低分子岩藻聚糖硫酸酯及其对糖尿病肾病的作用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种低分子岩藻聚糖硫酸酯的制备工艺，通过盐酸降解、脱盐、离子交换柱洗脱等制备得到低分子岩藻聚糖硫酸酯。药理活性实验表明，本发明的方法制备的低分子岩藻聚糖硫酸酯能够明显改善肾功能，降低蛋白尿，延缓肾小球硬化，发挥肾脏保护作用。动物实验表明：低分子岩藻聚糖硫酸酯效果明显好于相同剂量的岩藻聚糖硫酸酯，因此，可以以本发明的低分子岩藻聚糖硫酸酯为原料用于制备治疗糖尿病肾病的药物，或直接利用本发明的低分子岩藻聚糖硫酸酯为药物用于治疗糖尿病肾病。
【专利说明】低分子岩藻聚糖硫酸酯及其对糖尿病肾病的作用
【技术领域】
[0001]本发明涉及低分子岩藻聚糖硫酸酯及其对糖尿病肾病的作用，属于海洋药物领域。
【背景技术】
[0002]糖尿病肾病(diabeticη印hropathy, DN)是糖尿病(diabetes Mellitus, DM)最常见的并发症，也是导致终末期肾病(end stage renal disease, ESRD)的主要原因。DN的发病机理极为复杂，DM时肾脏局部血管紧张素II (angiotensin II，Ang II)表达升高，从而引发体内一系列细胞因子紊乱，促进DN的发生发展。转化生长因子P1Uransforming growthfactor-betal, TGF-β J被认为具有促硬化特质，是导致糖尿病肾小球硬化的主要因素。IV型胶原(type IV collagen, Col-1V)作为 ECM (细胞外基质！extracellular matrix)的主要成分之一，是衡量ECM积聚的主要指标，在DN的发病中起着重要作用。
[0003]DN是DM最为严重的慢性并发症之一，在发达国家是肾功能衰竭最常见的原因。35%的I型DM和15~20%的2型DM患者最终会合并DN。在美国，DN己超过高血压肾硬化成为ESRD的第一大主要原因之一，是I型DM患者致死、致残的首型原因，在2型DM中仅次于大血管并发症。因此，预防和延缓DN的发生发展具有重要的临床意义。DN实质上是一种DM所引起的肾脏微血管病变，可分为糖尿病性肾小球硬化症、肾小动脉硬化症和急性或慢性肾盂肾炎，最常见的DN —般指糖尿病性肾小球硬化症。其特殊性表现为肾小球肥大，系膜区扩张，基底膜(glomerular basement membrane, GBM)增厚和肾小球一肾小管间质ECM进行性积聚，最后发展为肾小球硬化及肾小管间质纤维化。其中，肾小球硬化为DN的重要特征，其主要表现为 3种:①结节性肾小球硬化，由糖蛋白、糖及脂肪的沉积形成结节，为DN所特有的病理改变弥漫性肾小球硬化，肾小球弥漫性PAS阳性物质沉积；③渗出性病变。
[0004]近年来，细胞因子在DN的发生、发展中的作用日益引起人们的关注，细胞因子是由活化的免疫细胞及其相关细胞产生的调节细胞生长及功能的高活性、多功能、低分子量多肽。临床和动物实验证实，细胞因子与DN的关系非常密切，其作用涉及到细胞外基质代谢、细胞增殖、细胞肥大甚至肾小球血流动力学改变。在其中，肾素一血管紧张素系统(rennin-angiotensin system, RAS)有着十分重要的作用，DM时，由于慢性高血糖症、血流动力学改变等原因使肾脏局部Ang II活性增高，在DM后期可刺激肾小球一肾小管基底膜胶原蛋白及肾小球系膜细胞增殖、系膜细胞外基质合成增加。此外，活性增高的Ang II通过直接或间接诱导TGF-β i表达，TGF-β i是具有独特致纤维化的细胞因子，大多数组织细胞均能合成分泌，其中以肾脏表达最为丰富，主要分布在肾小管，其次为肾小球，同时肾脏也是其主要的作用靶器官，众学者认为它是肾小球硬化过程中细胞因子紊乱的核心。DM时由于高血糖、血流动力学的改变、RAS活性亢进、血脂代谢异常等造成TGF-β i合成增加，活性升高。而增高的TGF- β !能够抑制细胞增殖、促进肾脏组织肥大、促进ECM合成抑制其降解和调苄基质受体一整合素的表达，以加强细胞一基质间的相互作用，促进DN的发生发展。此外,TGF-β !还能够刺激肾脏局部ΡΑΙ-1、单核细胞趋化蛋白-l(monocyte chemoattractantproteinl, MCP-1)的高表达表达，促进肾小管间质成纤维细胞的增殖、分化，导致大量单核巨噬细胞浸润肾小球，ECM成分合成增多、降解减少。
