一种含有岩藻聚糖硫酸酯的免疫佐剂及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种含有岩藻聚糖硫酸酯的免疫佐剂及其应用，其解决了目前免疫佐剂种类少、副作用无法避免、不能满足感染性疾病暴发时需要提供大量疫苗的技术问题，其由下列质量比的组分组成：岩藻聚糖硫酸酯；人参皂苷；余为载体；载体由下列质量比的组分组成：乳化剂；助乳化剂；油相和水相。本发明可广泛用于疫苗的制备领域。
【专利说明】一种含有岩藻聚糖硫酸酯的免疫佐剂及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种含有岩藻聚糖硫酸酯的免疫佐剂，还涉及含有岩藻聚糖硫酸酯的免疫佐剂的流感疫苗，属于生物技术和生物医药领域。
【背景技术】
[0002]岩藻聚糖硫酸酯作为海带等褐藻所固有的细胞间多糖，存在于褐藻细胞壁基质中，是褐藻所特有的生物活性物质。例如，以海带(Laminaria japonicia)为原料所提取的岩藻聚糖硫酸酯(Fucoidan),主要由含硫酸基岩藻糖(Fucose)组成；其次,还伴有少量的半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、糖醛酸等，是一种水溶性的杂聚多糖，又被称为褐藻糖胶、褐藻多糖硫酸酯，其主要有效成份是a -L-岩藻糖-4-硫酸酯。
[0003]岩藻聚糖硫酸酯是一种优秀的健康食品、药品原料，因天然含有硫酸根，从而具有阴离子高分子化合物的特性。研究表明，岩藻聚糖硫酸酯具有抗凝血、降血脂、抗慢性肾衰、抗肿瘤、抗病毒、促进组织再生、抑制胃溃疡、增强机体免疫机能等多种生理活性。岩藻聚糖硫酸酯具有明显的抗凝血和促纤溶的药理学活性；包含硫酸基的岩藻糖或其降解物能诱导癌细胞凋亡，可用作凋亡诱导剂和抗癌药；能诱发细胞生长因子的生成，从而促进各种细胞生长，修复受损坏或机能减退的器官和组织；由于其具有抗凝血的作用，所以适用于血粘度高的病人，可作为预防血栓形成的药物或保健品；它还具有良好的降血脂、降血糖、降胆固醇的功效，能克服降脂药物的一些副作用；可治疗慢性肾衰，对中早期肾衰效果显著，特别对改善肾功能，提高肾脏对肌酐清除率效果尤为显著；可作为金属离子的结合剂和阻吸剂，如可使人体对铅的吸收减少70%以上。
[0004]此外，岩藻聚糖硫酸酯不仅能够有效激活免疫细胞，提高机体免疫力，而且对正常宿主细胞无致畸的毒副作用，因此被认为是一种重要的生物调节剂。另外，人参皂苷Rgl和Rbl能够提高机体免疫力，有文献报道它们可用作免疫佐剂，增强抗原的免疫原性。
[0005]目前市场上流感疫苗使用的佐剂主要是铝佐剂和MF59，但实际上铝佐剂对蛋白亚单位疫苗诱导抗体产生的能力较弱，不能有效地诱导免疫应答，在某些情况下还会产生与过敏反应有关的IgE，其副作用无法避免;MF59作为疫苗佐剂时，增加免疫原性的同时，也增加了反应原性，如接种部位红肿热痛等症状。随着各种新发流感在全世界的爆发和对人感染性的增强，迫切需要开发具有更高安全性和免疫原性的免疫佐剂。
【发明内容】
[0006]本发明就了为了解决目前免疫佐剂种类少、副作用无法避免、不能满足感染性疾病暴发时需要提供大量疫苗的技术问题，提供一种能有效提高疫苗免疫效果、副作用少、降低疫苗用量的含有岩藻聚糖硫酸酯的免疫佐剂。
[0007]为此，本发明提供一种含有岩藻聚糖硫酸酯的免疫佐剂，其由下列质量比的组分组成:岩藻聚糖硫酸酯I?20% ;人参皂苷0.01?2% ;余为载体；载体由下列质量比的组分组成:乳化剂I?30% ;助乳化剂I?50% ;油相I?50% ;余为水相。
[0008]优选地，人参皂苷为Rgl或Rbl中的一种，或者为质量混合物比为1:100?100:1的Rgl与Rbl的混合物。
[0009]优选地，乳化剂为常规的吐温80或聚氧乙烯蓖麻油中的一种，或者为质量混合比为3:1?1:3的常规吐温80与Span80的混合物，或者为质量混合比为1:1的常规聚氧乙烯蓖麻油与Span80的混合物。
[0010]优选地，助乳化剂为常规的1，2_丙二醇或聚乙二醇400中的一种。
[0011]优选地，油相为常规的肉豆蘧酸异丙酯或油酸乙酯或注射用大豆油中的一种。
