葡聚糖的制备方法
【专利摘要】本发明涉及包含β-葡聚糖的组合物。更具体地说，本发明涉及生产可溶性β-葡聚糖的方法。
【专利说明】葡聚糖的制备
[0001]本申请是申请日为2007年6月15日、申请号为200780029944.X、发明名称为“葡聚糖的制备”的发明专利申请的分案申请。
[0002]发明背景
[0003]本申请要求2006年6月15日提交的美国序列号60 / 813，971、题为葡聚糖的制备的权益。
[0004]本发明涉及包含β -葡聚糖的组合物。更具体地说，本发明涉及可溶性β -葡聚糖组合物及其在干细胞动员中的用途。
[0005]葡聚糖往往被描述为葡萄糖的聚合物，并衍生自酵母、细菌、真菌和植物，例如燕麦或大麦。已知含β (1-3)-连接的吡喃葡萄糖主链的葡聚糖具有生物学活性，尤其是，已经表明它们调节免疫系统，更近期地，介导造血干细胞和祖细胞(HSPC)的动员。
[0006]各种癌症的治疗日益涉及减少细胞数的治疗，包括高剂量化疗或放射疗法。这些治疗使患者的白细胞数下降 ，抑制骨髓造血活性，并增加他们感染和/或出血的风险。因此，接受减少细胞数的治疗的患者也必须接受治疗，以重新恢复骨髓功能(造血作用)。
[0007]尽管在干细胞动员和技术方面取得进展，高达20-25%的患者表现出不良的动员，并不能进行自体移植。PGGP-葡聚糖是可溶性酵母衍生的多糖，先前已经表现出介导造血干细胞和祖细胞(HSPC)的动员。
[0008]发明概述
[0009]在本发明中，酵母被培养、收获和纯化，生成基本不含污染有挥发性有机化合物(VOCs)的微粒β-葡聚糖。通过使酵母细胞或其片段经受去除宿主细胞杂质的一系列的碱、表面活性剂和酸提取，制备微粒葡聚糖。
[0010]经以上工艺或经现有工艺方法生产的微粒β-葡聚糖在升高的温度和压力下可溶解于酸性溶液。然后，澄清和先后采用疏水相互作用的层析(HIC)、凝胶渗透层析(GPC)纯化所生成的可溶性葡聚糖。作为药剂，以较高剂量给予可溶性葡聚糖，而无增加的或实际上减少的可观察到的副作用或不利结果。
[0011]图的简述
[0012]图1是生产微粒β -葡聚糖的方法的示意图。
[0013]图2是生产可溶性β -葡聚糖的方法的示意图。
[0014]发明详述
[0015]微粒g -葡聚糖
[0016]图1是从酵母生产不溶的或微粒β -葡聚糖的方法10的概况，它包括步骤12-22。在步骤12中，酵母培养基典型地在摇瓶或发酵桶中生长。用于本发明的酵母株可为任何株，其实例包括酿酒酵母(Saccharomyces (S.) cerevisiae)、德尔布酵母(S.delbrueckii)、罗斯酵母(S.rosei)、小捕圆酵母(S.microellipsodes)、卡尔酵母(S.carlsbergensis)、
二孢酵母(S.bisporus)、发酵性酵母(S.fermentati)、鲁酵母(S.rouxii)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces (K.) Iactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis),多孢克鲁维酵母(K.polysporus)、白假丝酵母(Candida(C.)albicans).阴道假丝酵母(C.cloacae)、热带假丝酵母(C.tropicalis)、产朊假丝酵母(C.utilis)、温奇汉逊酵母(Hansenula(H.)wingei)、arni 汉逊酵母(H.arni)、亨利汉逊酵母(H.henrici1、美国汉逊酵母(H.americana)、加拿大汉逊酵母(H.canadiensis)、碎囊汉逊酵母(H.capsulata)、多形汉逊酵母(H.polymorpha)、克鲁弗毕赤酵母(Pichia(P.)kluyveri)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、多形毕赤酵母(P.polymorpha)、罗丹毕赤酵母(P.rhodanesis)、奥默毕赤酵母(P.0hmeri)、牛球拟酵母(Torulopsis (T.) bovina)和光滑球拟酵母(T.glabrata)。
[0017]在批量生产的一个实施方案中，从酵母培养开始，经摇动烧瓶培养基逐步扩大到250-L规模的生产发酵桶。酵母在富含维生素，例如叶酸、肌醇、烟酸、泛酸(钙和钠盐)、吡哆醇HCl和胸腺嘧啶HCl和来自化合物例如氯化铁六水合物；氯化锌；氯化钙二水合物；钥酸；硫酸铜五水合物和硼酸的微量金属的葡萄糖-硫酸铵培养基中生长。在约0.02%浓度时，也可加入消泡剂，例如防沫剂(Antifoam) 204。
[0018]以补料分批培养方式(fed batch mode)将生产培养基维持在葡萄糖限制下。在种子发酵期间，在接种生产发酵桶之前，定时取样，测量培养基的光密度。在生产发酵期间，仍定时取样，以测量培养基的光密度。在发酵结束时，取样测量光密度、干重量和微生物纯度。
[0019]如果需要，可通过提高培养基pH到至少11.5或经离心培养基以从生长介质中分离细胞，终止发酵。此外，可根据想要得到的经纯化的葡聚糖的规格和形式，采取分裂或破碎酵母细胞的各个步骤。可采用任何已知的化学、酶或机械方法，或它们的任何组合，分裂或破碎酵母细胞。
[0020]在步骤14，收获含β -葡聚糖的酵母细胞。当批量生产β -葡聚糖时，典型地采用连续流式离心收获酵母 细胞。
