艰难梭菌外毒素a羧基端序列密码子优化基因片段、表达载体构建方法及其表达蛋白的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及密码子改造的艰难梭菌外毒素A羧基端基因片段、表达载体构建方法及其在大肠杆菌中的高效表达。该密码子改造后的基因序列既兼顾大肠杆菌密码子使用偏好，又降低了原始基因重复序列对于基因合成和表达的影响。本研究所涉及的高效表达载体由密码子改造后的艰难梭菌外毒素A羧基端基因与原核表达载体pET32b(+)组成，经IPTG诱导后可以高表达出带His标签的融合蛋白。该融合蛋白经凝血酶酶切后可以释放艰难梭菌外毒素A羧基端约872个氨基酸片段。本研究中经密码子改造的艰难梭菌外毒素A羧基端基因片段可以大肠杆菌中高效融合表达，纯化后的蛋白作为抗原可用于制备抗艰难梭菌外毒素A抗体和抗艰难梭菌感染疫苗的制备。
【专利说明】艰难梭菌外毒素A羧基端序列密码子优化基因片段、表达载体构建方法及其表达蛋白的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药【技术领域】，涉及密码子改造的艰难梭菌外毒素A羧基端基因片段、表达载体构建方法及其在大肠杆菌中的高效表达方法。
【背景技术】
[0002]艰难梭菌是一种革兰氏阳性、产芽孢、专性厌氧的梭状杆菌，是目前医院内感染的主要致病因素。艰难梭菌的感染是接触性传播，可通过口 -粪途径定植在结肠，并可通过与患者、被污染设备或物品(例如便盆、澡盆和电子直肠温度计)直接接触，医护人员间接接触，经过几天到8周的潜伏期，引起医院内艰难梭菌感染暴发。艰难梭菌治疗的难点在于作为休眠形式的芽孢可以耐受多种消毒剂，使其可以在医院环境中长期存在，因而一旦医院发生艰难梭菌感染暴发，难以在短时间内根除。
[0003]艰难梭菌毒性主要源于其表达的两种外毒素，毒素A和毒素B。这两种毒素都属于糖基转移酶类，可以使Rho蛋白家族的GTP酶失活。毒素A既是一种肠毒素又是一种细胞毒素，是艰难梭菌的主要毒力因子。研究表明，毒素A通过其羧基端与靶细胞表面受体结合来发挥毒性作用。已有研究证明抗艰难梭菌毒素A羧基端的抗体可以有效的中和其肠毒性和细胞毒性，从而对艰难梭菌的治疗起到积极作用。所以，艰难梭菌外毒素A羧基端是抗体开发的理想靶标，而通过合适的方法获得外毒素A羧基端片段是制备及检测其抗体的基础。
[0004]CN 101870978A中公开了一种即可在大肠杆菌中表达又可在哺乳动物中表达的密码子优化后的艰难梭菌毒素A羧基端序列，由于其兼顾性，存在原核表达系统与真核表达系统在密码自偏爱性方面的差异，其在大肠杆菌中的表达效率并不是很高。
【发明内容】
[0005]本发明提供一种可在大肠杆菌等原核系统中高效表达的艰难梭菌外毒素A羧基端基因片段，以及表达后的蛋白作为抗原在制备抗艰难梭菌外毒素A抗体和抗艰难梭菌感染疫苗中的应用。
[0006]本发明提供一种优化多重复区基因的方法，即以每个独立重复区的保守序列为模块进行多种密码子优化，再将优化后的模块进行组合得到多种重复性低且适于相应表达系统的新基因序列。
[0007]本发明还提供一种新的重组载体构建方法，运用多片段连接体系，即目的片段分两段或多段合成，后与载体同时连接的策略构建重组载体。
[0008]为实现上述目的，本发明提供了一种密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列，其是将艰难梭菌外毒素A原始序列重复区中保守氨基酸序列(conservative aasequence, CAS)的密码子优化为大肠杆菌中使用频率高的兼并性密码子，优化后的基因序列可在大肠杆菌中表达，而氨基酸序列不变。不同保守区的多种密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因重复序列的DNA序列(表2)，根据同源性分析选取的11个保守氨基酸序列命名为CAS1-11，其中，CASl密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID N0.1_5中的任一种序列，CAS2密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.7，CAS3密码子优化后的核苷酸序列选自SE QID N0.8或SEQ ID N0.9，CAS4密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID N0.10或SEQ ID