[0005]ECM是由邻近细胞局部分泌组成的大分子复合物，主要由胶原蛋白、弹性蛋白、糖蛋白和蛋白多糖四种组成分子组成，这些ECM成分组成复杂的三维网状结构，它不仅作为细胞骨架对于组织结构的维持是必须的，而且在细胞的增生、分化、发育的调控过程中起着关键性作用。在组成ECM的胶原成分中，最重要的是Col-1V，其在体内以胶原蛋白的非纤维状形式存在于各种细胞的基底膜，具有维系假手术组织结构、保证各细胞正常生理功能的作用。LN在ECM大家族中属于整合素家族，为糖蛋白类，广泛分布于基底膜的透明层，紧贴细胞基底部，与IV型胶原结合，形成基底膜的骨架，影响基底膜的电荷选择性，其主要作用与介导细胞与基质之间相互作用，与细胞黏附、迁移、增殖、分化有关。二者均为DN发生发展的重要指标，DN时，Col-1V和LN合成增加同时伴降解减少，将导致肾小球或肾小管ECM合成增加并积聚，最后导致肾小球硬化。
[0006]DN中，随着病程进展，ECM的积聚在肾小球硬化中非常重要，ECM积聚和重塑的确切发病机制尚不清楚，早期即出现了肾小球一肾小管ECM合成增加。目前的研究认为，在DN中，不仅存在着ECM合成的增加，其降解的抑制起到了更为重要的作用。基质及基底膜的降解是由蛋白酶完成的，其中丝氨酸蛋白酶和基质金属蛋白酶(MatrixMetalloproteinases, MMPs)是负责降解基底膜蛋白及系膜基质蛋白的主要蛋白酶。纤溶酶是丝氨酸蛋白酶，可以直接参与降解基质，纤溶酶原在纤溶酶原激活剂(plasminogenactivator, PA)作用下 形成具有活性的纤溶酶。PA1-1是PA的主要抑制物，也是ECM降解过程中保持蛋白质溶解与抗蛋白溶解间平衡的重要因素。在组织内PA1-1水平升高和(或)活性增强，可抑制PA对ECM降解，引起ECM堆积。纤溶酶原/纤溶酶系统除直接降解基质成分外,还通过PA激活MMPs系统，进一步放大局部ECM的降解作用。
[0007]目前认为，DN的治疗应包括两个方面:诱发因素的控制和DN发展中关键环节的阻断。1998年美国糖尿病学会发表临床实践推荐意见中对DN的治疗措施包括:控制血糖、控制血压和限制蛋白质摄入。以上因素加上血脂控制，被认为是诱发因素控制的四个方面。因DN诱发因素往往较难以控制，且易导致低血糖等严重后果，所以如何阻断DN发病机制中某一关键环节以求事半功倍已成为目前研究的热点。
[0008]Val 为 Ang I1-1 型受体拮抗剂(angiotensin II type lreceptorblockers, ARB)，其作用机制是竞争性阻断ACE途径及非ACE途径所生成的Ang II与靶目标ATl受体结合，完全阻断Ang II经ATl受体而发挥作用，包括对血管的收缩、增生作用、交感神经的活性、醛固酮的释放、电解质的调节作用，从而具有肾脏保护功能，目前这类药物已经成为治疗DN的一线药物。
【发明内容】
[0009]针对上述现有技术，本发明的目的在于提供一种低分子岩藻聚糖硫酸酯，及其制备工艺，并证明该低分子岩藻聚糖硫酸酯在糖尿病肾病中的保护作用。以低分子岩藻聚糖硫酸酯为主要原料制备的片剂、胶囊剂、冲剂等口服制剂，可以有效预防、治疗糖尿病肾病。
[0010]本发明是通过以下技术方案实现的:[0011]一种低分子岩藻聚糖硫酸酯的制备工艺，步骤如下:
[0012](I)取岩藻聚糖硫酸酯(未降解)，用盐酸进行降解，盐酸浓度为0.05~0.2mol/L,降解温度为50~60°C，降解时间为12~18h ；
