专利名称：岩藻依聚糖及在糖化合物的制造中有用的微生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及糖类研究领域中有用的糖化合物、在该糖化合物的生产中有用的糖分解酶、以及在该糖化合物的制造中有用的Fucoidanobacter属的细菌。
岩藻依聚糖是包含在褐藻类中的硫酸化多糖，已报道它具有抗血液凝固作用、澄清血脂作用、抗肿瘤作用、抑制癌转移作用、抗爱滋病毒感染作用等各种各样的生物活性，作为医药品是非常有用的物质。
然而，岩藻依聚糖是分子量非常大的硫酸化多糖，直接用作医药品时在抗原性、均一性、抗凝血活性等方面存在问题，所以常常需要将岩藻依聚糖分解到某种程度。
因此，人们期待着弄清岩藻依聚糖的构造、阐明构造与生物活性的关系，但是，岩藻依聚糖是个分支很多的高分子，构成糖的种类也多，硫酸基也可以结合于各种各样的位置，所以结构解析非常困难。为了解析多糖的结构，虽然有使分解多糖的酶作用，然后解析生成的寡糖的结构的方法，但现在市场上还没有报告中的在岩藻依聚糖分解酶中的分解生成物的糖链结构已清楚的产物和成为岩藻依聚糖寡糖的标准品的物质。
由于上述理由人们需要得到判明结构的糖化合物、在该糖化合物生产中有用的糖分解酶、以及在该糖化合物制造中有用的微生物。
本发明的目的在于提供可以用于岩藻依聚糖的结构解析、岩藻依聚糖的酶分解物的鉴定以及可以用于生物活性检索的糖化合物、在岩藻依聚糖的部分分解以及岩藻依聚糖寡糖的生产等与岩藻依聚糖有关研究中有用的新的内向(endo)型岩藻依聚糖分解酶、以及在糖化合物的制造中有用的新的微生物。
如果概述本发明，本发明的第一项发明涉及将下面通式(1)或(2)
(1) (2) [式中X代表H或用下式(3)(3) 代表的基团，Y代表H或用下式(4)，或(5)(4)
(5) 表示的基团，但是X和Y不能都是H；Z代表H或用下式(6)(6) 表示的基团]代表的化合物中的至少一个醇式羟基进行硫酸酯化形成的糖化合物或其盐。
作为用通式(1)或(2)代表的化合物的例子，举出下式(7)～(15)表示的化合物。
(7)
(8) (9)
(10) (11)
(12) (13)
(14) (15)
本发明的第二项发明涉及内向型岩藻依聚糖分解酶，其特征是具有下面的理化性质。(I)作用作用于岩藻依聚糖，至少可以使上述式(7)和式(8)表示的糖化合物游离出来。(II)最适pH该酶的最适pH是6～10。(III)最适温度该酶的最适温度是30～40℃。
本发明的第三项发明涉及在作为本发明的第一项发明的糖化合物的制造中有用的新的微生物，也就是在其电子传递链中有甲基萘醌、GC含量约为60％的属于Fucoidanobacter属的细菌。
本说明书记载的式(1)、(2)、(4)～(15)、以及(17)～(25)中的“～”意味着在甘露糖、或半乳糖中存在着α、β两种异头物。
本发明者发现如果使作为本发明的第二项发明的酶或本发明的第三项发明的细菌的菌体提取物或培养液上清作用于岩藻依聚糖，可以得到本发明的糖化合物，从而使本发明完成。
附图的简单说明
图1是利用L-柱分离糖化合物(a)的吡啶基(2)-氨基化糖化合物(PA-a)时的洗脱图。图2是利用L-柱分离糖化合物(b)的吡啶基(2)-氨基化糖化合物(PA-b)时的洗脱图。图3是利用L-柱分离糖化合物(c)的吡啶基(2)-氨基化糖化合物(PA-c)时的洗脱图。图4是利用L-柱分离糖化合物(d)的吡啶基(2)-氨基化糖化合物(PA-d)时的洗脱图。图5是利用L-柱分离糖化合物(e)的吡啶基(2)-氨基化糖化合物(PA-e)时的洗脱图。图6是利用L-柱分离糖化合物(f)的吡啶基(2)-氨基化糖化合物(PA-f)时的洗脱图。图7是利用L-柱分离糖化合物(g)的吡啶基(2)-氨基化糖化合物(PA-g)时的洗脱图。图8是利用L-柱分离糖化合物(h)的吡啶基(2)-氨基化糖化合物(PA-h)时的洗脱图。图9是利用L-柱分离糖化合物(i)的吡啶基(2)-氨基化糖化合物(PA-i)时的洗脱图。图10是糖化合物(a)的质谱分析(negative测定)图。图11是糖化合物(b)的质谱分析(negative测定)图。图12是糖化合物(c)的质谱分析(negative测定)图。图13是糖化合物(d)的质谱分析(negative测定)图。图14是糖化合物(e)的质谱分析(negative测定)图。图15是糖化合物(f)的质谱分析(negative测定)图。图16是糖化合物(g)的质谱分析(negative测定)图。图17是糖化合物(h)的质谱分析(negative测定)图。图18是糖化合物(i)的质谱分析(negative测定)图。图19是糖化合物(a)的mass-mass谱分析(negative测定)图。图20是糖化合物(b)的mass-mass谱分析(negative测定)图。图21是糖化合物(c)的mass-mass谱分析(negative测定)图。图22是糖化合物(d)的mass-mass谱分析(negative测定)图。图23是糖化合物(e)的mass-mass谱分析(negative测定)图。图24是糖化合物(f)的mass-mass谱分析(negative测定)图。图25是糖化合物(g)的mass-mass谱分析(negative测定)图。图26是糖化合物(h)的mass-mass谱分析(negative测定)图。图27是糖化合物(i)的mass-mass谱分析(negative测定)图。图28是糖化合物(a)的1H-NMR谱图。图29是糖化合物(b)的1H-NMR谱图。图30是糖化合物(c)的1H-NMR谱图。图31是糖化合物(d)的1H-NMR谱图。图32是糖化合物(e)的1H-NMR谱图。图33是糖化合物(f)的1H-NMR谱图。图34是糖化合物(g)的1H-NMR谱图。图35是糖化合物(h)的1H-NMR谱图。图36是糖化合物(i)的1H-NMR谱图。图37是表示作为本发明的第2项发明的酶的pH和相对活性(％)的关系图。图38是表示作为本发明的第2项发明的酶的反应温度(℃)和相对活性(％)的关系图。图39是表示对作为本发明的第2项发明的酶进行处理的pH和残余活性(％)的关系图。图40是表示对作为本发明的第2项发明的酶进行处理的温度和残余活性(％)的关系图。图41是利用DEAE-Sepharose FF分离糖化合物(a)-(i)时的洗脱图。图42是利用DEAE-Sepharose FF分离糖化合物(h)和(i)时的洗脱图。
以下，详细地说明本发明。