N0.11，CAS5密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID N0.12或SEQ ID N0.13，CAS6密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID N0.14或SEQ ID N0.15，CAS7密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID N0.16或SEQ ID N0.17，CAS8密码子优化后的核苷酸序列选自SEQID N0.18或SEQ ID N0.19，CAS9密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ IDN0.20-24中的任一种序列，CASlO密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID N0.25或SEQ IDN0.26，CASll密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID N0.27或SEQ ID N0.28。由这些不同保守区的多种优化的重复序列可相互组合拼接成适合在大肠杆菌中表达的的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列。其中随机选取其中的三种优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列分别为:第一种优化组合具有SEQ ID N0.29所示的氨基酸序列、第二种优化组合具有SEQ ID N0.30所示的氨基酸序列，第三种优化组合具有SEQ ID N0.31所示的核苷酸序列。本发明设计合成了既符合大肠杆菌密码子偏爱性的毒素A羧基端核苷酸序列，同时通过同义密码子替换改善了原始序列多重复区对化学基因合成的影响，降低了合成成本；并且优化是在保证艰难梭菌外毒素A羧基端氨基酸序列不变的情况下，通过密码子改变对羧基端基因重复序列进行调整，充分考虑大肠杆菌密码子利用偏好进行基因序列优化，所获得的艰难梭菌外毒素A羧基端基因片段可在大肠杆菌原核系统中高效表达。
[0009]本发明还提供了上述经优化后的基因片段表达的蛋白及其在制备抗艰难梭菌外毒素A抗体和抗艰难梭菌感染疫苗中的应用。
[0010]本发明还提供了一种优化多重复区基因序列的方法，包括以每个独立重复区的保守序列为模块进行多种适应于表达系统的密码子优化，优化后的氨基酸序列不变，再将优化后的模块进行组合 得到多种重复性低且适于表达的新基因序列。其中重复区基因序列可为艰难梭菌外毒素A羧基端基因重复序列。所述表达系统为大肠杆菌表达系统。
[0011]本发明进一步提供了一种重组表达载体的构建方法，包括如下步骤:
[0012]A)将待表达的基因分成多段合成，一种优化的方案是分成两段合成，每段基因两端设计合适酶切位点；
[0013]B)通过PCR或限制性内切酶消化的方法获得与待表达的基因连接有对应酶切位点的载体。
[0014]C)将步骤A中获得的基因片段及步骤B获得的载体分别酶切回收后，在DNA连接酶作用下进行连接，获得含待表达基因的重组载体。
[0015]上述重组表达载体的构建方法中，基因片段可人工合成或用其他方法获得。
[0016]其中待表达的基因可为艰难梭菌外毒素A竣基端基因序列或其优化后的基因序列。
[0017]本发明创新的运用了多片段同时连接的策略，优选两片段连接，获得了高表达毒素A羧基端融合蛋白的重组质粒及工程菌；其所表达的毒素A羧基端蛋白具有凝血作用及肠毒性，与毒素A蛋白的功能一致。【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1艰难梭菌毒素A羧基端重复区示意图；
[0019]图2艰难梭菌毒素A羧基端重复区氨基酸序列同源性分析；
[0020]图3三片段连接过程及重组质粒图谱；
[0021 ] 图4表达载体转化子质粒电泳结果；
[0022]图5表达载体转化子质粒XhoI单酶切电泳结果；
[0023]图6表达载体转化子质粒XhoI与EcoRV双酶切电泳结果；
[0024]图7表达载体转化子质粒XhoI与XbaI双酶切电泳结果；
[0025]图8表达载体转化子质粒EcoRI与XbaI双酶切电泳结果；
[0026]图9艰难梭菌外毒素A羧基端蛋白诱导表达SDS-PAGE电泳结果图，其中，M:TAKARA蛋白质分子标准(低)，1:诱导前菌体样本，2:3h诱导菌体样本，3:8h诱导菌体样本；
