一种高产β-丙氨酸的基因工程菌的构建、表达及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种新的合成能力强、具有较高酶活的产β-丙氨酸的基因工程菌，以及这种高产工程菌的构建、表达和纯化，及其全细胞转化和发酵液直接转化合成β-丙氨酸的方法。合成方法为：通过基因工程的方法得到植物乳杆菌的L-天冬氨酸-α-丙氨酸脱羧酶(PanD)基因，基因序列号为NC_004567.2，将其构建到高效表达载体中，然后将高表达载体转化入受体菌，即得到所述的产β-丙氨酸的基因工程菌。所述基因工程菌经发酵培养，全细胞可转化80g/L底物，β-丙氨酸含量达到59.7g/L；在发酵液中直接投底物，转化浓度可达10g/L，β-丙氨酸含量达到6.8g/L，高于现有报道过的基因工程菌的合成能力。
【专利说明】—种高产β-丙氨酸的基因工程菌的构建、表达及应用
【技术领域】
[0001]本发明所属生物催化【技术领域】，特别涉及一种高产β-丙氨酸的基因工程菌的构建和表达，及一种利用基因工程菌发酵液转化合成β-丙氨酸的方法。
【背景技术】
[0002]丙氨酸是自然界中唯一存在的一种β型氨基酸，是生物体内合成泛酸的前提。泛酸是辅酶A(CoA)和酰基载体蛋白(ACP)生物合成的重要前体物质，参与生物体内碳水化合物、脂肪酸、蛋白质和能量代谢参与蛋白质、脂类和糖的代谢。
[0003]丙氨酸是一种重要的多用途的有机原料，可合成聚合丙氨酸，用于水处理工业和染料等生产；可合成泛酸和泛酸钙、肌肽、帕米膦酸钠、巴柳氮等，用于医药工业；也可用于美容、食品、饲料及化工等领域。β_丙氨酸具有较宽广的应用领域，有着非常大的市场需求。
[0004]获取丙氨酸的途径，可由丝胶、明胶、玉米蛋白等物质的水解、精制得到，但原料来源有限，成本高，目前工业上主要通过化学方法生产。化学法包括以下几种方法:(I)丙烯腈法；(2)丙烯酸法；(3)琥珀酰亚胺(丁二酰亚胺)降解法；(4) β -氨基丙腈法。化学法容易产生污染气体，且有些反应环境是在高温高压的条件下反应，副产物有毒，产物的分离纯化比较困难。
[0005]酶制剂作为生物催化剂的重要组成部分，其催化作用具有催化效率高，专一性强和作用条件温和等特点 ，所以酶的应用受到越来越广泛的关注。
[0006]β -丙氨酸在生物体内有很多代谢途径。其中在L-天冬氨酸-α -丙氨酸脱羧酶的作用下将L-天冬氨酸的α位羧基脱去生成丙氨酸和CO2，该反应基本不可逆。该酶在自然界中获利非常低，直接从天然菌株中筛选高产菌株非常困难。因此通过基因工程的方法来提高该酶的活性成了使其应用的唯一方法。
[0007]1996年(Patend Number:5834259)美国NSC技术有限公司通过基因克隆的方法，将E.coli K12菌株的PanD基因克隆到质粒pBR322，转化E.coli构建成含有PanD的菌株NS3291，用于拆分DL-天门冬氨酸制备D-天门冬氨酸。
[0008]1999 年，Nieole Dusch(Applied And Environmental Microbiology, Apr.1999,p.1530-1539)将 C.glutamicum 的 panD 基因(panDc.g)与 E.coli 的 panD 基因(panDE.c)克隆到双功能质粒表达载体pZ8-l (含tac启动子)中，使得在C.glutamicum与E.coli中都能进行表达从而对基因进行分析。其中在C.glutamicum中，通过转入含panDc.g的PZ8-1来加强panDc.g的表达，PanD活性提高了 288倍。但作者着眼于泛酸的积累，并未对panDc.g基因的产β -丙氨酸进行继续的研究。
[0009]专利CN 101210230Α中将大肠杆菌中的L-天冬氨酸-α -丙氨酸脱羧酶基因克隆并进行异源表达，但是合成β -丙氨酸的能力只达到2.94g/L，离真正应用还有很大距离。其他专利对L-天冬氨酸-α -丙氨酸脱羧酶进行异源表达的报道几乎没有，因此找到一种活性较高的L-天冬氨酸-α -丙氨酸脱羧酶基因是实现β -丙氨酸生产的决定性因素。
【发明内容】
[0010]本发明是为了克服自然界筛选产酶高活力菌株比较困难，并且现有的利用大肠杆菌进行异源表达的基因工程菌所得到的酶活性不高的问题，提供一种新的从酶基因库中挖掘的酶基因，得到一种合成能力强、酶活较高的产β-丙氨酸的工程菌，以及这种高产工程菌的构建、表达和纯化，及其全细胞转化和发酵液直接转化合成β-丙氨酸的方法。本发明所采用的技术方案是:
[0011]一种高产β -丙氨酸的基因工程菌，所述的方法是:通过基因工程的方法PCR得到植物乳杆菌的PanD基因，并在基因两端加上NdeI和XhoI酶切位点，并将基因构建到pET-32a(+)载体中，得到PanDL.p基因的高表达载体pET_32a (+)-panDL.P，然后将高表达载体转化入受体菌，即得到所述的产丙氨酸的基因工程菌。基因工程菌表达出的目的蛋白能达到全蛋白的30~50%，实现了目的蛋白的高效异源表达。对目的蛋白进行纯化，得到了纯度达到95 %以上的目的蛋白。
[0012]本发明中所述产丙氨酸的基因工程菌所用到的载体系列包括:ρΕΤ系列质粒、pTXBl系列、pGEX系列、pETduet系列、pTYB系列。
[0013]本发明中所述的产丙氨酸的基因工程菌，其特征在于所述的能高效表达外源基因的宿主菌为下列之一:BL21系列、Rosetta系列、Origami系列、Tuner系列。
[0014]本发明还涉及全细胞转化合成β -丙氨酸的方法，所述方法为:
[0015]将所述产丙氨酸的基因工程菌经种子培养基37°C过夜活化后，按1: 100比例接种到发酵培养基，37 °C、200rpm培养至对数中期，加入诱导剂IPTG至终浓度0.5mM，25~30°C、180rpm诱导培养4~6小时，离心收集菌体，加入底物1.5M L-天门冬氨酸溶液至终浓度为18~80g/L，终浓度为I %的表面活性剂，37~50°C，200rpm下转化4~8小时。
[0016]所述的种子培养基为用于培养大肠杆菌的常规培养基，如LB培养基。配方如下:蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L ;NH3.H2O调节至pH 7.0。平板培养基为LB培养基再加入15g/L琼脂粉，在121°C灭菌20min。
[0017]所述的发酵培养基为来源更为广泛，价格更为廉价的工业培养基，其配方及其配制方法如下:玉米浆干粉10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 5g/L、自来水750mL、NH3.H2O调节pH至 7.30，定容到 1000mL。115°C灭菌 20min。
[0018]所述的底物溶液可以是L-天门冬氨酸的钠盐或铵盐溶液，所用缓冲液为磷酸缓冲液。
[0019]所述的表面活性剂为:Tween80，TritonX-100、CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)、LAS (十二烷基苯磺酸钠)、SDS (十二烷基磺酸钠)、PEG600 (聚乙二醇)中的一种或多种。
[0020]每毫升反应体系中生物催化剂的用量为0.25~0.4g。
[0021]本发明还涉及发酵液直接转化合成β -丙氨酸的方法，所述方法为:
[0022]将所述产β -丙氨酸的基 因工程菌经种子培养基37°C过夜活化后，按1: 50比例接种到发酵培养基，37°C、200rpm培养4~6小时，加入诱导剂IPTG至终浓度0.5mM, 25~30°C、180rpm诱导培养4~6小时，加入底物1.5M L-天门冬氨酸溶液至终浓度为10g/L，终浓度为1%的表面活性剂，37~42°C，200rpm下转化7~15小时。[0023]所述的种子培养基为用于培养大肠杆菌的常规培养基,如LB培养基。
[0024]所述的发酵培养基为来源更为广泛，价格更为廉价的工业培养基，其配方及其配制方法如下:玉米浆干粉10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 5g/L、自来水750mL、NH3.H2O调节pH至 7.30，定容到 1000mL。115°C灭菌 20min。
[0025]所述的底物溶液可以是L-天门冬氨酸的钠盐或铵盐溶液，所用缓冲液为磷酸缓冲液。
[0026]所述的表面活性剂为:Tween80，TritonX-100、CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)、LAS (十二烷基苯磺酸钠)、SDS (十二烷基磺酸钠)、PEG600 (聚乙二醇)中的一种或多种。
[0027]本发明所述的基因工程菌及其构建、表达与应用的有益效果具体体现在:
[0028](I)提供一种新的从酶基因库中挖掘的酶基因，得到一种合成能力强、酶活较高的产β-丙氨酸的工程菌；
[0029](2)所得基因工程菌菌体活性高，初步研究发现全细胞能转化80g/L底物，β -丙氨酸含量达到59.7g/L，远远高于相同菌株；
[0030](3)所得基因工程菌可用发酵液直接转化，转化浓度可达到10g/L，丙氨酸含量达到6.8g/L，高于现有基因工程菌的合成能力。利用发酵液直接转化，在工业应用上更具有优势。
【专利附图】
【附图说明】
[0031 ] 附图1为质粒pET_32a (+) -PanDL.p构建示意图
