高效表达重组人血清白蛋白工程菌的构建的制作方法

本申请是申请号为201780027907.9、申请日为2017年5月4日、发明名称为“高效表达重组人血清白蛋白工程菌的构建”的中国发明专利申请的分案申请。本发明涉及人血清白蛋白的重组生产，具体而言，本发明涉及通过在酵母细胞中共表达人血清白蛋白与一种或多种人血清白蛋白表达促进因子来高效生产人血清白蛋白的方法。
背景技术：
：人血清白蛋白(humanserumalbumin，hsa)是人血中含量最丰富的蛋白质，占血浆总蛋白含量约60％，具有重要的生理功能，可维持血液渗透压，是运输内源性及外源性物质的重要载体和重要的血液缓冲组分。此外，hsa还可以作为细胞培养基的添加成分、药物辅料等，具有重要应用价值。目前，hsa的来源主要有两种：一种是从血浆中提取，由于国内血浆紧缺以及存在艾滋病、肝炎等病毒感染的风险，该方法获得的hsa无法满足巨大的市场需求；另一种是利用生物工程技术进行重组制备。利用生物工程技术重组制备的人血清白蛋白叫做重组人血清白蛋白(recombinanthumanserumalbumin，rhsa)。其中，酵母表达rhsa技术研究得最广泛、最成熟。专利us5683893公开了一种对毕赤酵母醇氧化酶(alcoholoxidase，aox)启动子进行突变的方法，增强了rhsa在酵母中的表达。2005年4月29日提交的中国专利申请200510068171.9公开了一种rhsa酵母菌株构建及发酵方法，表达量可以达到10g/l培养基上清。但是，上述方法仍然存在rhsa表达量较低、发酵时间长、生产效率低等缺陷，需要寻找新的方法构建更加高产的工程菌株。毕赤酵母(pichia)具有真核生物蛋白翻译后修饰功能，使得外源蛋白在表达后能够正确折叠、组装并分泌到胞外。同时，毕赤酵母能有效利用甲醇作为单一碳源进行高密度发酵。因此，毕赤酵母已经广泛用于外源蛋白的表达。但是，毕赤酵母的发酵周期一般较长、生产成本高，并且容易发生污染及蛋白降解。所以，缩短发酵时间、降低成本成为该表达体系的研究热点。酵母内质网(endoplasmicreticulum，er)是蛋白质折叠成天然构象、进行糖基化和磷酸化等后修饰的重要场所。当内质网中存在大量未折叠蛋白时，会诱发未折叠蛋白应答效应(unfoldedproteinresponse，upr)，进而激活下游分子伴侣、折叠酶的表达以及内质网相关的蛋白质降解途径。作为自身调节机制，upr对酵母生长及分泌蛋白的表达具有重要的作用(grahamwhyteside,etal.febsletters2011；585:1037-1041)。转录激活因子hac1(transcriptionalactivatorhac1)作为酵母upr的调控因子，能够调控与upr相关的一系列蛋白质的表达，包括结合蛋白kar2(bindingproteinkar2)、蛋白质二硫键异构酶(proteindisulfide-isomerase，pdi)、内质网氧化还原酶(endoplasmicreticulumoxidoreductin-1，ero1)、脯氨酸顺反异构酶(peptidyl-prolylcis-transisomerase，ppi)等，它们在帮助目的蛋白质表达与分泌的过程中发挥着重要的作用。2013年3月22日提交的中国专利申请201310095971.4公开了一种将pdi与黑曲霉α-葡萄糖苷酶共表达的方法，增加了目的蛋白的表达量。2007年5月16日提交的中国专利申请200780026864.9公开了一种增强甲醇同化酵母(ogataeaminuta)hac1表达的方法，获得的工程菌株有较高的蛋白分泌能力。tizianalodi等报道在乳酸克鲁维酵母(kluyveromyceslactis)中，ero1能有助于rhsa的分泌(tizianalodi.etal.aem2005；71:4359-4363)。此外，在毕赤酵母中共表达kar2使人源单链抗体片段(a33scfv)的表达量提高了两倍(leonardom.damasceno,etal.applmicrobiolbiotechnol,2007；74:381-389)。技术实现要素：本发明提供了一种高效表达重组人血清白蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：在酵母宿主细胞中，将(a)人血清白蛋白基因与(b)一种或多种rhsa表达促进因子基因进行共表达。