[0027]图10毒素A羧基端融合蛋白纯化电泳结果图，其中样品采用NTA梯度洗脱；
[0028]图11毒素A羧基端融合蛋白纯化后超滤浓缩电泳结果图，其中，M、Takara分子量标准(低)；A、纯化后毒素A融合蛋白；
[0029]图12(His)6标签与毒素A羧基端融合蛋白经凝血酶酶切后电泳结果图，其中，M、Takara分子量标准(低)；A、凝血酶 酶切后毒素A蛋白；
[0030]图13艰难梭菌外毒素A羧基端蛋白(毒素A-DE3-1)凝血活性测定结果图；图中数字分别表示:1、空白对照；2、0.05 μ g ;3、0.I μ g ;4、0.2 μ g ;5、0.3 μ g ;6、0.4 μ g ;7、0.5 μ g ;8、0.6 μ g ；
[0031]图14艰难梭菌外毒素A羧基端蛋白毒素A-DE3-2凝血活性测定结果图；图中数字分别表示:1、空白对照;2、0.05μ g ；3,0.lug ；4,0.15 μ g ;5、0.2 μ g ;6、0.25 μ g ；7,
0.3 μ g ;8、0.35 μ g ;9、0.4 μ g ;10、0.5 μ g ;
[0032]图15艰难梭菌外毒素A羧基端蛋白毒素A-DE3-3凝血活性测定结果图，图中数字分别表示:1、空白对照;2、0.05 μ g ;3、0.Iyg ;4、0.15 μ g ;5、0.2μ g ;6、0.25 μ g ;7、
0.3 μ g ;8、0.35 μ g ;9、0.4 μ g ;10、0.5 μ g ;
[0033]图16艰难梭菌外毒素A羧基端蛋白毒素A-DE3-1注射给药肠毒性实验测定结果图；
[0034]图17艰难梭菌外毒素A羧基端蛋白毒素A-DE3-2注射给药肠毒性实验测定结果图；
[0035]图18艰难梭菌外毒素A羧基端蛋白毒素A-DE3-3注射给药肠毒性实验测定结果图；
[0036]图19免疫毒素A羧基端蛋白毒素A-DE3-1后小鼠血清中抗体产生情况图；
[0037]图20免疫毒素A羧基端蛋白毒素A-DE3-2后小鼠血清中抗体产生情况图；
[0038]图21免疫毒素A羧基端蛋白毒素A-DE3-3后小鼠血清中抗体产生情况图。
【具体实施方式】
[0039]本发明通过分段合成密码子优化后的艰难梭菌外毒素A羧基端基因片段，经分子克隆技术构建重组表达质粒pET32b(+)-TcdA-C。重组质粒转化表达宿主BL21(DE3)菌株后可被IPTG诱导表达，融合蛋白经相关鉴定为目的蛋白。另经凝血酶酶切后，可以释放完整的艰难梭菌外毒素A羧基端蛋白，凝集试验表明该方法表达的毒素A羧基端蛋白有凝集活性。
[0040]下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25°C。
[0041]实施例1密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列设计
[0042]选取艰难梭菌外毒素A基因羧基端2616个碱基序列(共编码872个氨基酸)，分析该编码序列，找出影响基因合成的重复序列，重复区示意图见图1。同时分析该序列与大肠杆菌密码子使用偏好不同的位点，用高频密码子替换低频密码子；另外，在兼顾大肠杆菌密码子偏好的基础上，用高频或中频密码子对重复区内的序列进行同义密码子替换，获得新的优化后的密码基因序列。
[0043]密码子改造的方法包括以下方面，即根据对重复区氨基酸序列的同源性分析(见图2),找出了同源性相近的保守氨基酸序列(conservative aa sequence, CAS),对这些保守氨基酸序列进行不同种类的同义密码子替换从而形成多种新核酸模块，这些核酸模块在不改变氨基酸序列的前提下可以置于不同的相关重复区内，均不影响艰难梭菌毒素A羧基端基因的转录与翻译。例如，重复区R4与R9的氨基酸序列完全相同，故优化后的R4与R9序列位置可以互换；重复区R5与R15仅有一个氨基酸的差异，两个保守序列也可以有多种组合，并且保证氨基酸序列不发生改变。也就是说，针对保守区氨基酸序列优化得到的新核酸模块的位置可以在含相关CAS的不同的重复区内进行互换，在保证氨基酸序列不发生改变的前提下可以形成多种新的基因序列，这些新序列均可用来在体外表达艰难梭菌毒素A羧基端蛋白。表1显示同源性相近的重复区内的保守序列:
[0044]表1:艰难梭菌外毒素A羧基端重复区及相关保守序列
[0045]
【权利要求】