[0012]优选地，水相为注射用水或者含有药物或疫苗成分的注射用水溶液。
[0013]本发明同时提供了含有岩藻聚糖硫酸酯的免疫佐剂在制备流感疫苗中的应用，含有岩藻聚糖硫酸酯的免疫佐剂与流感疫苗血凝素的质量比为6000?321000:1，其中，含有岩藻聚糖硫酸酯的免疫佐剂由下列质量比的组分组成:岩藻聚糖硫酸酯I?20% ;人参皂苷0.01?2% ;余为载体。
[0014]本发明含有岩藻聚糖硫酸酯和人参皂苷的免疫佐剂，能够显著增强抗原的免疫原性，提高疫苗的效果，使疫苗在价格上具有明显的优势。尤其在流感疫苗中使用佐剂，不仅可增强免疫原性，还可以降低抗原用量，特别在应对流感大流行时，佐剂的使用可有效降低抗原用量，扩大接种人群数量，降低疫苗生产企业因产量不足而带来的压力。
【具体实施方式】
[0015]为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特采用以下实施例进行详细说明，其目的在于更好理解本
【发明内容】
而非限制本发明的保护范围。
[0016]本发明下列实施例中，人参皂苷Rgl或Rbl为市购产品或者为常规方法提取得到的产品，产品纯度为95%以上。例如，南京替斯艾么中药技术研究所的人参皂苷Rbl，产品编号TCM-039，HPLC检测纯度不低于98% ;人参皂苷Rgl，产品编号TCM-041，HPLC检测纯度不低于98%。
[0017]岩藻聚糖硫酸酯为市购产品或者为常规方法得到的产品，产品纯度为80%以上，其余20%为其它多糖成分。例如，sigma公司的产品，纯度不低于85%，产品编号F8065。
[0018]HlNl流感病毒裂解疫苗，例如，浙江天元生物药业有限公司生产的甲型HlNl流感病毒裂解疫苗，国药准字S20090027 ;华兰生物疫苗有效公司生产的甲型HlNl流感病毒裂解疫苗，国药准字S20090016。
[0019]实施例1
[0020]纳米乳剂载体的制备(A):
[0021](I)分别称取1.5g吐温80，1.0g Span80, 1.5g分子量为400道尔顿的聚乙二醇，加入到玻璃容器中，室温下搅拌3?10分钟，转速300转/分钟，混匀后加入4g注射用大豆油，继续搅拌混合均匀得到混合物；
[0022](2)在上述步骤(I)的混合物中滴入4g注射用水，室温，在260转/分钟下搅拌5?15分钟，得到纳米乳剂载体。
[0023]实施例2
[0024]纳米乳剂载体的制备⑶:
[0025](I)分别称取0.04g吐温80，0.04g Span80, 0.12g分子量为400道尔顿的聚乙二醇，加入到玻璃容器中，室温下搅拌3?10分钟，转速300转/分钟，混匀后加入4g注射用大豆油，继续搅拌混合均匀得到混合物；
[0026](2)在上述步骤(I)的混合物中滴入4g注射用水，室温，在260转/分钟下搅拌5?15分钟，得到纳米乳剂载体。
[0027]实施例3
[0028]纳米乳剂载体的制备(C):
[0029](I)分别称取0.4g吐温80，0.8g Span80, 1.2g分子量为400道尔顿的聚乙二醇，加入到玻璃容器中，室温下搅拌3?10分钟，转速300转/分钟，混匀后加入0.05g注射用大豆油，继续搅拌混合均匀得到混合物；
[0030](2)在上述步骤(I)的混合物中滴入4.0g注射用水，室温，在260转/分钟下搅拌5?15分钟，得到纳米乳剂载体。
[0031]实施例4
[0032](I)称取市购的岩藻聚糖硫酸酯162mg, 1.62mg人参阜苷Rgl溶于1.0ml水中，配制成水溶液；
[0033](2)将上述(I)配制的水溶液与4.0ml市购得HlNl流感病毒裂解疫苗(血凝素含量为30μ g/ml)混合，然后再向其混合物中加入1.0ml生理盐水，得总体积为6ml的含岩藻聚糖硫酸酯和人参皂苷Rgl的流感疫苗，在温度4°C保存，备用；
[0034](3)称取6g注射用大豆油，2.0g分子量400道尔顿的聚乙二醇，0.5g吐温80，1.5gSpan80于玻璃容器中，温度4°C，在220转/分钟下搅拌5_10分钟，充分混匀，得到混合溶液；
[0035](4)在上述(3)的混合溶液中慢慢滴入(2)的含岩藻聚糖硫酸酯和人参皂苷Rgl的流感疫苗6ml，在温度4°C、在220转/分钟下搅拌5_30分钟，得到含有岩藻聚糖硫酸酯、纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗。