将外源的人血清白蛋白基因与rhsa表达促进因子基因引入酵母宿主细胞后，显著提高了rhsa的表达量。本发明还提供了一种高效表达重组人血清白蛋白的工程菌，其中该工程菌为酵母，并且包含：(a)人血清白蛋白基因与(b)一种或多种rhsa表达促进因子基因。在一些实施方案中，其中所述酵母为毕赤酵母属(pichia)；优选地，所述酵母为巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)。在一些实施方案中，所述rhsa表达促进因子选自由转录激活因子hac1、结合蛋白kar2、蛋白质二硫键异构酶(pdi)、内质网氧化还原酶(ero1)和脯氨酸顺反异构酶(ppi)构成的组。在本发明的一些实施例中，所述酵母宿主细胞中共表达以下组合：rhsa与ero1；rhsa与pdi；rhsa、pdi与hac1；rhsa、ppi与kar2；或者rhsa、pdi、ppi与hac1。在一些实施方案中，本发明的人血清白蛋白基因可以通过质粒转化入所述酵母宿主细胞；所述rhsa表达促进因子基因可以通过1个、2个或更多个质粒转化入所述酵母宿主细胞。在一些实施方案中，本发明的工程菌中无需使宿主基因组中原有的rhsa表达促进因子基因失活，因此所获得的工程菌可以同时包含转入的hsa基因和rhsa表达促进因子基因以及宿主细胞中原有的rhsa表达促进因子基因。在本发明的一些实施方案中，本发明的工程菌可以高效表达rhsa，其中共表达菌株中rhsa的表达量明显提高，最高可达18.2g/l发酵上清，为rhsa大规模工业化生产奠定了坚实基础。附图说明图1显示编码hsa的dna序列。图2显示由图1所示dna序列编码hsa的氨基酸序列。图3显示编码毕赤酵母ero1的dna序列。图4显示由图3所示dna序列编码ero1的氨基酸序列。图5显示编码毕赤酵母hac1的dna序列。图6显示由图5所示dna序列编码hac1的氨基酸序列。图7显示编码毕赤酵母pdi的dna序列。图8显示由图7所示dna序列编码pdi的氨基酸序列。图9显示编码毕赤酵母ppi的dna序列。图10显示由图9所示dna序列编码ppi的氨基酸序列。图11显示编码毕赤酵母kar2的dna序列。图12显示由图11所示dna序列编码kar2的氨基酸序列。图13显示了rhsa毕赤酵母分泌表达载体。图14显示了ppiczα-ero1毕赤酵母表达载体图15显示了ppic6-hac1毕赤酵母表达载体图16显示了ppiczα-pdi毕赤酵母表达载体具体实施方式本文所用的术语“rhsa表达促进因子”是指能够促进rhsa表达的各种蛋白因子，其来源并不局限于特定的种属。具体而言，包括具有分子伴侣活性的蛋白，例如kar2；折叠酶，例如pdi；以及转录调节因子，例如hac1等。特别适合于本发明的具体的rhsa表达促进因子包括：转录激活因子hac1、结合蛋白kar2、蛋白质二硫键异构酶(pdi)、内质网氧化还原酶(ero1)和脯氨酸顺反异构酶(ppi)等。“rhsa表达促进因子”的来源并不局限于特定的种属。例如，来源于酿酒酵母的rhsa表达促进因子例如pdi，可以在毕赤酵母中很好地发挥作用。本领域技术人员可以理解，“rhsa表达促进因子”也包括在氨基酸序列上与上述表达促进因子相比具有一个或几个氨基酸残基的取代、添加或缺失，并具有基本相似的生物学功能的蛋白质或活性片段，也可以包括含有这些蛋白质或其活性片段的修饰产物、融合蛋白及复合物。优选地，所述rhsa表达促进因子来源于该宿主细胞。例如，来自毕赤酵母的rhsa表达促进因子优选被导入毕赤酵母宿主细胞中进行表达。本领域技术人员可以理解，不同类促进因子的不同组合方式可以产生不同的技术效果，例如：同时加入转录调节因子hac1和折叠酶pdi得到了比单独使用pdi更好的促进表达rhsa的效果。所述rhsa表达促进因子可以单独引入，也可以组合引入。例如，在本发明的一些实施方案中，一种rhsa表达促进因子(包括ero1、hac1、kar2、pdi、ppi等)被单独引入宿主细胞，与rhsa共表达，并显著提高了表达量。例如，与不使用表达促进因子时的表达量相比，将pdi与rhsa共表达，使得rhsa的表达量提高了160％。在本发明的一些实施方案中，rhsa表达促进因子可以被两两组合引入宿主细胞。