1] 本发明的皮氏无色杆菌AchromobacterpiechaudiiXG-11耐盐性较好，在0~ 7%的盐度范围内均能生存，盐度为7%时略受抑制。该菌种在模拟海水盐度下，10d内对初 始浓度为lg/L的委内瑞拉重油降解效率达50%以上。该菌株XG-11已于2013年7月26 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路 1号院3号，中国科学院微生物研宄所），保藏编号：CGMCCNo. 8021 ;分类命名：皮氏无色杆 菌Achromobacterpiechaudii。
[0072] 实施例2单菌及混合菌群对委内瑞拉重油的降解性能
[0073] 以委内瑞拉重油为污染物，在模拟海水盐度下考察以上单一菌种及混合菌种的石 油降解性能。按如下步骤进行：（1)用移液枪移取低温保藏的菌种200uL加入灭菌的液体LB 培养基中，于25°C~30°C、140rpm条件下振荡活化48h，重复转接新鲜LB培养基1次。此 时，取处于生长对数期的浑池液在室温下5000rpm离心10min，收集菌体并用无菌磷酸盐缓 冲液清洗，如此重复至少3次后，用磷酸盐缓冲液稀释至特定菌种密度（0D_)，制备成单一 菌种悬液。上述磷酸盐缓冲液中每升含21.759gK2HP04.H20,33. 48gNa2HP04.12H20,8. 79g KH2P04, 5 . 09gNH4C1，pH为7. 4。⑵将各单菌悬液接种于lOOmL模拟石油污染ASM培养基 中，委内瑞拉重油含量为lg/L，菌悬液接种量为5% (体积比），在25°C~30°C、140rpm、避 光条件下振荡培养l〇d，测定单菌原油降解效率；另将三种单菌悬液等量混合为复合菌悬 液，进行相同的考察。其中，每个处理设3个重复，并以投加等量无菌蒸馏水代替菌悬液作 为阴性对照。（3)降解10d后，发酵液剩余原油的含量经四氯化碳萃取、定容后，采用红外测 油仪进行测定，降解率（％ ) = (1-剩余原油量/初始原油量）X100。
[0074] 本发明涉及的水谷鞘氨醇杆菌SphingobacteriummizutaiiXG-3、木糖氧化无 色杆菌AchromobacterxylosoxidansXG-14、皮氏无色杆菌Achromobacterpiechaudii XG-11及其混合菌群对委内瑞拉重油的降解效率见图1。其中，在模拟海水盐度下，经过10d 的降解，水谷鞘氨醇杆菌SphingobacteriummizutaiiXG-3对委内瑞拉重油的降解效率可 达41. 4%，木糖氧化无色杆菌AchromobacterxylosoxidansXG-14可达47. 5%，皮氏无色 杆菌AchromobacterpiechaudiiXG-11的降解效率最高，达到51. 6%，三菌种协同作用处 理效果更佳，去除率达58. 2%。
[0075] 实施例3涉及菌种的耐盐性能
[0076] 受海水潮汐和蒸发的影响，溢油污染海岸线环境的盐度较高，并呈现复杂的变化， 是影响微生物生长代谢和竞争性的重要因素。本实施例按如下步骤进行：取等菌种浓度 的水谷鞘氨醇杆菌SphingobacteriummizutaiiXG-3、木糖氧化无色杆菌Achromobacter xylosoxidansXG-14、皮氏无色杆菌AchromobacterpiechaudiiXG-11悬液按体积比5% 的比例接种于NaCl质量浓度梯度为0、1%、3%、5%、7%、10%的LB培养液中，在28°C、 140rpm、避光条件下振荡下培养24h后，测定各混合液的0D_，根据检测结果评价各优势 菌种的耐盐碱性能。若菌液的0D_>0. 25,则认为菌种在该盐度环境中生长良好，其耐盐 性标为"++"，若0D_>0. 15,认为菌种在该盐度环境中可以生长，其耐盐性标为"+"，若 0D_〈0. 05,则认为该菌种不能生长，详见表1。由表可知水谷鞘氨醇杆菌、木糖氧化无色杆 菌、皮氏无色杆菌菌均有较好的耐盐性能，在高盐度的海岸线环境中具有较好的适应性和 竞争性。
[0077]表1XG-3、XG-14、XG-11的耐盐性能