本发明的第2项发明中使用的菌株只要是属于黄杆菌(Flavobact-erium)属的，具有生产内向型岩藻依聚糖分解酶能力的菌株，无论哪种菌株都可以。举一个具体的具有生产内向型岩藻依聚糖分解酶能力的菌株，例如，Flavobacterium sp.SA-0082菌株。如果让来自该菌株的内向型岩藻依聚糖分解酶作用于岩藻依聚糖，可以得到作为本发明的第一项发明的糖化合物。
本菌株是本发明者从青森县的海水中新发现的菌株，该菌株的菌学性质如下。1、Flavobacterium sp.SA-0082菌株a、形态方面的性质(1)本菌株是短杆菌。
宽0.8-1.0μm长1.0-1.2μm(2)有无胞子无(3)革兰氏染色 阴性b、生理方面的性质
(1)生育的温度范围在37℃以下可以生育。最适生育温度是15～28℃。
(2)对氧的嗜好 好氧型(3)过氧化氢酶 阳性(4)氧化酶 阳性(5)脲酶 弱阳性(6)酸的生成D-葡萄糖 阳性乳糖 阳性麦芽糖 阳性D-甘露醇 阳性蔗糖 阴性海藻糖 阴性(7)水解淀粉 阴性明胶 阳性酪蛋白 阴性七叶苷 阳性(8)硝酸盐的还原 阴性(9)吲哚的生成 阴性(10)硫化氢的生成 阴性(11)奶的凝固 阴性(12)钠的需求性阳性(13)盐的需求性在0％食盐培养基中的生育 阴性在1％食盐培养基中的生育 阴性在海水培养基中的生育 阳性(14)醌系甲基萘醌6(15)菌体内DNA的GC含量32％(16)OF-测定0
(17)菌落颜色黄色(18)运动性 无(19)滑动性 无本菌株被认为是Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology、第一卷(1984)，以及Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology、第九卷(1994)记载的水生黄杆菌(Flavobacterium aquatile)、以及Flavobacterium meningosepticum的类缘细菌，但是，前者在消化葡萄糖后不形成酸方面，在不能分解酪蛋白方面，能够分解七叶苷方面，可以使明胶液化方面，对脲酶显阳性方面是不同的。而后者在不能分解酪蛋白方面，在37℃下生育缓慢方面是不同的。因此，将本菌株鉴定为属于Flavobacterium的细菌，命名为Flavobacterium sp.SA-0082。
上述菌株表示为Flavobacterium sp.SA-0082，以FERM BP-5402(原保藏日平成7年3月29日，向国际保藏单位的移管申请日平成8年2月15日)保藏于国立生命科学和人体技术研究所〖日本国茨城县筑波市东1丁目1番3号(邮政编码305)〗。
本发明的第2项发明中使用的菌株的培养基中加的营养源只要是使用的菌株可以利用的、能够生产内向型岩藻依聚糖分解酶的培养基就可以，作为碳源，例如可以利用岩藻依聚糖、海藻粉末、藻酸、岩藻糖、葡萄糖、甘露醇、甘油糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、淀粉等，作为氮源可以利用酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、肉汤、脱脂大豆、硫铵、氯化铵等比较合适。此外，也可以加入钠盐、磷酸盐、镁盐、锌盐等无机物，以及金属盐类。
另外，本菌株在含有上述营养源的海水或人工海水中也可以非常好地生育。
在培养内向型岩藻依聚糖分解酶的生产菌时，产量随培养条件变动，但一般培养温度为15～30℃、培养基的pH为5～9比较好，在5～72小时的通气搅拌培养下，本发明的内向型岩藻依聚糖分解酶的产量达到最高。当然要根据使用的菌株、培养基的组成等来设定培养条件，使本发明的内向型岩藻依聚糖分解酶的产量达到最高。
作为本发明的第2项发明的内向型岩藻依聚糖分解酶既存在于菌体中也存在于培养物上清中。
在适当的培养基中培养上述Flayobacterium sp.SA-0082菌株，收集该菌体，利用通常的破碎细胞的手段，例如通过超声处理等破碎菌体得到无细胞提取液。
然后，利用通常使用的纯化手段从该提取液中可以得到纯化的酶制品。例如，利用盐析、离子交换层析、疏水柱层析、凝胶过滤等进行纯化，可以得到不含其它的岩藻依聚糖分解酶的纯化了的作为本发明的第2项发明的内向型岩藻依聚糖分解酶。
另外，由于在从上述培养液除去菌体的上清中也存在大量的这种酶(菌体外酶)，所以，利用与菌体内酶同样的纯化手段也可以纯化。
作为本发明的第2项发明的内向型岩藻依聚糖分解酶的化学以及物理化学性质如下，菌体内酶、菌体外酶除了分子量外都表示出同样的性质。(I)作用作用于岩藻依聚糖，至少可以使上述式(7)和式(8)表示的糖化合物游离出来。(II)最适pH该酶的最适pH是6～10(图37)。即，图37是表示该酶的pH和相对活性关系的图。纵轴表示相对活性(％)，横轴表示pH。(III)最适温度该酶的最适温度是30～40℃(图38)。即，图38是表示该酶的温度和相对活性关系的图。纵轴表示相对活性(％)，横轴表示温度℃。(IV)pH稳定性该酶在pH6～11.5之间稳定(图39)。即，图39是表示对该酶进行处理的pH和残余活性(％)的关系图，纵轴表示残余活性(％)，横轴表示pH。(V)温度稳定性该酶大约在30℃以下稳定(图40)。即，图40是表示该酶的处理温度和残余活性(％)的关系图，纵轴表示残余活性(％)，横轴表示处理温度℃。(VI)分子量利用Sephacryl S-200(Pharmacia)凝胶过滤法求该酶的分子量时，Flavobacterium sp.SA-0082菌株的菌体外酶的分子量大约是7万，菌体内酶是大约是46万。(VII)酶活性的测定方法
技术领域：
本发明的第2项发明的内向型岩藻依聚糖分解酶的酶活性的测定按如下方式进行。
即，将2.5％的取自竹篮孔样花纹海带(kjellmaniella crassifolia)的岩藻依聚糖溶液50μl、10μl的本发明的第2项发明的内向型岩藻依聚糖分解酶与含有60μl的667mM氯化钠的83mM的磷酸缓冲液(pH7.5)混合搅拌，于230nm测定吸光度(AT)。作为对照，只用溶解本发明的酶的上述缓冲液代替作为本发明的第2项发明的内向型岩藻依聚糖分解酶，利用同样的条件使其反应得到反应产物，以及只使用水代替岩藻依聚糖溶液进行反应得到反应产物，分别测定它们的吸光度(AB1和AB2)。
1单位的酶定义为于上述反应体系中一分钟使1μmol的甘露糖和糖醛酸之间的糖苷键切开的酶量。切开的键的定量以脱离反应时生成的不饱和糖醛酸的毫摩尔分子吸光系数作为5.5来进行计算。另外，酶的活性通过下式可以求得。
