一种利用动物乳腺生产人血清白蛋白的方法及其表达载体的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用转基因动物的乳腺生产人血清白蛋白的方法及其表达载体。本发明的方法，包括利用载体将人血清白蛋白基因表达盒转入哺乳动物基因组中获得转基因动物，从转基因动物乳汁中获得人血清白蛋白，所述的人血清白蛋白基因表达盒从5’到3’依次包括启动子、人血清白蛋白基因和终止子，还包括人血清白蛋白基因3’旁侧序列M2和β-酪蛋白基因的3’旁侧序列B3中的一种或两种，M2或B3位于终止子之后。本发明的方法，在动物的乳汁中人血清白蛋白的浓度至少可达到4.6-6.7g/L，完全能够达到商业利用的水平。从转基因牛的牛奶中分离获得人血清白蛋白给人血清白蛋白的生产提供了一种低成本，高产量的好方法。
【专利说明】一种利用动物乳腺生产人血清白蛋白的方法及其表达载体
【技术领域】
[0001]本发明涉及转基因技术，具体涉及一种人血清白蛋白的表达水平高的利用转基因动物的乳腺生产人血清白蛋白的方法以及其中所用到的表达载体。
【背景技术】
[0002]人血清白蛋白是血浆中最为丰富的蛋白质，对维持血浆胶体渗透压、营养和体内物质运输等具有重要的作用，并广泛应用于烧伤、休克、营养不良、慢性消耗性疾病等的治疗。目前临床上所需的白蛋白，几乎全部采用献血员的血浆。然而由于血源不足的困难，尤其是采用献血员的血浆有感染肝炎HIVl病毒、艾滋病毒等危险，因此大量生产安全的白蛋白一直是一个难以达到又迫切需要达到的目标。
[0003]《山羊β酪蛋白基因启动子指导人血清白蛋白基因在小鼠组织中的特异性表达》(遗传HEREDITAS (Beijing) 23 (6): 518~520，2001),介绍了一种山羊beta酪蛋白基因启动子指导人血清白蛋白基因的表达载体，利用该载体制备转基因动物，通过转基因动物来生产人血清白蛋白。但是该技术中，人血清白蛋白的产量极低，达不到具有商业意义的浓度水平。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是针对现有的利用转基因动物的乳腺生产人血清白蛋白的方法中人血清白蛋白的表达水平低下的不足，提供一种人血清白蛋白的表达水平高的利用转基因动物的乳腺生产人血清白蛋白的方法以及其中所用到的表达载体。
[0005]为此，本发明的技术方案之一是:一种利用转基因动物的乳腺组织生产人血清白蛋白的方法，包括利用含有人血清白蛋白基因表达盒的载体将人血清白蛋白基因表达盒转入哺乳动物基因组中获得转基因动物，使该转基因动物分泌乳汁，从乳汁中获得人血清白蛋白，其中，所述的人血清白蛋白基因表达盒还包括人血清白蛋白基因3’旁侧序列M2和β -酪蛋白基因的3’旁侧序列Β3中的一种或两种。
[0006]本发明中，所述的人血清白蛋白基因3’旁侧序列M2是本领域常规，较佳的，所述M2的序列如Genebank数据库中的序列AC108157.3的第86983位到第93655位所示。
[0007]所述的β -酪蛋白基因的3’旁侧序列Β3是本领域常规，较佳的是牛β -酪蛋白基因的3’旁侧序列Β3或者羊β-酪蛋白基因的3’旁侧序列Β3。更佳的，所述Β3的序列如Genebank数据库中的序列ΑΥ154895.1的第15803位到第21170位所示。
[0008]所述的人血清白蛋白基因3’旁侧序列M2或β -酪蛋白基因的3’旁侧序列Β3在人血清白蛋白基因表达盒中位于终止子之后。
[0009]本发明中，所述的人血清白蛋白基因表达盒是本领域常规，包括启动子、人血清白蛋白基因和终止子。其中，所述的启动子是本领域常规，只要能够在哺乳动物细胞中启动下游基因的表达即可，较佳的是在哺乳动物乳腺组织中启动表达效率高的启动子，较佳的是β_酪蛋白基因启动子，更佳的是山羊β_酪蛋白基因启动子。[0010]所述的人血清白蛋白基因是本领域常规，较佳的是人血清白蛋白的编码序列或者是含有内含子I的人血清白蛋白的编码序列。更佳的，所述hAlbcDNA片段的序列如Genebank数据库中的序列NM 000477.5所不。
[0011 ] 所述的终止子是本领域常规。
[0012]本发明中，所述的含有人血清白蛋白基因表达盒的载体的载体骨架是本领域常规，只要能够在哺乳动物中表达即可，优选真核表达载体、逆病毒载体或者慢病毒载体，最优选质粒pcDNA3.1 (_)。
[0013]本发明中，所述将人血清白蛋白基因表达盒转入哺乳动物基因组中获得转基因动物的方法是常规，较佳的是将真核表达载体原核显微注射入哺乳动物的受精卵中，然后移植入假受孕动物中，从而得到转基因动物；或者是慢病毒载体显微注射哺乳动物受精卵的卵周隙，将感染的受精卵移植入假受孕动物中，从而得到转基因动物。[0014]本发明中所述的哺乳动物是常规，较佳的是小鼠或奶牛，不包括人。