【主权项】
1. 一种用于修复重油污染海岸线的复合菌剂，该复合菌剂包括水谷鞘氨醇杆菌 (Sphingobacterium mizutaii)、木糖氧化无色杆菌（Achromobacter xylosoxidans)以及 皮氏无色杆菌（Achromobacter piechaudii) 〇
2. 根据权利要求1所述的复合菌剂，该复合菌剂中，所述水谷鞘氨醇杆菌、木糖氧化无 色杆菌与皮氏无色杆菌的活菌数之比为1~10 :1~10 :1~10。
3. 根据权利要求1所述的复合菌剂，其中，所述水谷鞘氨醇杆菌为保藏号为CGMCC No. 8000的水谷鞘氨醇杆菌。
4. 根据权利要求1所述的复合菌剂，其中，所述木糖氧化无色杆菌为保藏编号为CGMCC No. 8022的木糖氧化无色杆菌。
5. 根据权利要求1所述的复合菌剂，其中，所述皮氏无色杆菌为保藏编号为CGMCC No. 8021的皮氏无色杆菌。
6. 根据权利要求1所述的复合菌剂，该复合菌剂为固态或液态菌制剂；优选地，所述液 态菌制剂中各菌种的细胞浓度为IO7~10 8CFU/mL。 7?保藏号为CGMCC No. 8000的水谷鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium mizutaii)、保藏 编号为CGMCC No. 8022的木糖氧化无色杆菌（Achromobacter xylosoxidans)或保藏编号 为 CGMCC No. 8021 的皮氏无色杆菌（Achromobacter piechaudii)。
8. 权利要求1~6任一项所述的复合菌剂的制备方法，该方法包括： 将水谷鞘氨醇杆菌、木糖氧化无色杆菌、皮氏无色杆菌分别接种于灭菌的液体LB培养 基中，于25°C~30°C避光条件摇瓶培养，至生长对数后期，分别作为种子液； 将上述种子液以体积比2%~5%分别接种入灭菌的营养发酵培养基中，25°C~30°C 培养至各菌种的细胞密度为IO8~10 9CFU/mL，得发酵液；优选地，所述营养发酵培养基包括 牛肉膏、蛋白胨和ASM成分； 将上述发酵液复配，或根据需要进一步浓缩或干燥，制得复合菌剂。
9. 权利要求1~6任一项所述的复合菌剂或权利要求7所述的菌种在修复石油污染特 别是重油污染海岸线、或溢油污染盐碱土壤中的应用。
10. 根据权利要求9所述的应用，其中，是将所述的复合菌剂或菌种均匀喷洒于岸滩或 盐碱土壤表面。
【专利摘要】本发明涉及用于修复重油污染海岸线的复合菌剂及其制备方法与应用。所述复合菌剂包括水谷鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium mizutaii)、木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)以及皮氏无色杆菌(Achromobacter piechaudii)，进一步，水谷鞘氨醇杆菌保藏号CGMCC No.8000；木糖氧化无色杆菌保藏编号CGMCC No.8022；皮氏无色杆菌保藏编号CGMCC No.8021。本发明的复合菌剂耐盐性能佳，竞争优势突出，利用三种菌的协同作用，对海岸线原油污染尤其是难治理的重油污染具有高效修复效果，亦可应用于溢油污染盐碱土壤的修复。CGMCC No. 802220130726 CGMCC No. 800020130726 CGMCC No. 802120130726
【IPC分类】B09C1-10, C12R1-025, C12R1-01, A62D101-20, C12N1-20, A62D3-02
【公开号】CN104745511
【申请号】CN201510145572
【发明人】宋佳宇, 蔡斌, 刘光全, 陈春茂, 岳勇, 阎光绪, 陈梅梅, 代小丽, 刘思敏, 贾伟超
【申请人】中国石油天然气集团公司, 中国石油集团安全环保技术研究院
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年3月30日