[0013](2)上述酸降解后，通过截留分子量为6000Da的超滤膜进行粗分，得到<6000Da的LMWF ；
[0014](3)上述 <6000Da 的 LMWF 经 SephdexG-ΙΟ 凝胶柱(35cm*16mm)脱盐，再经Q-Sepharose离子交换柱(35cm*16mm)分离(初始流动相为2mol/L氯化钠溶液,梯度洗脱，浓度逐渐降低至0)，得到三个组分，取得率最高的组分(命名为LMWF-2)(即:流动相浓度为
0.3~0.6mol/L氯化钠溶液时得到的洗脱液中的组分)，然后，LMWF-2进行Bio-gel P4凝胶柱(85cm*10mm)分离纯化(流动相为0.15mol/L氯化钠溶液,等比洗脱),得到四个糖组分，对这四个组分S印hdexG-ΙΟ凝胶柱(35cm*16mm)进行脱盐，浓缩、冷冻干燥，即得，结果表明LMWF-2-3 (按照洗脱顺序，第三个被洗脱下来的组分)纯度最高，LMWF-2-3用TSKgelG2000柱检测分析，纯度较高，理化分析结果如下:总糖含量50~75%，糖醛酸含量为0.2~2%，硫酸根含量为20~30% ;根据高分辨率质谱结果可知LMWF-2-3分子量为414.5Da,为双糖；根据IR、1!! NMR和13C NMR结果可知LMWF-2-3由α -构型吡喃糖组成，单糖组分主要为岩藻糖，存在4-0S03_ ;由此推断LMWF-2-3的结构如图1所示。LMWF-2-3即为低分子岩藻聚糖硫酸酯。
[0015]药理活性实验表明，上述方法制备的低分子岩藻聚糖硫酸酯能够明显改善肾功能，降低蛋白尿，延缓肾小球硬化，发挥肾脏保护作用。其作用机制可能与降低血清中和GMC分泌的TGF- β 1、减少肾组织和GMC分泌Col-1V，抑制GMC过度增殖有关。动物实验表明:低分子岩藻聚糖硫酸酯效果明显好于相同剂量的岩藻聚糖硫酸酯(未降解)，详见实施例2。因此，可以以本发明的低分子岩藻聚糖硫酸酯为原料用于制备治疗糖尿病肾病的药物，或直接利用本发明的低分子岩藻聚糖`硫酸酯为药物用于治疗糖尿病肾病。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1:低分子岩藻聚糖硫酸酯的结构式。
【具体实施方式】
[0017]下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0018]实施例1:低分子岩藻聚糖硫酸酯的降解及分离纯化
[0019](I)取岩藻聚糖硫酸酯(未降解)，用盐酸进行降解，盐酸浓度为0.lmol/L,降解温度为60°C，降解时间为18h;
[0020](2)上述酸降解后，通过截留分子量为6000Da的超滤膜进行粗分，得到<6000Da的LMWF ；
[0021](3)上述<6000Da的LMWF经S印hdexG-10凝胶柱(35cm*16mm)脱盐(脱盐后粗糖得率44.18%),再经Q-Sepharose离子交换柱(35cm*16mm)分离(初始流动相为2mol/L氯化钠溶液，梯度洗脱，浓度逐渐降低至0)，得到3个组分，取得率最高的组分(命名为LMWF-2)(即:流动相浓度为0.3~0.6mol/L氯化钠溶液时得到的洗脱液浓缩得到的组分)，然后，LMWF-2进行Bio-gelP4凝胶柱(85cm*10mm)分离纯化(流动相为0.15mol/L氯化钠溶液，等比洗脱)，得到四个糖组分，对这四个组分SephdexG-1O凝胶柱(35cm*16mm)进行脱盐，浓缩、冷冻干燥，即得，结果表明LMWF-2-3 (按照洗脱顺序，第三个被洗脱下来的组分，命名为LMWF-2-3)纯度最高(得率1.51%)，LMWF-2-3用TSKgel G2000柱检测分析，理化分析结果如下:总糖含量50~75%，糖醛酸含量为0.2~2%，硫酸根含量为20~30% ;根据高分辨率质谱结果可知LMWF-2-3分子量为414.5Da,为双糖；根据IR、1!! NMR和13C NMR结果可知LMWF-2-3由α -构型吡喃糖组成，单糖组分主要为岩藻糖，存在4_0S03_ ；由此推断LMWF-2-3的结构如图1所示。