[0015]本发明的技术方案之二是:一种用于制备转基因哺乳动物使其乳腺组织高表达人血清白蛋白的载体，其含有人血清白蛋白基因表达盒，其中，所述的人血清白蛋白基因表达盒还包括人血清白蛋白基因3’旁侧序列M2和β -酪蛋白基因的3’旁侧序列Β3中的一种或两种。
[0016]该人血清白蛋白基因表达盒的其它优选方式如上所述。
[0017]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0018]本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0019]本发明的积极进步效果在于:利用乳腺生物反应器获得药用人血清白蛋白，是一种安全高效且高利润的方法。乳腺生物反应器产业的特点是成本固定化，即在原料一致的情况下其成本是不变的。所以当提高了乳汁中的蛋白表达量时，提高量获得的将会是药品的净利润。所以业界一般认为只要有50%的蛋白提高，利润就能翻倍。目前已有的人血清白蛋白载体，其蛋白表达约在lg/L，勉强能够达到产业化的标准。而本发明提供的方法，在动物的乳汁中人血清白蛋白的浓度至少可达到4.6-6.7g/L，则利润可提高约7-11倍。因此本发明从转基因牛的牛奶中分离获得人血清白蛋白给人血清白蛋白的生产提供了一种低成本，高产量的好方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为本发明载体构建示意图。
[0021]图2是对照载体构建示意图。
【具体实施方式】
[0022]本发明提供了一种乳腺高表达的人血清白蛋白载体。本发明改进了载体使表达水平更高。
[0023]首先，本发明用hAlb cDNA序列替换了带有intron I的hAlb序列，发现能够防止异常剪接的发生，提高Mlb的表达效率。本发明还在hAlb cDNA之后加入人hAlb的旁侧序列M2、以及牛β酪蛋白基因的旁侧序列Β3中的任何一种或两种，发现无论是在细胞水平还是在个体水平hAlb的表达都有显著提高。
[0024]M2序列为人血清白蛋白基因3 ’旁侧序列，本发明人发现其中富含多个CPG岛，将其用于本发明的转基因载体后，发现可以用于提高转基因动物乳腺中hAlb的表达。B3序列为牛β酪蛋白基因的3’旁侧序列，本发明人发现其中富含NF1、C/EBP、STAT5及GR等多种重要转录因子的结合位点，将其用于本发明的转基因载体后，发现其可以提高转基因动物乳腺中山羊β酪蛋白启动子的表达强度，提高Mlb的表达水平。
[0025]本发明的载体提高了人血清白蛋白在转基因动物乳腺中的表达，而在体内其它组织中的表达基本没有提闻。
[0026]本发明人首先制备了 3个构建载体的片段，然后用这些片段构建了 4种可在哺乳动物细胞中表达人血清白蛋白的表达载体，用这些表达载体转染哺乳动物细胞，并制备转基因动物，使这些转基因动物受孕泌乳，从乳汁中提取得到人血清白蛋白，发现人血清白蛋白的产量较现有技术提高可达100多倍，从而完成了本发明。
[0027]制备3个构建载体的片段
[0028]人外周血细胞cDNA为模板，利用引物PCR扩增获得hAlb cDNA片段(2.5kb)，测序所得序列与序列匪000477.5 (人血清白蛋白cDNA序列)比对完全一致。
[0029]人外周血细胞DNA为模板，利用弓丨物PCR扩增获得M2片段(6.7kb)，测序所得序列与序列AC108157.3 (人血清白蛋白3’基因旁侧序列)比对完全一致。
[0030]奶牛外周血细胞DNA为模板，利用引物PCR扩增获得B3片段(5.4kb)，测序所得序列与序列AY154895.1 (牛β酪蛋白基因的3’旁侧序列)比对完全一致。
[0031]构建4种人血清白蛋白的表达载体
[0032]用Pme1、BamHI 酶切 pcDNA3.1 (-) _Bp6.7-hAlb-1ntronI，回收 12.2Kb 的 DNA 片段，补平，与hAlb cDNA片段连接，获得pcDNA3.1 (-) _Bp6.7_hAlb载体(后简称hAlb)。
[0033]BamHI 切开质粒 pcDNA3.1-Bp6.7-hAlb,补平，与 5.4Kb B3 片段连接，获得pcDNA3.1 (-) -Bp6.7_hAlb_B3 载体(后简称 hAlb_B3)。
[0034]将6.7Kb M2 片段与 BamHI 切开的载体 pcDNA3.1_Βρ6.7-hAlb 连接，获得 pcDNA3.1(-)-Bp6.7-hAlb-M2 载体(后简称 hAlb_M2)。
[0035]BamHI 切开质粒 pcDNA3.1-Bp6.7_hAlb_M2，补平，5.4Kb Β3 片段连接，获得pcDNA3.1 (-) -Bp6.7-hAlb_M2_B3 载体。