(AT-AB1-AB2)×2.105×120/5.5×105×0.01×180＝U/ml2.105测定吸光度的样品液量(ml)。120酶反应液的液量(μl)5.5不饱和糖醛酸在230nm的毫摩尔分子吸光系数(/mM)105稀释用的反应液液量(μl)0.01酶量(ml)180反应时间(分)蛋白质的定量是通过测定酶液在280nm的吸光度进行的。此时，将1mg/ml的蛋白质的吸光度作为1.0计算。
本发明者按如下所叙，确定了本发明的第2项发明的内向型岩藻依聚糖分解酶的作用机制。(1)竹篮孔样花纹海带岩藻依聚糖的制备利用自由粉碎机M-2型(奈良机械制作所制)将干燥的竹篮孔样花纹海带粉碎，在10倍量的85％甲醇中于70℃处理2小时后，过滤，将残渣在10倍量的甲醇中于70℃处理2小时，过滤。向残渣中加入20倍量的水，于100℃处理3小时后，过滤，得提取液。将提取液的盐浓度调到与400mM的氯化钠溶液相同后，添加氯化十六(烷)基吡啶鎓直到不产生沉淀为止。用乙醇充分洗净，完全除去氯化十六(烷)基吡啶鎓，利用限界过滤器(过滤膜的排阻分子量是10万)(Amicon社制)脱盐和除去低分子，通过离心分离除去生成的沉淀。将上清冷冻干燥得到精制的竹篮孔样花纹海带岩藻依聚糖。收率大约是干燥的竹篮孔样花纹海带粉末重量的4％。(2)利用内向型岩藻依聚糖分解酶分解岩藻依聚糖以及分解物的纯化使作为本发明的第2项发明的内向型岩藻依聚糖分解酶作用于纯化的竹篮孔样花纹海带岩藻依聚糖进行分解物的大量制备。
即、将5％的竹篮孔样花纹海带岩藻依聚糖溶液600ml、100mM的磷酸缓冲液(pH8.0)750ml和4M的氯化钠150ml以及1750mU/ml的本发明的内向型岩藻依聚糖分解酶溶液3.43ml混合，于25℃反应144小时。
用孔径3500的透析膜对反应液透析，收集分子量3500以下的级份。用Micro Acilyzer-G3(旭化成社制)脱盐后，经DEAE-Sepharose FF分成(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)和(i)9个级分。图41给出了其洗脱图。横轴表示级分号，左边的纵轴以及图中的黑实心圆点用480nm的吸光度表示用酚硫酸法测定的糖含量，右边的纵轴以及图中的空心圆点用235nm的吸光度表示不饱和葡糖醛酸的含量，最右边的纵轴以及图中的虚线表示洗脱液中的醋酸铵浓度(M)。各个级分的级分号分别是，(a)42～43、(b)84～91、(c)51～52、(d)79、(e)102～103、(f)62～63、(g)45、(h)75、以及(i)77。
就级分(h)和(i)收集上述的级分64～78，利用DEAE-SepharoseFF进行再纯化。图42给出了其洗脱图。横轴表示级分号，左边的纵轴以及图中的实心圆点用480nm的吸光度表示用酚硫酸法测定的糖含量，右边的纵轴以及图中的空心圆点用235nm的吸光度表示不饱和葡糖醛酸的含量，最右边的纵轴以及图中的虚线表示洗脱液中的醋酸铵浓度(M)。各个级分的级分号分别是(h)92～96、以及(i)99～103。(3)酶反应生成物的结构解析a、各级分均一性的确认将上述的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)和(i)9个级分各取一部分使用GlycoTAG和GlycoTAG ReagentKit(都是宝酒造社制)使其还原性末端进行2-氨基吡啶化(PA化)，得到各个PA化糖(PA-a)、(PA-b)、(PA-c)、(PA-d)、(PA-e)、(PA-f)、(PA-g)、(PA-h)和(PA-i)。利用HPLC判明它们是否均一。
HPLC的条件如下。
装置L-6200型(日立制作所制)柱子L-柱(4.6×250mm){(财)化学药品检查协会}洗脱液对于前述式(7)、(8)、和(9)[(PA-a)、(PA-b)、(PA-c)]物质，用50mM醋酸三乙基胺(pH5.5)对于前述式(10)、(12)、(13)、和(15)[(PA-d)、(PA-f)、(PA-g)、和(PA-i)]物质，使用100mM醋酸三乙基胺(pH5)。
对于前述式(11)[(PA-e)]物质，从0分钟直到10分钟用200mM醋酸三乙基胺(pH3.8)，从10分钟直到60分钟，200mM醋酸三乙基胺(pH3.8)和含有0.5％四氢呋喃的200mM醋酸三乙基胺(pH3.8)的比率由100∶0直线变化到20∶80。
对于前述式(14)[(PA-h)]物质，从0分钟直到60分钟，200mM醋酸三乙基胺(pH3.8)和含有0.5％四氢呋喃的200mM醋酸三乙基胺(pH3.8)的比率由80∶20直线变化到50∶50。
检测使用荧光检测器F-1150(日立制作所制)，于激发波长320nm、荧光波长400nm下检测。
流速1ml/分柱温40℃b、酶反应生成物的还原末端糖以及中性糖组成的分析各个PA化糖(PA-a)、(PA-b)、(PA-c)、(PA-d)、(PA-e)、(PA-f)、(PA-g)、(PA-h)和(PA-i)用4N的盐酸于100℃水解3小时，通过HPLC检测还原末端糖。
另外，使用GlycoTAG和GlycoTAG Reagent Kit(都是宝酒造社制)，使该水解物的还原末端PA化，利用HPLC研究中性糖组成。HPLC的条件如下。
装置L-6200型(日立制作所制)柱子Palpak A型(4.6×150mm)(宝酒造社制)洗脱液700mM硼酸缓冲液(pH9.0)∶乙腈＝9∶1检测使用荧光检测器F-1150(日立制作所制)，于激发波长310nm、荧光波长380nm下检测。
流速0.3ml/分柱温65℃结果，(PA-a)、(PA-b)、(PA-c)、(PA-d)、(PA-e)、(PA-f)、和(PA-i)的还原末端糖都是甘露糖。而作为中性糖组成，(PA-a)、(PA-b)、(PA-c)、(PA-e)、(PA-f)、和(PA-i)含有等摩尔的甘露糖和岩藻糖，(PA-d)中的甘露糖和岩藻糖比率是2∶1。
(PA-g)以及(PA-h)的还原末端糖都是半乳糖，作为中性糖组成，(PA-g)中半乳糖和岩藻糖的比是1∶2，而(PA-h)中半乳糖和岩藻糖的比是2∶1。
另外，为了研究作为构成糖之一的甘露糖的立体构型，利用F-kit葡萄糖/果糖以及磷酸甘露糖异构酶(都是Boehringer Mannheim-Yamanouchi制)，根据说明书构建可以只测定D-甘露糖的反应系，用该反应系测定用2N盐酸于100℃，对各100μg的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、和(i)水解3小时后被中和的产物。其结果因为从(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、和(i)中都检测出D-甘露糖，所以判明(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、和(i)的构成糖甘露糖都是D型的。