1.一种密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列，其是将艰难梭菌外毒素A原始序列重复区中保守氨基酸序列(conservative aa sequence, CAS)的密码子优化为大肠杆菌中使用频率高的兼并性密码子，优化后的基因序列可在大肠杆菌中表达，而氨基酸序列不变。
2.根据权利要求1所述的密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列，根据同源性分析选取的11个保守氨基酸序列命名为CAS1-11，其中，CASl密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID N0.1-5中的任一种序列，CAS2密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.7，CAS3密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID N0.8或SEQ ID N0.9，CAS4密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID N0.10或SEQ ID N0.11，CAS5密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID N0.12或SEQ ID N0.13，CAS6密码子优化后的核苷酸序列选自SEQID N0.14或SEQ ID N0.15，CAS7密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID N0.16或SEQ IDN0.17，CAS8密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID N0.18或SEQ ID N0.19，CAS9密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID N0.20-24中的任一种序列，CASlO密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID N0.25或SEQID N0.26，CASll密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ IDN0.27 或 SEQ ID N0.28。
3.根据权利要求2所述的密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列，其具有SEQID N0.29、SEQ ID N0.30 或 SEQ ID N0.31 所示的核苷酸序列。
4.权利要求1-3任一项所述的艰难梭菌外毒素A羧基端基因编码的蛋白在制备抗艰难梭菌外毒素A抗体中的应用。
5.权利要求1-3任一项所述的艰难梭菌外毒素A羧基端基因编码的蛋白在制备抗艰难梭菌感染疫苗中的应用。
6.一种优化多重复区基因序列的方法，包括以每个独立重复区的保守序列为模块进行多种适应于表达系统的密码子优化，优化后的氨基酸序列不变，再将优化后的模块进行组合得到多种重复性低且适于表达的新基因序列。`
7.根据权利要求6所述的方法，所述多重复区基因序列为艰难梭菌外毒素A羧基端基因重复序列。
8.根据权利要求6所述的方法,所述表达系统为大肠杆菌表达系统。
9.一种重组表达载体的构建方法，包括如下步骤: A)将待表达的基因分成多段获得，优选两段，每段基因两端设计合适酶切位点； B)通过PCR或限制性内切酶酶消化的方法获得与待表达的基因有对应酶切位点的载体。 C)将步骤A中获得的基因片段及步骤B获得的载体分别酶切回收后，在DNA连接酶作用下进行连接，获得含有待表达基因的重组载体。
10.根据权利要求9所述的方法，所述基因片段可人工合成或用其他方法获得。
11.根据权利要求9所述的方法，其中待表达的基因为密码子优化的艰难梭菌外毒素A竣基端基因序列。
12.根据权利要求11所述的方法，其中待表达的基因为选自权利要求1-3所述的密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列。
【文档编号】C12N15/70GK103865938SQ201210568057
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2012年12月16日 优先权日:2012年12月16日
【发明者】刘红, 冯东晓, 邢平平, 徐从伦, 李敏, 郭桂平, 于锦丽, 赵志伟 申请人:山东国际生物科技园发展有限公司