幽门螺杆菌耐药性核酸检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种幽门螺杆菌耐药性核酸检测试剂盒，属于细菌的检测【技术领域】。本发明检测试剂盒包括以下各组分：PCR反应液、幽门螺杆菌反应液、水。本发明还公开了该试剂盒检测幽门螺杆菌耐药性的使用方法。本发明幽门螺杆菌耐药性核酸检测试剂盒能够在同一反应管同时进行幽门螺杆菌23S的2142和2143位点SNP检测，特异性强、灵敏度高，还具有操作简便、可重复性强、检测结果快速客观等优点。
【专利说明】幽门螺杆菌耐药性核酸检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种幽门螺杆菌耐药性检测试剂盒，属于细菌的检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]幽门螺杆菌(Hp)与胃、十二指肠等多种疾病密切相关，是消化性溃疡、慢性萎缩性胃炎等疾病的重要致病因素，也是胃癌演变的始动因子，与胃MALT淋巴瘤的发生、发展也有一定的关系。根除Hp可促进溃疡愈合、减少溃疡复发，减少胃癌发生概率，部分功能性消化不良患者也可从中获益。
[0003]自从澳大利亚学者Marshall等1983年首次从胃炎患者的胃黏膜中分离到幽门螺杆菌后，经过20多年的发展，有关幽门螺杆菌临床检测的研究取得了长足进步。截止目前为止，主要有快速尿素酶试验，细菌培养，活检标本切片染色，直接图片染色和聚合酶链反应(PCR)，碳13，碳14呼吸试验，血清免疫学检测，尿素排泄试验等方法。
[0004]实时突光定量PCR 技术(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction简称Real Time PCR)是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied biosystems公司推出，在PCR反应体系中加入突光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA (cDNA)的起始浓度进行定量的方法。RealTime PCR的基本目标是精确测量和鉴别非常微量的特异性核酸，从而可通过监测CT值而实现对原始目标基因的含量定量。实时荧光定量P CR法最大的优点是克服了终点PCR法进入平台期或叫饱和期后定量的较大误差，实现DNA/RNA的精确定量。
[0005]本实验运用实时荧光定量PCR技术用于检测Hp感染和耐药，具有自动化程度高、无污染、实时和准确等特点。
【发明内容】
[0006]本发明的主要目的提供是一种幽门螺杆菌耐药性检测试剂盒，该试剂盒具有特异性强、灵敏度高等优点。
[0007]为了达到上述目的，本发明采用了这样的技术方案:
[0008]幽门螺杆菌耐药性检测试剂盒，包括以下各组分:PCR反应液、幽门螺杆菌反应液、水。
[0009]其中，所述的幽门螺杆菌反应液包括以下4组组分:
[0010](I) 一对检测幽门螺杆菌的特异性引物，其碱基序列分别为SEQ ID N0.1和SEQ IDN0.2所示；
[0011](2)—条检测幽门螺杆菌野生型探针，其碱基序列分别为SEQ ID N0.3所示，其中，SEQ ID N0.3 5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团；
[0012](3)—条检测幽门螺杆菌2142位点SNP探针，其碱基序列分别为SEQ ID N0.3所示，其中，SEQ ID N0.3 5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团；[0013](4) 一条检测幽门螺杆菌2143位点突变探针，其碱基序列分别为SEQ ID N0.3所示，其中，SEQ ID N0.3 5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团；
[0014]本发明对上述引物和探针的配比比例进行了摸索和优化，试验结果发现，它们之间不同的配比比例对于检测结果的特异性和灵敏性具有显著的差异，本发明通过高通量的筛选试验发现，上述引物和探针在下述配比下，具有最优的检测效果:
[0015]检测幽门螺杆菌的引物及探针的配比分别为:SEQ ID N0.1: SEQ ID N0.2: SEQ IDN0.3: SEQ ID N0.4: SEQ ID N0.5=500nM: 500nM: 400nM: 300nM: 300nM。
[0016]表1幽门螺杆菌引物探针
【权利要求】
1.一种幽门螺杆菌耐药性核酸检测试剂盒，、其特征在于，包括以下各组分:PCR反应液、幽门螺杆菌反应液和水。
2.按照权利要求1所述的幽门螺杆菌耐药性核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的幽门螺杆菌反应液由以下组分(I)，组分(2 )，组分(3 )和组分(4)组成: 组分(I):一对检测幽门螺杆菌的特异性引物，其碱基序列分别为SEQ ID N0.1和SEQID N0.2 所示； 组分(2):—条检测幽门螺杆菌野生型探针，其碱基序列分别为SEQ ID N0.3所示，其中，SEQ ID N0.3 5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团； 组分(3):—条检测幽门螺杆菌2142位点SNP的探针，其碱基序列分别为SEQ ID N0.4所示，其中，SEQ ID N0.4 5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团； 组分(4):一条检测幽门螺杆菌2143位点SNP的探针，其碱基序列分别为SEQ ID N0.5所示，其中，SEQ ID N0.5 5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团；
3.按照权利要求2所述的幽门螺杆菌耐药性核酸检测试剂盒，其特征在于:所述的荧光报告基团包括FAM、HEX、ROX荧光报告基团；所述的荧光淬灭基团包括BHQl荧光淬灭基团。
4.按照权利要求2所述的幽门螺杆菌耐药性核酸检测试剂盒，其特征在于，组分(1)，组分(2)，组分(3)和组分
SEQ ID N0.1:SEQ ID N0.2: SEQ ID N0.3: SEQ ID N0.4: SEQ ID N0.5=500nM: 500nM:400nM: 300nM: 300nM。
【文档编号】C12R1/01GK103898195SQ201210570029
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月25日 优先权日:2012年12月25日
【发明者】郜恒骏, 魏赵延, 张可浩, 张新, 盛海辉 申请人:泰州医药城博奥邦科生物科技有限公司