为了研究作为(g)以及(h)构成糖之一的半乳糖的立体构型，利用可以只能检测出D型的半乳糖的F-试剂盒乳糖/半乳糖(BoehringerMannheim-Yamanouchi制)。即用这一试剂盒测定用2N盐酸于100℃对各100μg的(g)以及(h)水解3小时后被中和的产物。其结果，因为从(g)以及(h)检测出半乳糖，所以判明(g)以及(h)的构成糖半乳糖都是D型的。
另外另一种构成糖岩藻糖的立体构型按照Clinical Chemistry第36卷，第474-476页(1990)记载的方法，用该反应系测定用2N盐酸于100℃，对各100μg的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)和(i)水解3小时后被中和的产物。利用该反应系不能检测出D-岩藻糖，只能检测出L-岩藻糖。结果从(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)和(i)中检测出L-岩藻糖。
c、酶反应生成物的分子量的分析使用API-III质量分析器(Perkin-Elmer Science社制)，对(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)和(i)进行质量分析，它们的分子量分别是564、724、1128、1062、1448、644、632、1358、和1288。(b)和(c)是由2价的阴离子形成主要的信号。(d)中可以检测出1价的离子和带有钠的1价的离子和2价的离子。(e)中可以检测出带有4个钠离子的2价的离子，带有3个钠离子的3价的离子，带有1个钠离子的4价的离子等。(f)中可以检测出带有2个钠离子的1价的离子。(g)中可以检测出1价的离子和结合了钠的1价的离子和2价的离子。(h)中可以检测出带有4个、3个、2个、和1个钠离子的、分别为1价、2价、3价、4价的离子等。(i)中2个硫酸基解离，可以检测出带有1个钠离子的1价的离子以及获得2个硫酸基的2价的离子。
另外，通过Negatived MS/MS的分析，(a)中可以检测出一价的硫酸离子(分子量97)、由不饱和己糖醛酸得到水分子和氢离子的一价离子(分子量157)、由不饱和己糖醛酸得到氢离子的一价离子(分子量175)、从岩藻糖和硫酸结合的产物得到水分子和氢离子的一价离子(分子量225)、从岩藻糖和硫酸结合的产物得到氢离子的一价离子(分子量243)、由不饱和己糖醛酸和甘露糖结合的产物得到水分子和氢离子的一价离子(分子量319)、从岩藻糖、硫酸和甘露糖结合的产物得到氢离子的一价离子(分子量405)。
同样，通过Negatived MS/MS的分析，(b)中可以检测出一价的硫酸离子(分子量97)、由不饱和己糖醛酸得到氢离子的一价离子(分子量175)、从岩藻糖和硫酸结合的产物得到氢离子的一价离子(分子量243)、由不饱和己糖醛酸、岩藻糖、甘露糖和2个硫酸结合的产物得到2个氢离子的2价离子(分子量321)、从岩藻糖、硫酸和甘露糖结合的产物得到氢离子的一价离子(分子量405)、由不饱和己糖醛酸、甘露糖和硫酸结合的产物得到氢离子的一价离子(分子量417)。
同样，通过Negatived MS/MS的分析，(c)中可以检测出一价的硫酸离子(分子量97)、由不饱和己糖醛酸得到氢离子的一价离子(分子量175)、从岩藻糖和硫酸结合的产物得到水分子和氢离子的一价离子(分子量225)、从岩藻糖和硫酸结合的产物得到氢离子的一价离子(分子量243)、由不饱和己糖醛酸、甘露糖、岩藻糖和硫酸结合的产物得到2个氢离子的2价离子(分子量371)、从岩藻糖、硫酸和甘露糖结合的产物得到氢离子的一价离子(分子量405)、由不饱和己糖醛酸、甘露糖、岩藻糖、己糖醛酸和硫酸结合的产物得到水和氢离子的1价离子(分子量721)。
同样，通过Negatived MS/MS的分析，从(d)的2价离子中可以检测出一价的硫酸离子(分子量97)、由不饱和己糖醛酸得到氢离子的一价离子(分子量175)、从岩藻糖和硫酸结合的产物得到水分子和氢离子的一价离子(分子量225)、从岩藻糖和硫酸结合的产物得到氢离子的一价离子(分子量243)、从岩藻糖、硫酸和甘露糖结合的产物得到氢离子的一价离子(分子量405)、从(d)得到2个硫酸基、2个氢离子的2价离子(分子量450)、从(d)得到1个硫酸基2个氢离子的2价离子(分子量490)。
同样，通过Negatived MS/MS的分析，从(e)中可以检测出一价的硫酸离子(分子量97)、从岩藻糖和硫酸结合的产物得到水分子和氢离子的一价离子(分子量225)、从岩藻糖和硫酸结合的产物得到氢离子的一价离子(分子量243)、从岩藻糖和2分子的硫酸基以及钠离子结合的产物得到2个氢离子的一价离子(分子量345)、从(e)得到2个硫酸基、带有3个钠离子和6个氢离子的3价离子(分子量450)、从(e)得到1个硫酸基、得到6个氢离子、带有3个钠离子的3价离子(分子量476)、由不饱和己糖醛酸、甘露糖、岩藻糖和硫酸结合的产物得到氢离子的1价离子(分子量563)、以及由不饱和己糖醛酸、甘露糖、岩藻糖和3分子硫酸结合的产物得到水分子和氢离子的1价离子(分子量705)。
同样，通过Negatived MS/MS的分析，从(f)中可以检测出一价的硫酸离子(分子量97)、从岩藻糖和硫酸结合的产物得到氢离子的一价离子(分子量243)、由不饱和己糖醛酸、甘露糖、硫酸和钠结合的产物得到水和氢离子的1价离子(分子量421)。
同样，通过Negatived MS/MS的分析，从(g)中可以检测出从岩藻糖、硫酸和甘露糖结合的产物得到氢离子的一价离子(分子量405)、以及由2分子岩藻糖、1分子半乳糖和1分子硫酸基结合的产物得到氢离子的1价离子(分子量551)。
同样，通过Negatived MS/MS的分析，可以从3分子钠结合于(h)、并得到5分子氢离子的产物检测出一价的硫酸离子(分子量97)、从岩藻糖和硫酸结合的产物得到水分子和氢离子的一价离子(分子量225)、以及由2分子岩藻糖、4分子半乳糖和3分子硫酸基结合的产物得到1分子氢离子的1价离子(分子量1197)。