[0022]实施例2:低分子岩藻聚糖硫酸酯对糖尿病肾病大鼠的保护作用
[0023]将大鼠右肾摘除，两周后以45mg *kg-l剂量腹腔注射链脲佐菌素建立DN模型。将DN大鼠随机分为DN模型组、阳性对照Val组(20mg/kg/d)、阳性对照岩藻聚糖硫酸酯(未降解)组(240mg/kg/d)、低分子岩藻聚糖硫酸酯(即实施例1制备的LMWF-2-3，下同)高剂量组(240mg/kg/d)、低分子岩藻聚糖硫酸酯中剂量组I (120mg/kg/d)和低分子岩藻聚糖硫酸酯低剂量组(60mg/kg/d)，并设立假手术对照组。实验8周后，检测DN大鼠肾功能(UAE、BUN、Cr),ELISA法测定DN大鼠血清TGF-β i的含量，免疫组化法测定肾脏TGF-β i和Col-1V的原位表达含量，观察肾脏HE、PAS染色切片。结果显示海带低分子岩藻聚糖硫酸酯通过抑制血清中和肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell, GMC)分泌的TGF-β丨、减少肾组织和GMC分泌Col-1V，抑制GMC过度增殖，延缓肾小球硬化，实现对DN的保护作用；低分子岩藻聚糖硫酸酯高剂量组明显好于阳性对照岩藻聚糖硫酸酯(未降解)组，阳性对照岩藻聚糖硫酸酯(未降解)组效果与低分子岩藻聚糖硫酸酯低剂量组效果相当。 [0024]实施例3:低分子岩藻聚糖硫酸酯对体外高糖培养系膜细胞的作用
[0025]体外培养大鼠系膜细胞:分正常对照组；高糖损伤模型组；Val (2X 10_5mol.L'2Xl(T6mol *L_1>2X 10_7mol.171)治疗组；低分子岩藻聚糖硫酸酯高剂量组(500 μ g/ml)、低分子岩藻聚糖硫酸酯中剂量组(50 μ g/ml)，低分子岩藻聚糖硫酸酯低剂量组(5 μ g/ml)。MTT法观察药物对其增殖的影响，ELISA法检测系膜细胞分泌TGF-β i的含量，免疫组化法检测系膜细胞表达Col-1V的含量。结果显示:低分子岩藻聚糖硫酸酯能显著抑制系膜细胞增殖、抑制TGF-β i的过量分泌和Col-1V的过多表达，各给药组均能显现出对DN的保护作用。
【权利要求】
1.一种低分子岩藻聚糖硫酸酯的制备工艺，其特征在于:步骤如下: (O取岩藻聚糖硫酸酯，用盐酸进行降解，盐酸浓度为0.05~0.2mol/L,降解温度为50~60°C，降解时间为12~18h ； (2)上述酸降解后，通过截留分子量为6000Da的超滤膜进行粗分，得到<6000Da的LMWF ； (3)上述<6000Da的LMWF经SephdexG-1O凝胶柱脱盐,再经Q-Sepharose离子交换柱分离，初始流动相为2mol/L氯化钠溶液，梯度洗脱，浓度逐渐降低至0，取对应于流动相浓度为0.3~0.6mol/L时的洗脱液，浓缩干燥得组分LMWF-2 ;然后，LMWF-2进行Bio-gelP4凝胶柱分离纯化，流动相为0.15mol/L氯化钠溶液，等比洗脱，得到四个糖组分，取第三个被洗脱下来的组分，SephdexG-1O凝胶柱脱盐，浓缩、冷冻干燥，即得低分子岩藻聚糖硫酸酯。
2.利用权利要求1所述的低分子岩藻聚糖硫酸酯的制备工艺制备得到的低分子岩藻聚糖硫酸酯。
3.权利要求2 所述的低分子岩藻聚糖硫酸酯在制备治疗糖尿病肾病的药物中的应用。
【文档编号】A61K31/715GK103804504SQ201410029573
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年1月22日 优先权日:2014年1月22日
【发明者】吉爱国, 宋淑亮, 梁浩, 王秀敏 申请人:山东大学（威海）