[0032]附图2为L-天门冬氨酸、α、β _丙氨酸衍生后的液相谱图(保留时间分别为2.34min,6.218min,7.493min)
[0033]附图3为空白对照的液相谱图
[0034]附图4为基因工程菌转化产物液相谱图
[0035]附图5为基因工程菌发酵液转化产物液相谱图
[0036]附图6为实施例8中转化产品β -丙氨酸的HPLC图谱
【具体实施方式】
[0037]以下通过具体的实施例来进一步说明，但是这些实施例不构成对本发明的限制。
[0038]实施例1:高表达载体的构建
[0039]根据Lactobacillus pi ant arum WCFSl植物乳杆菌的L-天冬氨酸_ α -丙氨酸脱竣酶 PanD 基因(NCBI Reference Sequence:NC_004567.2)的序列设计引物:
[0040]正向引物:CGCCATATGTTAATTGATAT，下划线序列为酶切位点NdeI
[0041]反向引物:CCCTCGAGAACATATCAATTAA,下划线序列为XhoI酶切位点
[0042]PCR得到的基因序列两端带有Nde1、XhoI两个位点，将基因插入到pET_32a(+)载体中，得到基因工程菌。
[0043]得到的基因工程菌表达出的蛋白在C端带有His标签蛋白，His标签后面为XhoI位点，His标签后XhoI位点前有终止密码子TGA。
[0044]所述的NdeI和XhoI酶切位点中的NdeI酶切位点为NdeI有两个酶切位点，有346和691bp处两个,选取的为NdeI的第一个位点,位于Trx (硫氧还蛋白前面),构建后载体表达出蛋白N端没有硫氧还蛋白，C端去掉了中止密码子表达完His标签后终止。
[0045]得到的高表达的基因工程载体质粒分别命名为pET_32a(+)-PanDL.p。
[0046]实施例2:高表达菌株的获得
[0047]将制备得到的重组载体用常规方法导入大肠杆菌BL21、Rosetta或Origami以构建重组异构酶以可溶形式存在于菌体内的基因工程菌，筛选出组建成功的基因工程菌，其中以大肠杆菌BL21为宿主菌的重组菌目的蛋白表达相对较好。以目的蛋白表达量不低于30%的工程菌，作为生产用工程菌菌种，并以甘油菌或牛奶冻干菌种形式保存。
[0048]具体转化方法如下:从冰箱中取出100 μ L的感受态细胞。细胞在冰上融化2-5分钟。融解后轻弹管壁1-2次以重悬细胞。将IyL的pET-32a(+)-PanDL.p质粒加入感受态中。轻微摇动混和随后将管重置于冰中，确保除了管盖其他部分都置于冰中。冰浴30min。42°C水浴90秒；不可摇动。然后迅速将管转移到冰上放置2分钟，使细胞冷却，不可摇动。向每个离心管中加入500 μ L无菌无抗的LB培养基，混匀后置于37°C摇床振荡培养45min(150rpm/min),使质粒上相关的抗性标记基因表达,使菌体复苏。混匀吸取100 μ L加到LA固体培养基上，用玻璃刮轻轻涂匀，将平板放置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37°C培养12-16小时。
[0049]得到的基因工程菌株命名为LPD。
[0050]实施例3:高表达菌株的中的L-天冬氨酸-α -丙氨酸脱羧酶纯化
[0051](I)种子培养基活化挑取培养皿上的单菌落于5mL LB(Amp 100μg/ml)培养基中，37°C、200rpm过 夜活化。
[0052](2)发酵培养将过夜活化的种子液分别按1: 100比例接种到800mL LB培养基(AmplOOg/mL)，37°C、200rpm 培养至对数中期 0D600 = 0.6 ~I 左右。
[0053](3)诱导培养对数中期时加入IPTG进行诱导，使其终浓度为0.5mM,25~30°C、180rpm诱导培养4~6小时。
[0054](4) SDS-PAGE取将诱导完成的发酵液4mL，12000rpm离心90sec，加入800 μ L去离子水，超声破碎5min。12000rpm离心10min。取离心后上清20 μ L加入5 μ L上样缓冲液；离心后沉淀用去离子水洗剂I次,加入800 μ L去离子水后取20 μ L加入5 μ L上样缓冲液。SDS-PAGE分离胶浓度为12.5%，每孔上样10 μ L。
[0055](5)纯化工作在AKTApurifier 10仪器中进行,纯化条件如下:
【权利要求】
1.一种高产β-丙氨酸的基因工程菌，所述的方法是:通过基因工程的方法得到植物乳杆菌的L-天冬氨酸-α-丙氨酸脱羧酶(PanD)基因，基因序列号分别为NC_004567.2，并在基因两端加上NdeI和XhoI酶切位点，并将基因构建到pET-32a (+)载体中，得到PanDL.p基因的高表达载体pET-32a(+)-panDL.P，然后将高表达载体转化入受体菌，即得到所述的产丙氨酸的基因工程菌。