同样，通过Negatived MS/MS的分析，可以从由(i)得到2个硫酸基的2价离子中检测出一价的硫酸离子(分子量97)、从岩藻糖、2分子硫酸和钠结合的产物得到氢离子的一价离子(分子量345)。
d、酶反应生成物的糖组成的分析从上述质量分析的结果显示出(a)、(b)、(c)、(d)、(f)和(i)在分子内含有不饱和己糖醛酸的可能性极高。
为了证明酶反应生成物的分子内存在有不饱和键的己糖醛酸，进行了如下的实验。如果分子内存在有不饱和键，在230～240nm处应有强的吸收。因此，测定纯化的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)和(i)的各个寡糖水溶液的230～240nm的吸收度，在(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)及(i)的水溶液中存在强的吸收，则表明分子内存在有不饱和键。因为随着该酶对岩藻糖的分解反应进行的同时，230～240nm的吸收度的增加也被证实，所以，强烈地显示出该酶通过脱离反应切断岩藻糖中的甘露糖和己糖醛酸之间或半乳糖和己糖醛酸之间的糖苷键。
几乎所有的酶反应生成物其非还原末端带有不饱和的己糖醛酸，还原末端是甘露糖。由此表明在制备的岩藻依聚糖中存在着己糖醛酸和甘露糖交互并列的分子。
由于岩藻依聚糖的很多构成糖是岩藻糖，所以岩藻依聚糖比一般的多糖更容易被酸水解。而己糖醛酸和甘露糖之间的结合键对酸是比较强的。本发明者为了弄清存在于竹篮孔样花纹海带岩藻依聚糖的分子内的己糖醛酸和甘露糖交互结合的分子种类中的己糖醛酸的种类，参考CarbohydrateResearch第125卷，第283-290页，1984年的方法，首先将岩藻依聚糖溶解于0.3M的硝酸中，于100℃处理3小时，然后对处理物进行分子量分级，收集分子量在3000以上的级分，再利用阴离子交换树脂收集吸附级分。将该物质冷冻干燥后用4N的盐酸进行酸水解pH调整到8后，进行PA化，利用HPLC进行糖醛酸的分析。HPLC的条件如下。
装置L-6200型(日立制作所制)柱子Palpak N型(4.6×250mm)(宝酒造社制)洗脱液200mM醋酸-三乙基胺缓冲液(pH7.3)∶乙腈＝25∶75检测使用荧光检测器F-1150(日立制作所制)，于激发波长320nm、荧光波长400nm下检测。
流速0.8ml/分柱温40℃而PA化的己糖醛酸的标准物质中，葡糖醛酸是Sigma制，半乳糖醛酸是和光纯药社制，艾杜糖醛酸是Sigma制的4-methylumbelliferyl-α-L-iduronide的水解产物，甘露糖醛酸和葡糖醛酸是根据Acta chemicascandinavicaj(第15卷第1397-1398页、1961年)记载的方法将和光纯药社制的藻酸水解后再将经阴离子交换树脂分离的产物PA化后得到的。
结果表明上述岩藻依聚糖的分子中含有的己糖醛酸只是葡糖醛酸。
利用阴离子交换树脂将上述分子的水解物中的葡糖醛酸分离成D-甘露糖，冷冻干燥后测定其比旋度，判明呈现右旋的葡糖醛酸是D-葡糖醛酸。
另外，关于预先用本发明的第2项发明的内向型岩藻依聚糖分解酶处理取自竹篮孔样花纹海带的岩藻依聚糖的产物虽然也和上述一样用硝酸水解但检测不出D-葡糖醛酸和甘露糖交互结合成的聚合物。由此判明本发明的酶通过脱离反应切断的岩藻依聚糖的分子的骨架构造具有D-葡糖醛酸和甘露糖交互结合的构造。
另外，为了研究D-葡糖醛酸和甘露糖各自的结合位置和糖苷键的异头构型，对通过硝酸水解得到的聚合物进行了NMR分析。
聚合物的NMR分析结果如下。其中，在1H-NMR的化学位移值，是将三乙基胺的甲基的化学位移值表示为1.13ppm，在13C-NMR，其化学位移值表示为9.32ppm。
1H-NMR(D2O)δ5.25(1H，br-s，1-H)、4.32(1H，d，J＝7.6Hz，1′-H)、4.00(1H，br-s，2-H)、3.71(1H，m，5′-H)、3.69(1H，m，5-CH的H)、3.68(1H，m，3-H)、3.63(1H，m，5-CH的H)、3.63(1H，m，4′-H)3.57(1H，m，4-H)、3.54(1H，m，3′-H)、3.53(1H，m，5-H)、3.25(1H，t，J＝8.5Hz，2′-H)13C-NMR(D2O)δ175.3(5′-COOHのC)、102.5(1′-C)、99.6(1-C)、78.5(2-C)、77.9(4′-C)、77.0(3′-C)、76.7(5′-C)、73.9(5-C)、73.7(2′-C)、70.6(3-C)、67.4(4-C)、61.0(5-CH2OH的C)峰的归属号如下式(16)。 D-葡糖醛酸的1位的立体构型从其连位结合常数(vicinal bingingconstant)为7.6Hz可以确定是β-D-葡糖醛酸。
而甘露糖的1位的立体构型从其连位结合常数为5.25ppm可以确定是α-D-甘露糖。
构成糖的结合形式利用异核1H检测法HMBC确定。
1H-NMR的归属中使用DQF-COSY法和HOHAHA法，在13C-NMR的归属中使用HSQC法。
通过HMBC光谱，在1-H和4′-C之间以及4′-H和1-C之间、1′-H和2-C之间以及2-H和1′-C之间分别看到交叉峰。由此表明D-葡糖醛酸通过β键与D-甘露糖的2位结合D-甘露糖通过α键与D-葡糖醛酸的4位结合。
e、酶反应生成物的的糖结合形式以及硫酸基的结合位置的分析为了研究构成糖和硫酸基的结合形式，利用500MHz核磁共振装置JNM-α500型(日本电子造)对酶反应生成物进行NMR光谱分析。从分析结果可以判明(a)是前式(7)表示的结构，(b)是前式(8)表示的结构，(c)是前式(9)表示的结构，(d)是前式(10)表示的结构，(e)是前式(11)表示的结构，(f)是前式(12)表示的结构，(g)是前式(13)表示的结构，(h)是前式(14)表示的结构，(i)是前式(15)表示的结构。