菌后冷却至35°C以下，通无菌空气保持无菌状 态备用。接种后的生产罐温度控制在30-35°C，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为 1 0.8-1.0，搅拌速度为240转/分，整个工艺流程培养时间为48-60小时。发酵结束后 菌体数量达到10亿个/ml以上。发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭 吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。
权利要求
一种二甲基甲酰胺降解菌，其特征在于，该微生物是革兰氏染色阴性的变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)的菌株DMF3，于2010年5月21日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.3854，菌体为不规则杆状，大小约0.5～1.0μm×1.5～5.0μm，无菌柄，无鞘，不产生芽孢，需氧，进行严格的呼吸性代谢，氧化酶阳性，接触酶阳性，能以二甲基甲酰胺为唯一碳源、氮源进行生长，并将其彻底矿化释放出氨氮。
2.一种用权利要求1所述的二甲基甲酰胺降解菌生产的降解菌剂，是通过以下方法生 产而成1)将试管种接种于LB培养基摇瓶中，振荡培养至对数期；2)将上述培养好的菌种按10%的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，种 子罐所用的培养基配方为葡萄糖 0.8%, (NH4)2S04 1%, K2HP04 0. 2%, MgS040 . 05%, NaCl 0. 01%, CaC03 0. 3%，酵母膏 0. 02%，pH 值 7. 2-7. 5 ；3)将种子液按10%的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同；4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1 0.6-1.2，搅拌速度为 180-240转/分，培养温度为30-35°C，全流程培养时间为48-60小时，发酵结束后菌体数量 达到10亿个/ml以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型 或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。
全文摘要
本发明提供一种二甲基甲酰胺(DMF)降解菌及其生产的菌剂，属于生物高技术领域。所用菌株为革兰氏染色反应阴性菌菌株DMF3，经鉴定为变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)。主要生物学特性为G-，菌体为不规则杆状，大小约0.5～1.0μm×1.5～5.0μm，无菌柄，无鞘，不产生芽孢，需氧，进行严格的呼吸性代谢，能以DMF为唯一碳源、氮源进行生长，将其彻底矿化并释放出氨氮。在30℃、pH 7.0条件下该菌株可以在3天内，使废水中一定浓度的DMF残留量降低95％以上，解决了化工生产废水中DMF难处理的问题，可使DMF废水COD达标排放。
文档编号C12R1/38GK101935626SQ20101019926
公开日2011年1月5日 申请日期2010年6月12日 优先权日2010年6月12日
发明者杨帅, 蔡天明, 陈立伟, 顾海莎 申请人:南京农业大学