[0036]实施例5
[0037](I)称取市购的岩藻聚糖硫酸酯1.2g，1mg人参皂苷Rbl溶于2ml水中，配制成水溶液；
[0038](2)将上述(I)配制的水溶液与2.2ml市购得HlNl流感病毒裂解疫苗(血凝素含量为30μ g/ml)混合，然后再向其混合物中加入1.8ml生理盐水，得总体积为6ml的含岩藻聚糖硫酸酯和人参皂苷Rgl的流感疫苗，在温度4°C保存，备用；
[0039](3)称取5.8g注射用大豆油，2.2g分子量400道尔顿的聚乙二醇，0.6吐温80，
1.4g Span80于玻璃容器中，温度4°C，在220转/分钟下搅拌5_10分钟，充分混匀，得到混合溶液；
[0040](4)在上述(3)的混合溶液中慢慢滴入(2)的含岩藻聚糖硫酸酯和人参皂苷Rbl的流感疫苗6ml，在温度4°C、在220转/分钟下搅拌5_30分钟，得到含有岩藻聚糖硫酸酯、纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗。
[0041]实施例6
[0042](I)称取市购的岩藻聚糖硫酸酯4.0g,5mg人参阜苷Rgl, 5mg人参阜苷Rbl,溶于2ml水中，配制成水溶液；
[0043](2)将上述(I)配制的水溶液与2.1ml市购得HlNl流感病毒裂解疫苗(血凝素含量为30 μ g/ml)混合，然后再向其混合物中加入1.9ml生理盐水，得总体积为6ml的含岩藻聚糖硫酸酯和人参皂苷Rgl的流感疫苗，在温度4°C保存，备用；
[0044](3)称取6.5g注射用大豆油，1.5g分子量400道尔顿的聚乙二醇，1.2吐温80，0.8g Span80于玻璃容器中，温度4°C，在260转/分钟下搅拌5_10分钟，充分混匀，得到混合溶液；
[0045](4)在上述(3)的混合溶液中慢慢滴入(2)的含岩藻聚糖硫酸酯和人参皂苷Rgl与Rbl的流感疫苗6ml，在温度4°C、在220转/分钟下搅拌5-30分钟，得到含有岩藻聚糖硫酸酯、纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗。
[0046]实施例7
[0047](I)称取市购的岩藻聚糖硫酸酯1.0g, 0.34g人参皂苷Rbl溶于2ml水中，配制成水溶液；
[0048](2)将上述(I)配制的水溶液与2.5ml市购得HlNl流感病毒裂解疫苗(血凝素含量为30 μ g/ml)混合，然后再向其混合物中加入1.5ml生理盐水，得总体积为6ml的含岩藻聚糖硫酸酯和人参皂苷Rgl的流感疫苗，在温度4°C保存，备用；
[0049](3)称取6.1g注射用大豆油，1.9g分子量400道尔顿的聚乙二醇，1.0聚氧乙烯蓖麻油，1.0g Span80于玻璃容器中，温度4°C，在230转/分钟下搅拌5_10分钟，充分混匀，得到混合溶液；
[0050](4)在上述(3)的混合溶液中慢慢滴入(2)的含岩藻聚糖硫酸酯和人参皂苷Rbl的流感疫苗6ml，在温度4°C、在220转/分钟下搅拌5_30分钟，得到含有岩藻聚糖硫酸酯、纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗。
[0051]实施例8
[0052](I)称取市购的岩藻聚糖硫酸酯200mg，20mg人参皂苷Rgl溶于2.1ml水中，配制成水溶液；
[0053](2)将上述(I)配制的水溶液与2.0ml市购得HlNl流感病毒裂解疫苗(血凝素含量为30 μ g/ml)混合，然后再向其混合物中加入1.9ml生理盐水，得总体积为6.0ml的含岩藻聚糖硫酸酯和人参皂苷Rgl的流感疫苗，在温度4°C保存，备用；
[0054](3)称取6.3g注射用大豆油，1.7g分子量400道尔顿的聚乙二醇，1.3吐温80，
0.7g Span80于玻璃容器中，温度4°C，在210转/分钟下搅拌5_10分钟，充分混匀，得到混合溶液；
[0055](4)在上述(3)的混合溶液中慢慢滴入(2)的含岩藻聚糖硫酸酯和人参皂苷Rgl的流感疫苗6.3ml，在温度4°C、在220转/分钟下搅拌5_30分钟，得到含有岩藻聚糖硫酸酯、纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗。