即，(a)是在作为还原末端残基的D-甘露糖上结合了不饱和的D-葡糖醛酸和结合了结合有硫酸基的L-岩藻糖的结构；(b)是在结合了硫酸基的还原末端残基D-甘露糖上结合了结合有不饱和的D-葡糖醛酸和2个硫酸基的L-岩藻糖的结构；(c)是在还原末端残基D-甘露糖上结合了D-葡糖醛酸和结合有硫酸基的L-岩藻糖结构，其D-葡糖醛酸结合了D-甘露糖，而该D-甘露糖又结合了结合有不饱和D-葡糖醛酸和硫酸基的L-岩藻糖；(d)是在还原末端残基D-甘露糖上结合了结合有D-葡糖醛酸和2个硫酸基的L-岩藻糖的结构，该D-葡糖醛酸结合了D-甘露糖，而该D-甘露糖又结合了不饱和D-葡糖醛酸；(e)是在还原末端残基D-甘露糖上结合了结合有硫酸基、D-葡糖醛酸和2个硫酸基的L-岩藻糖，该D-葡糖醛酸结合了带有硫酸基的D-甘露糖，而该D-甘露糖又结合了带有2分子的硫酸基的L-岩藻糖和不饱和D-葡糖醛酸；(f)是在结合了硫酸基的还原末端残基D-甘露糖上结合了结合有不饱和的D-葡糖醛酸和硫酸基的L-岩藻糖的结构，(g)是在还原末端残基D-半乳糖上结合了结合有硫酸基的L-岩藻糖结构，而该L-岩藻糖又结合了结合有硫酸基的L-岩藻糖；(h)具有以结合了硫酸基的还原末端残基D-半乳糖为起点分成2个链的结构，其一条糖链是在D-半乳糖上结合带有硫酸基的L-岩藻糖，在该L-岩藻糖上结合带有硫酸基的L-岩藻糖，而另一条糖链是在结合了硫酸基的D-半乳糖上结合了带有硫酸基的D-半乳糖的结构；(i)是在还原末端残基D-甘露糖上结合了结合有硫酸基、D-葡糖醛酸和硫酸基的L-岩藻糖结构，该D-葡糖醛酸又结合了D-甘露糖，而该D-甘露糖又结合了带有2分子的硫酸基的L-岩藻糖和不饱和的D-葡糖醛酸。
使本发明的第2项发明的内向型岩藻依聚糖分解酶作用于岩藻依聚糖，得到包含在本发明的第1项发明的糖化合物中的化合物。
下面给出了用作为本发明的第1项发明的糖化合物的例子式(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)、(13)、(14)以及式(15)所表示的化合物的物理性质，即(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)以及(i)的物理性质。
图1、2、3、4、5、6、7、8以及9中给出了各个吡啶(-2-)胺基化糖化合物(PA-a)、(PA-b)、(PA-c)、(PA-d)、(PA-e)、(PA-f)、(PA-g)、(PA-h)和(PA-i)的HPLC的洗脱图，图中纵轴表示相对荧光强度，横轴表示保留时间(分)。而进一步在图10给出了(a)的、图11给出了(b)的、图12给出了(c)的、图13给出了(d)的、图14给出了(e)的、图15给出了(f)的、图16给出了(g)的、图17给出了(h)的、图18给出了(i)的质谱图，图19给出了(a)、图20给出了(b)、图21给出了(c)、图22给出了(d)、图23给出了(e)、图24给出了(f)、图25给出了(g)、图26给出了(h)、图27给出了(i)的mass-mass谱图，各图中纵轴表示相对强度(％)，横轴表示m/z值。
而图28给出了(a)、图29给出了(b)、图30中给出了(c)、图31给出了(d)、图32给出了(e)、图33给出了(f)、图34给出了(g)、图35给出了(h)、图36给出了(i)的1H-NMR光谱，各图中纵轴表示信号强度，横轴表示化学位移值(ppm)。在1H-NMR中的化学位移值中，HOD的化学位移值表示为4.65ppm。
(a)的物理性质分子量564MS m/z 563[M-H+]-MS/MS m/z 97[HSO4]-、157[不饱和的D-葡糖醛酸-H2O-H+]-、175[不饱和的D-葡糖醛酸-H+]-、225[L-岩藻糖硫酸-H2O-H+]-、243[L-岩藻糖硫酸-H+]-、319[不饱和D-葡糖醛酸和D-甘露糖结合的产物-H2O-H+]-、405[M-不饱和的D-葡糖醛酸-H+]-、483[M-SO3-H+]-1H-NMR(D2O)δ5.78(1H，d，J＝3.7Hz，4″-H)、5.26(1H，d，J＝1.2Hz，1-H)、5.12(1H，d，J＝4.0Hz，1′-H)、5.03(1H，d，J＝6.1Hz，1″-H)、4.47(1H，d-d，J＝3.4.10，4Hz，3′-H)、4.21(1H，br-s，2-H)、4.12(1H，m，5′-H)、4.10(1H，d-d，J＝3.7，5.8Hz，3″-H)、4.03((1H，d，J＝3.4Hz，4′-H)、3.86(1H，m，3-H)、3.83(1H，d-d，J＝4.0，10.4Hz，2′-H)、3.72(1H，m，4-H)、3.72(1H，m，5-H)、3.70(2H，m，5-CH2的H2)、3.65(1H，d-d，J＝5.8，6.1Hz，2″-H)、1.08(3H，d，J＝6.7Hz，5′-CH3的H3)糖组成L-岩藻糖∶不饱和的D-葡糖醛酸∶D-甘露糖＝1∶1∶1(各1分子)硫酸基1分子(L-岩藻糖的3位)而1H-NMR中的峰的归属序号如下式(17)。 (b)的物理性质分子量724MS m/z 723[M-H+]-、361[M-2H+]2-MS/MS m/z 97[HSO4]-、175[不饱和的D-葡糖醛酸-H+]-、243[L-岩藻糖硫酸-H+]-、321[M-SO3-2H+]2-、405[M-不饱和的D-葡糖醛酸-2SO3-H+]-、417[M-L-岩藻糖-2SO3-H+]-1H-NMR(D2O)δ5.66(1H，d，J＝3.4Hz，4″-H)、5.27(1H，d，J＝7.3Hz，1″-H)、5.25(1H，d，J＝1.8Hz，1-H)、5.21(1H，d，J＝3.7Hz，1′-H)、4.50(1H，d，J＝3.1Hz，4′-H)、4.32(1H，q，J＝6.7Hz，5′-H)、4.27(1H，d-d，J＝3.7，10.4Hz，2′-H)、4.21(1H，d-d，J＝3.4，6.7Hz，3″-H)、4.18((1H，d-d，J＝1.8，11.0Hz，5-CH的H)、4.15(1H，br-s，2-H)、4.10(1H，d-d，J＝5.8，11.0Hz、5-CH的H)、3.99(1H，d-d，J＝3.1，10.4Hz、3′-H)、3.90(1H，m，5-H)、3.82(1H，m，3-H)、3.82(1H，m，4-H)、3.54(1H，br-t，J＝7.3Hz，2″-H)、1.11(3H，d，J＝6.7Hz，5′-CH3的H3)糖组成L-岩藻糖∶不饱和的D-葡糖醛酸∶D-甘露糖＝1∶1∶1(各1分子)硫酸基3分子(L-岩藻糖的2位和4位以及D-甘露糖的6位)而1H-NMR中的峰的归属号如下式(18)。 (c)的物理性质分子量1128MSm/z1127[M-H+]-MS/MSm/z97[HSO4]-、175[不饱和的D-己糖醛酸-H+]-、225[L-岩藻糖硫酸-H2O-H+]-、243[L-岩藻糖硫酸-H+]-、371[M-不饱和的D-葡糖醛酸-L-岩藻糖-SO3-2H+]2-、405[硫酸化L-岩藻糖和D-甘露糖结合的产物-H+]-、721[M-D-甘露糖-L-岩藻糖-SO3-H2O-H+]-1H-NMR(D2O)δ5.69(1H，d，J＝3.7Hz，(4)″-H)、5.34(1H，s，(1)-H)、5.16(1H，s，1-H)、5.10(1H，d，J＝4.0Hz，(1)′-H)、5.05(1H，d，J＝3.7Hz、1′-H)、4.93(1H，d，J＝6.4Hz，(1)″-H)、4.50(1H，d-d，J＝3.4，10.7Hz、3′-H)、4.47(1H，d-d，J＝3.4，10.4Hz，(3)′-H)、4.39(1H，d，J＝7.9Hz，1″-H)、4.33(1H，br-s，(2)-H)、4.14(1H，m，2-H)、4.12(1H，m，(3)″-H)、4.12(1H，m，5′-H)、4.12(1H，m，(5)′-H)、4.04(1H，m，4′-H)、4.03(1H，m，(4)′-H)、3.85(1H，m，2′-H)、3.85(1H，m，(2)′-H)、3.82(1H，m，3-H)、3.82(1H，m，(3)-H)、3.73(1H，m，4-H)、3.73(1H，m，5-H)、3.73(1H，m，(4)-H)、3.70(2H，m，5-CH2的H2)、3.70(2H，m，(5)-CH2的H2)、3.67(1H，m，5″-H)、3.62(1H，m，4″-H)、3.62(1H，m，(2)″-H)、3.62(1H，m，(5)-H)、3.51(1H，t，J＝8.9Hz，3″-H)、3.28(1H，t，J＝7.9Hz，2″-H)、1.09(3H，d，J＝6.7Hz，(5)′-CH3的H3)、1.07(1H，d，J＝6.7Hz，5′-CH3的H3)糖组成L-岩藻糖∶不饱和的D-葡糖醛酸∶D-葡糖醛酸∶D-甘露糖＝2∶1∶1∶2(L-岩藻糖和D-甘露糖各2分子，不饱和的D-葡糖醛酸和D-葡糖醛酸各1分子)硫酸基2分子(每个L-岩藻糖的3位)而1H-NMR中的峰的归属序号如下式(19)。(19) (d)的物理性质分子量1062MSm/z1061[M-H+]-MS/MSm/z97[HSO4]-、175[不饱和的己糖醛酸-H+]-、225[L-岩藻糖硫酸-H2O-H+]-、243[L-岩藻糖硫酸-H+]-、405[L-岩藻糖和D-甘露糖和硫酸基结合的产物-H+]-、450[M-2SO3-2H+]2-、490[M-SO3-2H+]2-1H-NMR(D2O)δ5.67(1H，d，J＝3.7Hz，(4)″-H)、5.32(1H，br-s，(1)-H)、5.17(1H，d，J＝3.5Hz，1′-H)、5.17(1H，br-s，1-H)、4.93(1H，d，J＝6.4Hz，(1)″-H)、4.71(1H，m，1″-H)、4.53(1H，d，J＝3.4Hz，4′-H)、4.33(1H，q，J＝6.7Hz，5′-H)、4.28(1H，d-d，J＝3.5，11.0Hz，2′-H)、4.18(1H，m，5-CH2的H)、4.13(1H，m，(2)-H)、4.12(1H，m，(3)″-H)、4.08(1H，m，5-CH2的H)、4.07(1H，m，2-H)、3.98(1H，d-d，J＝3.4，11.0，3′-H)、3.88(1H，m，5-H)、3.82(1H，m，4″-H)、3.78(1H，m，3-H)、3.78(1H，m，4-H)、3.78(1H，m，(3)-H)、3.67(2H，m，(5)-CH2的H2)、3.63(1H，m，(2)″-H)、3.60(1H，m，3″-H)、3.59(1H，m，5″-H)、3.57(1H，m，(4)-H)、3.57(1H，m，(5)-H)、3.16(1H，t，J＝7.9Hz，2″-H)、1.10(3H，d，J＝6.7Hz，5′-CH3的H3)糖组成L-岩藻糖∶不饱和的D-葡糖醛酸∶D-葡糖醛酸∶D-甘露糖＝1∶1∶1∶2(L-岩藻糖、不饱和的D-葡糖醛酸、D-葡糖醛酸各1分子，D-甘露糖2分子)硫酸基3分子(L-岩藻糖的2位和4位以及还原末端-侧的D-甘露糖的6位)而1H-NMR中的峰的归属序号如下式(20)。 (e)的物理性质分子量1448MSm/z767[M+Na-6H+]2-503.7[M+3Na-6H+]3-366.5[M+Na-5H+]4-MS/MS m/z97[HSO4]-、225[L-岩藻糖硫酸-H2O-H+]-、243[L-岩藻糖硫酸-H+]-、345[L-岩藻糖2硫酸+Na-2H+]、450[M+3Na-2SO3-6H+]3-、477[M+3Na-SO3-6H+]3-、563[不饱和的D-葡糖醛酸和D-甘露糖、L-岩藻糖和硫酸的结合产物-H+]-、705[不饱和的D-葡糖醛酸和D-甘露糖硫酸和L-岩藻糖2硫酸的结合产物-H2O-H+]1H-NMR(D2O)δ5.58(1H，d，J＝3.4Hz，(4)″-H)、5.35(1H，br-s，(1)-H)、5.22(1H，d，J＝6.7Hz，(1)″-H)、5.19(1H，d，J＝3.7Hz，1′-H)、5.19(1H，d，J＝3.7Hz，(1)′-H)、5.16(1H，d，J＝1.8Hz，1-H)、4.62(1H，d，J＝7.6Hz，1″-H)、4.50(1H，m，4′-H)、4.50(1H，m，(4)′-H)、4.30(1H，m，5-H)、4.30(1H，m，(5)′-H)，4.30(1H，m，(5)-CH2的H)、4.25(1H，m，2′-H)、4.25(1H，m，(2)-H)、4.25(1H，m，(2)′-H)、4.20(1H，m，(5)-CH2的H)、4.18(1H，m，5-CH2的H)、4.16(1H，m，(3)″-H)、4.08(1H，m，5-CH2的H)、4.07(1H，m，2-H)、4.02(1H，m，3′-H)、4.02(1H，m，(3)′-H)、3.85(1H，m，5-H)、3.85(1H，m，(5)-H)、3.78(1H，m，3-H)、3.78(1H，m，(3)-H)、3.76(1H，m，4″-H)、3.76(1H，m，5″-H)、3.75(1H，m，4-H)、3.75(1H，m，(4)-H)、3.58(1H，m，3″-H)、3.55(1H，m，(2)″-H)、3.18(1H，t，J＝8.2Hz，2″-H)、1.10(3H，d，J＝6.7Hz，(5)′-CH3的H3)、1.09(3H，d，J＝6.7Hz，5′-CH3的H3)糖组成L-岩藻糖∶不饱和的D-葡糖醛酸∶D-葡糖醛酸∶D-甘露糖＝2∶1∶1∶2(L-岩藻糖和D-甘露糖各2分子，不饱和的D-葡糖醛酸和D-葡糖醛酸各1分子)硫酸基6分子(每个L-岩藻糖的2位和4位以及每个D-甘露糖的6位)而1H-NMR中的峰的归属序号如下式(21)。
(21)