[0021]步骤16表示用一种或多种碱溶液、表面活性剂或它们的组合初步提取酵母细胞。例如，适用的碱溶液是0.1Μ-5Μ NaOH0适用的表面活性剂包括，例如，辛基硫葡糖苷、LubrolPX> Triton X-100、月桂基硫酸钠(SDS)、Nonidet P-40、吐温20等。也可采用离子型(阴离子、阳离子、两性)表面活性剂(例如，磺酸烷基酯、苯扎氯铵等)和非离子型表面活性剂(例如，聚氧乙烯氢化篦麻油、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯甘油脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基苯基醚等)。表面活性剂的浓度会有所不同，并部分地取决于所用的表面活性剂。酵母细胞材料可被提取一次或多次。
[0022]提取通常在介于约70°C -约90°C的温度下进行。根据温度、所用试剂及其浓度，每次提取的持续时间介于约30分钟-约3小时之间。
[0023]在每次提取后，采用离心或连续流式离心收集含有葡聚糖的固相，并为后继步骤而再悬浮。离心期间，在液相中除去已溶解的污染物，同时使葡聚糖保存于不溶的细胞壁材料中。
[0024]在一个实施方案中，进行四次提取。在第一次提取中，使已收获的酵母细胞与1.0MNaOH混合，并加热至90°C约60分钟。第二次提取是碱/表面活性剂提取，借此，使不溶材料再悬浮于0.1M NaOH和约0.5%-0.6% Triton X-100中，并加热至90°C约120分钟。第
三次提取类似于第二次提取，除了 Triton X-100浓度为约0.05%，和持续时间缩短至约60分钟之外。在第四次提取中，使不溶材料再悬浮于约0.5% Triton-XlOO中，并加热至75°C约60分钟。
[0025]碱和/或表面活性剂提取物溶解并去除某些无关酵母细胞材料。碱溶液水解蛋白、核酸、甘露聚糖和脂质。表面活性剂促进脂质和其它疏水杂质的去除，这为生成改进的β-葡聚糖产物提供额外的优点。
[0026]先前的纯化程序生成含有微量挥发性有机化合物(VOCs)的β -葡聚糖。在先研究已经表明，脂肪作为脂肪酸释放，再快速分解为各种VOCs，生成VOCs。大部分情况下，检测出的量不足以造成危害，但，给予人或其它动物的产物基本不含任何VOCs显然是有益的。
[0027]需氧和厌氧生长产生的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的脂肪含量介于约3%-约8%。脂肪含量随酵母的生长条件而变化。表1提供酿酒酵母的典型脂肪组成的概况。数据来自以下参考文献:
[0028].Blagovic, B.，].Rpcuc, M.Meraric, K.Georgia 和 V.Marie.2001.啤酒酵母的脂质组成.Food Technol.Biotechnol.39: 175-181.[0029].Shulze.1995.酿酒酵母的厌氧生理学.哲学博士论文，丹麦科技大学.[0030].Van Der Rest, Μ.Ε., A.H.Kamming, A Nakano, Y.Anrak, B.Poolman 和ff.N.Koning.1995.酿酒酵母的质膜:结构、功能和生物合成.Microbiol.Rev.59:304-322.[0031]表1
【权利要求】
1.一种生产具有免疫刺激性质的可溶性β-葡聚糖的方法，该方法包括: 向微粒β -葡聚糖和酸的悬液施加约35 PSI压力；和 以足以形成可溶性葡聚糖的时间加热该悬液至约135°C。
2.权利要求1的方法，其还包括: 澄清可溶性葡聚糖。
3.权利要求2的方法，其中的可溶性β-葡聚糖经离心、过滤或它们的组合澄清。
4.权利要求1的方法，其中的悬液在基本除去所有氧气的容器中。
5.权利要求4的方法，其中的氧气通过用氮气吹洗容器除去。
6.权利要求1的方法,其还包括: 根据分子量分离进入各流分的可溶性β_葡聚糖。
7.权利要求6的方法，其中的可溶性β-葡聚糖经层析法分离。
8.权利要求1的方法，其中的酸是乙酸。
9.一种包含具有免疫刺激性质的未衍化的、可溶性葡聚糖的组合物，它可以以至多约6 mg/kg的单一剂量给予。
10.权利要求9的组合物，其中所述未衍化的、可溶性β-葡聚糖不会诱导引起炎性副作用的生物化学介质。
11.权利要求10的组合物，其中的生物化学介质是白介素-1β、肿瘤坏死因子-α或二者。
12.权利要求9的组合物，其中所述未衍化的、可溶性β-葡聚糖衍生自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
13.权利要求9的组合物，其中所述未衍化的、可溶性β-葡聚糖介于约25，000Da和约 380,000 Da 之间。
14.一种组合物，其包含具有约120,000 Da-约205，000 Da之间的平均分子量的未衍化的、可溶性葡聚糖，所述组合物可以以最高可达约6 mg/kg的剂量给予人或动物。
15.权利要求14的组合物，其中所述未衍化的、可溶性β-葡聚糖含有不超过总己糖的约1.6%的还原糖。
16.权利要求14的组合物，其中所述未衍化的、可溶性β-葡聚糖含有少于约25 μ g/mg的己糖。
17.权利要求14的组合物，其中不超过8%的被给予未衍化的、可溶性β-葡聚糖的人出现任何一种不良事件。
【文档编号】A61P37/04GK103833867SQ201310718360
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2007年6月15日 优先权日:2006年6月15日
【发明者】A.梅吉, J.罗尔克, 杨仁德 申请人:生物高聚物工程公司Dba生物治疗公司