[0036]用Xho I线性化市售常见的乳腺表达载体pBCl，补平，与hAlb cDNA片段连接，获得pBCl-hAlb载体，作为对照载体。
[0037]表达载体转染哺乳动物细胞
[0038]将上述5 种表达载体，再加 pcDNA3.1 (-)_Bp6.7-hAlb-1ntronI，转染 HCll 细胞，抽提RNA，利用定量PCR方法检测Alb表达，结果无内含子hAlb、M2、B3都能提高表达量，尤其是hAlb的B3组合表达量最高，而hAlb-M2-B3的表达量提高没有hAlb的B3组合明显。
[0039]表达载体制备转基因动物
[0040]将四种载体用Sal I线性化，获得DNA溶液；采集受精卵，将DNA溶液显微注射入小鼠受精卵；将受精卵吹入输卵管，移植入假受孕鼠；提取鼠尾组织DNA，利用PCR鉴定Alb阳性转基因小鼠；取转基因母 鼠配种，待分娩后，挤压乳腺，使乳汁从乳头中溢出，用移液枪收集乳液，检测乳汁中的人血清白蛋白表达，结果和上述细胞水平的结果相同。[0041]下面用实施例进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0042]实施例1
[0043]—、片段合成
[0044]I) hAlb cDNA 片段的扩增。
[0045]用上游引物Alb-F:5，— CTGTCAACCCCACACGCCTT — 3’ (SEQ ID N0.1)，下游引物Alb-R:5’ 一 TT IGGATCCj TTCATTTTCTTTCT 一 3’ (SEQ ID N0.2)，人外周血细胞 cDNA 为模板，进行PCR扩增。反应体系如下:
【权利要求】
1.一种利用转基因动物的乳腺组织生产人血清白蛋白的方法，包括利用含有人血清白蛋白基因表达盒的载体将人血清白蛋白基因表达盒转入哺乳动物基因组中获得转基因动物，使该转基因动物分泌乳汁，从乳汁中获得人血清白蛋白，所述的人血清白蛋白基因表达盒从5’到3’依次包括启动子、人血清白蛋白基因和终止子，其特征在于，所述的人血清白蛋白基因表达盒还包括人血清白蛋白基因3’旁侧序列M2和β-酪蛋白基因的3’旁侧序列Β3中的一种或两种，M2或Β3在人血清白蛋白基因表达盒中位于终止子之后，M2的序列如Genebank数据库中的序列AC108157.3的第86983位到第93655位所示，Β3的序列如Genebank数据库中的序列ΑΥ154895.1的第15803位到第21170位所示，所述的哺乳动物是小鼠。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的启动子是山羊β_酪蛋白基因启动子。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的人血清白蛋白基因是人血清白蛋白的编码序列或者是含有内含子I的人血清白蛋白的编码序列。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的含有人血清白蛋白基因表达盒的载体是真核表达载体PCDNA3.1 (_)。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的哺乳动物是牛或羊。
6.一种用于制备转 基因哺乳动物使其乳腺组织高表达人血清白蛋白的载体，其含有人血清白蛋白基因表达盒，所述的人血清白蛋白基因表达盒从5’到3’依次包括启动子、人血清白蛋白基因和终止子，其特征在于，所述的人血清白蛋白基因表达盒还包括人血清白蛋白基因3’芳侧序列M2和β _酿蛋白基因的3’芳侧序列Β3中的一种或两种，M2或Β3在人血清白蛋白基因表达盒中位于终止子之后，M2的序列如Genebank数据库中的序列AC108157.3的第86983位到第93655位所示，Β3的序列如Genebank数据库中的序列ΑΥ154895.1的第15803位到第21170位所示。
7.如权利要求6所述的载体，其特征在于，所述的启动子是β-酪蛋白基因启动子。
8.如权利要求6所述的载体，其特征在于，所述的人血清白蛋白基因是人血清白蛋白的编码序列或者是含有内含子I的人血清白蛋白的编码序列。
9.如权利要求6所述的载体，其特征在于，所述的含有人血清白蛋白基因表达盒的载体是真核表达载体PCDNA3.1 (_)。
【文档编号】C12N15/14GK103898157SQ201210567600
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月24日 优先权日:2012年12月24日
【发明者】曾溢滔, 曾凡一, 蔡勤, 方彧聃, 黄淑帧 申请人:上海市儿童医院, 上海滔滔转基因工程股份有限公司