例如，与不使用表达促进因子时的表达量相比，组合使用pdi和hac1，使得rhsa的表达量提高了将近两倍。在本发明的一些实施方案中，可以将三种或者更多种rhsa表达促进因子引入宿主细胞。例如，在本发明的具体实施方案中，rhsa与三种表达促进因子pdi、ppi与hac1在宿主细胞中被共表达，显著提高了rhsa的表达量。在本发明的一些实施方案中，发明人采用基因工程技术，克隆了毕赤酵母gs115菌株的ero1、hac1、kar2、pdi、ppi基因，构建了诱导型表达载体，通过将这些蛋白质与rhsa共表达，经过多种组合筛选，获得了高表达、高效率的酵母工程菌。实施例1、hsa克隆及表达载体构建表达载体ppic9k(购自invitrogen公司)带有酵母α-factor信号肽，可以用于分泌表达外源蛋白。根据genbank公布的nm_000477.5序列设计如下引物：(酶切位点以下划线标出)hsaforward：ccgctcgagaaaagagacgctcacaagagtgaggt(seqidno:1)hsareverse：ccggaattcttataagcctaaggcagcttgacttgc(seqidno:2)以人肝脏cdna文库为模板，进行聚合酶链式反应(pcr)，具体条件为：94℃变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟，共进行30个循环；然后72℃延伸10分钟。获得的pcr产物经过xhoi与ecori酶切消化后，插入到ppic9k载体，获得载体ppic9k-hsa，结构如图13所示。hsadna序列测序正确，结果如图1所示。所对应的氨基酸序列如图2所示。2、rhsa酵母分泌表达菌株的构建与筛选本发明采用毕赤酵母gs115(购自invitrogen公司)作为宿主菌，ppic9k-hsa载体经过sali酶切线性化，电转化入gs115菌株。感受态制备与电转化的方法均参照文献(jamesm.creggpichiaprotocols2nd)。插入片段整合入gs115染色体his4位点，转化菌株采用含有2mg/ml遗传霉素(g418)的ypd(yeastextractpeptonedextrosemedium)固体培养基进行抗生素富集筛选，获得了可以分泌表达rhsa的酵母菌株gs115-rhsa。3、毕赤酵母ero1基因的克隆及载体构建从ncbi数据库中获得毕赤酵母ero1基因的dna序列，设计如下引物进行基因扩增：(酶切位点以下划线标出)eroforward:cggttcgaaagcatgaaccctcaaatcccttt(seqidno:3)eroreverse:gctggcggccgcttacaagtctactctatatgtgg(seqidno:4)以毕赤酵母gs115菌株基因组为模板，通过pcr反应获得ero1基因，使用snabi与noti双酶切消化，插入表达载体ppiczα(购自invitrogen公司)，获得载体ppiczα-ero1，结构如图14所示。ero1dna序列测序正确，如图3所示。所对应的氨基酸序列如图4所示。4、毕赤酵母hac1基因的克隆及载体构建从ncbi数据库中获得毕赤酵母hac1基因的dna序列，设计如下引物进行基因扩增：(酶切位点以下划线标出)hacforward:cggttcgaaacgatgcccgtagattcttct(seqidno:5)hacreverse:gctggcggccgcctattcctggaagaatacaaagtc(seqidno:6)酵母rna提取及反转录方法参考文献(j.萨姆布鲁克等，分子克隆试验指南第三版)。以毕赤酵母gs115菌株cdna为模板，通过pcr反应获得hac1基因，使用snabi与noti双酶切消化，插入表达载体ppic6(购自invitrogen公司)，获得载体ppic6-hac1，结构如图15所示。hac1dna序列测序正确，结果如图5所示。所对应的氨基酸序列如图6所示。5、毕赤酵母pdi基因的克隆及载体构建从ncbi数据库中获得毕赤酵母pdi基因的dna序列，设计如下引物进行基因扩增：(酶切位点以下划线标出)pdiforward:cggttcgaaacgatgcaattcaactggaatatt(seqidno:7)pdireverse:gctggcggccgcttaaagctcgtcgtgagcgtctgc(seqidno:8)以毕赤酵母gs115菌株基因组为模板，通过pcr反应获得pdi基因，使用snabi与noti双酶切消化，插入表达载体ppiczα(购自invitrogen公司)，获得载体ppiczα-pdi，结构如图16所示。