2.如权利要求1所述的产丙氨酸的基因工程菌，其特征在于所述的供体菌为含有PanD基因的埃希氏菌属、棒杆菌属、芽孢杆菌属、分枝杆菌属、假单胞菌属、变形菌属、固氮菌属、根瘤菌属、志贺菌属、李斯特菌属、至弧菌属、克雷伯氏菌属等菌属。
3.如权利要求1所述的产丙氨酸的基因工程菌，其特征在于所述的能高效表达外源基因的质粒为下列之一:ρΕΤ系列质粒、pTXBl系列、pGEX系列、pETduet系列、pTYB系列。
4.如权利要求1所述的产丙氨酸的基因工程菌，其特征在于所述的能高效表达外源基因的宿主菌为下列之一:BL21系列、Rosetta系列、Origami系列、Tuner系列。
5.如权利要求1~4所述的产β-丙氨酸的基因工程菌,利用全细胞转化合成β_丙氨酸的方法。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述的方法为:将所述产β-丙氨酸的基因工程菌经种子培养基37°C过夜活化后，按1: 100比例接种到发酵培养基，37°C、200rpm培养至对数中期，加入诱导剂IPTG至终浓度0.5mM，30°C、180rpm诱导培养6小时左右，离心收集菌体，加入底物1.5M L-天门冬氨酸溶液至终浓度为18~80g/L，终浓度为1%的表面活性剂，37~50°C，200rpm下转化4~8小时。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基为:玉米浆干粉10g/L、酵母膏 5g/L、NaCl 58/1、自来水 7501^、順3*!120调节口!1至7.30，定容到 1000mL0 115°C灭菌20mino
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，每毫升反应体系中生物催化剂的用量为0.25 ~0.4g。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的表面活性剂为:Tween80、TritonX-100、CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)、LAS (十二烷基苯磺酸钠)、SDS (十二烷基磺酸钠)、PEG600 (聚乙二醇)中的一种或多种。
10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的反应温度为37°C~50°C。
11.如权利要求1~4所述的产β-丙氨酸的基因工程菌，利用发酵液直接转化合成β-丙氨酸的方法。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于所述的方法为:将所述产丙氨酸的基因工程菌经种子培养基37°C过夜活化后，按1: 50比例接种到发酵培养基，37°C、200rpm培养6小时，加入诱导剂IPTG至终浓度0.5mM, 30°C、180rpm诱导培养6小时左右，加入底物1.5M L-天门冬氨酸溶液至终浓度为10g/L，终浓度为1%的表面活性剂，30~42°C，200rpm下转化7~15小时。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基为:玉米浆干粉10g/L、酵母膏 5g/L、NaCl 5g/L、自来水 750mL、NH3.Η20 调节 pH 至 7.30，定容到 1000mL0 115。。灭菌 20min。
14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的表面活性剂为:Tween80、TritonX-100、CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)、LAS (十二烷基苯磺酸钠)、SDS (十二烷基磺酸钠)、PEG600 (聚乙二醇)中的一种或多种。
15.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的反应温度为30~42°C。
16.本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的技术思想，均属于本发明 权利要求所定义的范围。
【文档编号】C12P13/06GK103898033SQ201210568351
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月25日 优先权日:2012年12月25日
【发明者】袁京, 董文玥, 吴洽庆, 朱敦明 申请人:中国科学院天津工业生物技术研究所