[0056]实施例9
[0057](I)称取市购的岩藻聚糖硫酸酯300mg，30mg人参皂苷Rbl溶于1.8ml水中，配制成水溶液；
[0058](2)将上述(I)配制的水溶液与1.7ml市购得HlNl流感病毒裂解疫苗(血凝素含量为30 μ g/ml)混合，然后再向其混合物中加入2.5ml生理盐水，得总体积为6.0ml的含岩藻聚糖硫酸酯和人参皂苷Rgl的流感疫苗，在温度4°C保存，备用；
[0059](3)称取5.5g注射用大豆油，2.5g分子量400道尔顿的聚乙二醇，0.9吐温80，1.1g Span80于玻璃容器中，温度4°C，在210转/分钟下搅拌5_10分钟，充分混匀，得到混合溶液；
[0060](4)在上述(3)的混合溶液中慢慢滴入(2)的含岩藻聚糖硫酸酯和人参皂苷Rbl的流感疫苗6.0ml，在温度4°C、在220转/分钟下搅拌5_30分钟，得到含有岩藻聚糖硫酸酯、纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗。
[0061]实施例10
[0062](I)称取市购的岩藻聚糖硫酸酯0.150g, 1.5mg人参阜苷Rgl溶于1.0ml水中，配制成水溶液；
[0063](2)将HlNl流感病毒裂解疫苗浓缩至血凝素含量为0.2mg/ml,然后将上述(I)配制的水溶液与1ml浓缩后的流感病毒裂解疫苗混合，得总体积为Ilml的含岩藻聚糖硫酸酯和人参皂苷Rgl的流感疫苗，在温度4°C保存，备用；
[0064](3)称取0.12g注射用大豆油，0.12g分子量400道尔顿的聚乙二醇，0.6g吐温80，0.6g Span80于玻璃容器中，温度4°C，在220转/分钟下搅拌5_10分钟，充分混匀，得到混合溶液；
[0065](4)在上述(3)的混合溶液中慢慢滴入(2)的含岩藻聚糖硫酸酯和人参皂苷Rgl的流感疫苗I Iml，在温度4°C、在220转/分钟下搅拌5_30分钟，得到含有岩藻聚糖硫酸酯、纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗。
【权利要求】
1.一种含有岩藻聚糖硫酸酯的免疫佐剂，其特征是由下列质量比的组分组成:岩藻聚糖硫酸酯I?20% ;人参皂苷0.01?2% ;余为载体； 所述载体由下列质量比的组分组成:乳化剂I?30% ;助乳化剂I?50% ;油相I?50% ;余为水相。
2.根据权利要求1所述的含有岩藻聚糖硫酸酯的免疫佐剂，其特征在于，所述的人参皂苷为Rgl或Rbl中的一种，或者为质量混合物比为1:100?100:1的Rgl与Rbl的混合物。
3.根据权利要求1所述的含有岩藻聚糖硫酸酯的免疫佐剂，其特征在于，所述乳化剂为常规的吐温80或聚氧乙烯蓖麻油中的一种，或者为质量混合比为3:1?1:3的常规吐温80与Span80的混合物，或者为质量混合比为1:1的常规聚氧乙烯蓖麻油与Span80的混合物。
4.根据权利要求1所述的含有岩藻聚糖硫酸酯的免疫佐剂，其特征在于，所述助乳化剂为常规的I，2-丙二醇或聚乙二醇400中的一种。
5.根据权利要求1所述的含有岩藻聚糖硫酸酯的免疫佐剂，其特征在于，所述油相为常规的肉豆蘧酸异丙酯或油酸乙酯或注射用大豆油中的一种。
6.根据权利要求1所述的含有岩藻聚糖硫酸酯的免疫佐剂，其特征在于，所述水相为注射用水或者含有药物或疫苗成分的注射用水溶液。
7.—种如权利要求1所述的含有岩藻聚糖硫酸酯的免疫佐剂在制备流感疫苗中的应用，其特征在于，含有岩藻聚糖硫酸酯的免疫佐剂与流感疫苗血凝素的质量比为6000?321000:1，其中，所述的含有岩藻聚糖硫酸酯的免疫佐剂由下列质量比的组分组成:岩藻聚糖硫酸酯I?20% ;人参皂苷0.01?2% ;余为载体。
【文档编号】A61P31/16GK104383534SQ201410579310
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月24日 优先权日:2014年10月24日
【发明者】苗笑晨, 苗其壮 申请人:威海芝恩药业股份有限公司