pdidna序列测序正确，结果如图7所示。所对应的氨基酸序列如图8所示。6、毕赤酵母ppi基因的克隆及载体构建从ncbi数据库中获得毕赤酵母ppi基因的dna序列，设计如下引物进行基因扩增：(酶切位点以下划线标出)ppiforward:cggttcgaaacgatggaattaaccgcattgcgcagc(seqidno:9)ppireverse:gctggcggccgcttacaactcaccggagttggtgatc(seqidno:10)以毕赤酵母gs115菌株基因组为模板，通过pcr反应获得ppi基因，使用snabi与noti双酶切消化，插入表达载体ppic6(购自invitrogen公司)，获得载体ppic6-ppi。dna序列测序正确，序列如图9所示，所对应的氨基酸序列如图10所示。7、毕赤酵母kar2基因的克隆及载体构建从ncbi数据库中获得毕赤酵母kar2基因的dna序列，设计如下引物进行基因扩增：(酶切位点以下划线标出)kar2forward:cggttcgaaacgatgctgtcgttaaaaccatct(seqidno:11)kar2reverse:gctggcggccgcctatgatcatgatgagttgtag(seqidno:12)以毕赤酵母gs115菌株基因组为模板，通过pcr反应获得kar2基因，使用snabi与noti双酶切消化，插入表达载体ppic6(购自invitrogen公司)，获得载体ppic6-kar2。dna序列测序正确，序列如图11所示，所对应的氨基酸序列如图12所示。8、ero1与rhsa共表达菌株的构建及筛选以rhsa分泌表达菌株gs115-rhsa为原始菌株，上述构建好的ppiczα-ero1载体经过saci酶切线性化，电转化入gs115-rhsa菌株。感受态制备与电转化的方法均参照文献(jamesm.creggpichiaprotocols2nd)。插入片段整合入gs115-rhsa菌株染色体5’aox位点。转化菌株采用含有2mg/ml博来霉素(zeocin)的ypd固体培养基进行抗生素富集筛选，获得了ero1与rhsa共表达的酵母菌株gs115-rhsa-ero1。9、hac1与rhsa共表达菌株的构建及筛选以rhsa分泌表达菌株gs115-rhsa为原始菌株，实施例4构建的ppic6-hac1载体经过saci酶切线性化，电转化入gs115-rhsa菌株。感受态制备与电转化的方法均参照文献(jamesm.creggpichiaprotocols2nd)。插入片段整合入gs115-rhsa菌株染色体5’aox位点。转化菌株采用含有1mg/ml杀稻瘟菌素(blasticidin)的ypd固体培养基进行抗生素富集筛选，获得了hac1与rhsa共表达的酵母菌株gs115-rhsa-hac1。10、pdi与rhsa共表达菌株的构建及筛选以rhsa分泌表达菌株gs115-rhsa为原始菌株，上述构建好的ppiczα-pdi载体经过saci酶切线性化，电转化入gs115-rhsa菌株。感受态制备与电转化的方法均参照文献(jamesm.creggpichiaprotocols2nd)。插入片段整合入gs115-rhsa菌株染色体5’aox位点。转化菌株采用含有2mg/ml博来霉素(zeocin)的ypd固体培养基进行抗生素富集筛选，获得了pdi与rhsa共表达的酵母菌株gs115-rhsa-pdi。11、ppi与rhsa共表达菌株的构建及筛选以rhsa分泌表达菌株gs115-rhsa为原始菌株，实施例6构建的ppic6-ppi载体经过pmei酶切线性化，电转化入gs115-rhsa菌株。感受态制备与电转化的方法均参照文献(jamesm.creggpichiaprotocols2nd)。插入片段整合入gs115-rhsa菌株染色体5’aox位点。转化菌株采用含有1mg/ml杀稻瘟菌素(blasticidin)的ypd固体培养基进行抗生素富集筛选，获得了ppi与rhsa共表达的酵母菌株gs115-rhsa-ppi。12、kar2与rhsa共表达菌株的构建及筛选以rhsa分泌表达菌株gs115-rhsa为原始菌株，实施例7构建的ppic6-kar2载体经过pmei酶切线性化，电转化入gs115-rhsa菌株。