不解糖假苍白杆菌wzz003及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种新菌株一不解糖假苍白杆菌WZZ003及其在立体拆分 (R，S)-2-(2,6-二甲基苯基氨基）丙酸甲酯反应生成光学纯（R)-2-(2,6-二甲基苯基氨 基）丙酸中的应用，转化产物（S)-2-(2, 6-二甲基苯基氨基）丙酸甲酯通过化学消旋法重 新生成R，S-2-(2, 6-二甲基苯基氨基）丙酸甲酯作为反应底物回收利用。 (二）
【背景技术】
[0002] 酰胺类农药如甲霜灵是一种高效、低毒、广谱的内吸性杀菌剂，对由霜霉病菌、疫 霉病菌、腐霉病菌等引起的植物病害具有较强的治疗效果，并且有较长的药效，是当今广泛 使用的杀菌剂品种之一。甲霜灵（Metalaxyl)是由一对光学异构体组成的外消旋化合物， 其中R-异构体（精甲霜灵）的杀菌活性比S-异构体高20-30倍，某些方面甚至高100倍 以上，而且S-异构体对R-异构体的活性还有一定的抑制作用。在获得同等效果的情况下， 精甲霜灵的用量仅为甲霜灵的一半或几分之一。另外，R-异构体在环境中的降解速度要比 外消旋化合物快得多，具有更好的环境相容性。因此，精甲霜灵的工业化生产具有良好的经 济效益和社会效益。
[0003] (R)-DMPM是合成酰胺类农药的关键中间体，可用于生产N-酰基丙酸类杀菌剂。 目前，文献报道的合成（R) -DMPM主要是用具有旋光性的起始原料，控制适当的反应条件获 得。
[0004] 根据反应原料（l)-x-ch(ch3)cooch3的不同，分为以下几种不同的制备方法。
[0005] (1)右旋的a-(三氟甲基磺酸酯基）丙酸甲酯和与之对应的胺类反应生成 (R)-DMPM。反应式如下：
【主权项】
1?不解糖假苍白杆菌（Pseudochrobactrum asaccharolyticum)WZZ003,保藏于中国典 型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO :M 2014209,保藏日期2014年5月18日，地址为中 国，武汉，武汉大学，邮编430072。
2. -种权利要求1所述不解糖假苍白杆菌WZZ003在拆分外消旋（R，S)-2-(2, 6-二甲 基苯基氨基）丙酸甲酯中的应用。
3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：以不解糖假苍白杆菌 WZZ003经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经冷冻干燥后的干菌体为催化剂，以外消旋 (R，S)-2-(2, 6-二甲基苯基氨基）丙酸甲酯为底物，以pH值5. 0~7. 2的磷酸缓冲液为反 应介质，在20~50°C、200rpm条件下进行拆分反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得 (R) _2-(2,6_二甲基苯基氨基）丙酸。
4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述底物终浓度为5~100g/L缓冲液，湿菌 体加入量为10~50g/L缓冲液，干菌体加入量为2~10g/L缓冲液。
5. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备： (1) 斜面培养：将不解糖假苍白杆菌WZZ003接种至斜面培养基，在30°C培养2天，获得 斜面菌体；斜面培养基组成：蛋白胨1(^/1，酵母膏5 §/1，似(：11(^/1，质量浓度2%琼脂，溶 剂为去离子水，pH 7. 0 ; (2) 种子培养：取斜面菌体接种于种子培养基，在30°C、150r/min条件下培养24h，获 得种子液；种子培养基组成：蛋白胨l〇g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH 7. 0 ； (3) 发酵培养：在无菌条件下，取种子液以体积浓度2%的接种量接种于产酶培养 基中，在30°C、150r/min条件下培养24h，获得发酵液，取发酵液在9000rpm离心10min， 弃上清液，收集湿菌体；产酶培养基组成为：酵母膏llg/L，葡萄糖5g/L，NaCl 0. 5g/L， MgS04lmmol/L，pH 7. 0,溶剂为去离子水； (4) 干菌体的制备：取湿菌体在-40°C条件下冻干2天，得到干菌体。
6. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述分离纯化的方法为：转化反应结束后，将 反应液的pH值用盐酸调节至2. 0后，加入乙酸乙醋进行萃取，9000rpm离心10min，取上层 有机相减压蒸馏至无液体流出，取浓缩物用甲苯溶解，再加入无水硫酸钠干燥，过滤，获得 滤液和滤饼；取滤液蒸干溶剂后得到产品（R)-2_(2, 6-二甲基苯基氨基）丙酸；取滤饼通 过消旋化回收利用。
【专利摘要】本发明公开了一种不解糖假苍白杆菌WZZ003及应用，所述的应用为：以不解糖假苍白杆菌WZZ003经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经冷冻干燥后的干菌体为催化剂，以外消旋(R,S)-2-(2,6-二甲基苯基氨基)丙酸甲酯为底物，以pH值5.0～7.2的磷酸缓冲液为反应介质，在20～50℃、200rpm条件下进行拆分制备(R)-2-(2,6-二甲基苯基氨基)丙酸；本发明提供的产酶微生物菌株--不解糖假苍白杆菌WZZ003的区域选择性强，制备的产物对映体过量值≧99.5％，反应转化率高，通过副产物回收利用转化率达到99％以上，下游分离简单，能耗低，环境污染小，适合工业化生产。CCTCC NO: M 201420920140518
【IPC分类】C12N1-20, C12P41-00, C12R1-01, C12P13-00
【公开号】CN104745509
【申请号】CN201510134861
【发明人】章银军, 汪钊, 郑建永, 王敬红, 吴克崇, 吴贯中
【申请人】浙江工业大学, 一帆生物科技集团有限公司
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年3月25日