感受态制备与电转化的方法均参照文献(jamesm.creggpichiaprotocols2nd)。插入片段整合入gs115-rhsa菌株染色体5’aox位点。转化菌株采用含有1mg/ml杀稻瘟菌素(blasticidin)的ypd固体培养基进行抗生素富集筛选，获得了kar2与rhsa共表达的酵母菌株gs115-rhsa-kar2。13、hac1、pdi与rhsa共表达菌株的构建及筛选以表达菌株gs115-rhsa-pdi为原始菌株，上述构建好的ppic6-hac1载体经过saci酶切线性化，电转化入gs115-rhsa-pdi菌株。感受态制备与电转化的方法均参照文献(jamesm.creggpichiaprotocols2nd)。插入片段整合入gs115-rhsa-pdi菌株染色体5’aox位点。转化菌株采用含有1mg/ml杀稻瘟菌素(blasticidin)的ypd固体培养基进行抗生素富集筛选，获得了hac1、pdi与rhsa共表达的酵母菌株gs115-rhsa-pdi-hac1。14、ppi、pdi与rhsa共表达菌株的构建及筛选以实施例10筛选的表达菌株gs115-rhsa-pdi为原始菌株，实施例6构建的ppic6-ppi载体经过pmei酶切线性化，电转化入gs115-rhsa-pdi菌株。感受态制备与电转化的方法均参照文献(jamesm.creggpichiaprotocols2nd)。插入片段整合入gs115-rhsa-pdi菌株染色体5’aox位点。转化菌株采用含有1mg/ml杀稻瘟菌素(blasticidin)的ypd固体培养基进行抗生素富集筛选，获得了ppi、pdi与rhsa共表达的酵母菌株gs115-rhsa-pdi-ppi。15、rhsa共表达菌株摇瓶诱导表达分别挑取上述实施例中筛选的gs115-rhsa-ero1、gs115-rhsa-hac1、gs115-rhsa-pdi、gs115-rhsa-ppi、gs115-rhsa-kar2、gs115-rhsa-pdi-hac1及gs115-rhsa-pdi-ppi菌株单菌落，接种于2毫升mgy(1.34％酵母氮源碱；1.0％甘油；4.0×10-5生物素)培养基，30℃培养16小时，离心后收集菌体，转移至20毫升bmmy(1.0％酵母浸出物；2.0％蛋白胨；0.1m磷酸钾缓冲液，ph6.0；1.34％酵母氮源碱；0.5％无水甲醇)培养基培养，诱导表达72小时，其中每12小时补加50微升无水甲醇。诱导结束后取培养上清进行sds-page电泳检测。与对照菌株(gs115-rhsa)相比，7株共表达菌株rhsa的表达量都有提高，采用quantityone软件分析，表达率如表1所示。表1菌株表达量比率gs115-rhsa100％gs115-rhsa-pdi260％gs115-rhsa-hac1210％gs115-rhsa-kar2168％gs115-rhsa-ppi162％gs115-rhsa-ero1150％gs115-rhsa-pdi-hac1280％gs115-rhsa-pdi-ppi220％16、rhsa共表达菌株的发酵采用5升发酵罐对gs115-rhsa菌株以及实施例15筛选的gs115-rhsa-ero1、gs115-rhsa-hac1、gs115-rhsa-pdi、gs115-rhsa-ppi、gs115-rhsa-kar2、gs115-rhsa-pdi-hac1及gs115-rhsa-pdi-ppi菌株进行发酵，发酵条件参考invitrogen公司公开的《pichiafermentationprocessguidelines》。诱导表达80小时后结束发酵，取培养上清分析rhsa的表达量。结果如表2显示，当固定发酵时间为80小时的情况下，共表达菌株rhsa的表达量明显提高，最高可达18.2g/l发酵上清，为rhsa大规模工业化生产奠定基础。表2菌株最大表达量(g/l)gs115-rhsa5.98gs115-rhsa-pdi16.9gs115-rhsa-hac112.6gs115-rhsa-kar210.0gs115-rhsa-ppi9.7gs115-rhsa-ero18.9gs115-rhsa-pdi-hac118.2gs115-rhsa-pdi-ppi13.1当前第1页12