(f)的物理性质分子量644MSm/z 687[M+2Na-3H+]-MS/MS m/z 97[HSO4]-、243[L-岩藻糖硫酸-H+]-、421[不饱和的D-葡糖醛酸和D-甘露糖硫酸+Na-H2O-2H+]-1H-NMR(D2O)δ5.60(1H，d，J＝3.4Hz，4″-H)、5.24(1H，br-s，1-H)、5.08(1H，d，J＝4.0Hz，1′-H)、4.94(1H，d，J＝6.7Hz，1″-H)、4.45(1H，d-d，J＝3.1，10.4Hz，3′-H)、4.20(1H，br-s，2-H)、4.14(2H，m，5-CH2的H2)、4.14(1H，m，5′-H)、4.09、(1H，m，3″-H)、4.01(1H，d，J＝3.1Hz，4′-H)、3.91(1H，m，5-H)、3.85(1H，m，3-H)、3.85(1H，m，2′-H)、3.75(1H，t，J＝9.8Hz，4-H)、3.59(1H，t，J＝6.7Hz，2″-H)、1.06(3H，d，J＝6，4Hz，5′-CH3的H3)糖组成L-岩藻糖∶不饱和的D-葡糖醛酸∶D-甘露糖＝1∶1∶1(L-岩藻糖、D-甘露糖、不饱和的D-葡糖醛酸各1分子)硫酸基2分子(L-岩藻糖的3位以及D-甘露糖的6位)而1H-NMR中的峰的归属序号如下式(22)。 (g)的物理性质分子量632MSm/z631[M-H+]-MS/MS m/z 405[D-半乳糖和L-岩藻糖硫酸的结合产物-H+]-、551[L-岩藻糖硫酸和L-岩藻糖和D-半乳糖的结合产物-H+]-1H-NMR(D2O)δ5.15(1H，d，J＝4.3Hz，F11-H)、4.93(1H，d，J＝3.7Hz，F21-H)、4.53(1H，d-d，J＝2.4，10.4Hz，F13-H)、4.49(1H，d，J＝7.6HzG11-H)、4.46(1H，d-d，J＝3.1，10.7Hz，F23-H)、4.36(1H，q，J＝6.7HzF25-H)、4.14(1H，q，J＝6.7HzF15-H)、4.09(1H，d，J＝2.4HzF14-H)、4.03(1H，d，J＝3.1HzF24-H)、3.97(1H，d-d，J＝4.3，10.4Hz，F12-H)、3.90(1H，br-s，G14-H)、3.81(1H，d-d，J＝3.7，10.7Hz，F22-H)、3.59(1H，m，G13-H)、3.59(1H，m，G15-H)、3.59(2H，m，G15-CH2的H2)、3.56(1H，m，G12-H)、1.19(3H，d，J＝6.7Hz，F15-CH3的H3)、1.14(3H，d，J＝6.7Hz，F25-CH3的H3)糖组成L-岩藻糖∶D-半乳糖＝2∶1(L-岩藻糖2分子，D-半乳糖1分子)硫酸基2分子(每个L-岩藻糖的3位)而1H-NMR中的峰的归属序号如下式(23)。(23) (h)的物理性质分子量1358MS m/z 1445[M+4Na-5H+]-MS/MS m/z 97[HSO4]-、225[L-岩藻糖硫酸-H2O-H+]-、1197[M-2SO3-H+]-1H-NMR(D2O)δ5.19(1H，d，J＝4.3Hz，F11-H)、4.93(1H，d，J＝3.7Hz，F21-H)、4.62(1H，m，G21-H)、4.59(1H，m，G11-H)、4.54(1H，d-d，J＝2.7，10.6Hz，F13-H)、4.46(1H，m，F23-H)、4.46(1H，d，J＝7.6HzG31-H)、4.41(1H，br-s，G14-H)、4.41(1H，d，J＝7.6Hz，G41-H)、4.37(1H，q，J＝6.4HzF25-H)、4.27(1H，m，G13-H)、4.24(1H，br-s，G34-H)、4.21(1H，m，G33-H)、4.19(1H，m，G43-H)、4.15(1H，br-s，G44-H)、4.13(1H，q，J＝6.7Hz，F15-H)、4.09(1H，d，J＝2.7Hz.F14-H)、4.04(1H，d，J＝2.8Hz，F24-H)、3.98(1H，m，G15-CH2的H)、3.96(1H，d-d，J＝4，3.10.6Hz，F12-H)、3.88(1-H，br-s，G24-H)、3.93(1H，m，G35-CH2的H)、3.86(1H，m，G15-H)、3.81(1H，m，F22-H)、3.81(1H，m，G15-CH2的H)、3.80(1H，m，G35-H)、3.80(1H，m，G35-CH2的H)、3.66(1H，m，G23-H)、3.65(1H，m，G12-H)、3.64(1H，m，G25-CH2的H)、3.64(1H，m，G45-CH2的H)、3.61(1H，m，G45-H)、3.58(1H，m，G22-H)、3.56(1H，m，G25-CH2的H)、3.56(1H，m，G45-CH2的H)、3.55(1H，m，G42-H)、3.54(1H，m，G25-H)、3.54(1H，m，G32-H)、1.20(3H，d，J＝6.7Hz，F15-CH3的H3)、1.14(3H，d，J＝6.4Hz，F25-CH3的H3)糖组成L-岩藻糖∶D-半乳糖＝1∶2(L-岩藻糖2分子，D-半乳糖4分子)硫酸基5分子(各L-岩藻糖的3位、还原性末端D-半乳糖的3位、以及结合于还原性末端D-半乳糖的6位的D-半乳糖的3位、以及结合于该D-半乳糖的6位的D-半乳糖的3位)而1H-NMR中的峰的归属序号如下式(24)。(24) (i)的物理性质分子量1288MS m/z 1149[M+Na-2SO3-2H+]-MS/MS m/z 97[HSO4]-、345[L-岩藻糖2硫酸+Na-2H+]-、1H-NMR(D2O)δ5.68(1H，d，J＝3.4Hz，(4)″-H)、5.34(1H，br-s，(1)-H)，5.19(1H，m，1-H)、5.19(1H，m，(1)′-H)、4.94(1H，m，1′-H)，4.94(1H，d，J＝6.4Hz，(1)″-H)、4.72(1H，d，J＝7.9Hz、1″-H)、4.54(1H，m，(4)′-H)、4.48(1H，d-d，J＝3，3.10，6Hz，3′-H)、4.38(1H，q，J＝6.4Hz，5′-H)、4.34(1H，q，J＝6.7Hz，(5)′-H)、4.29(1H，m，(2)′-H)、4.20(1H，m，5-CH2的H)、4.14(1H，m，(2)-H)、4.13(1H，m，(3)″-H)、4.09(1H，m，5-CH2的H)、4.08(1H，m，2-H)、4.05(1H，d，J＝3.3Hz，4′-H)、3.99(1H，m，(3)′-H)、3.89(1H，m，5-H)、3.83(1H，m，4″-H)、3.81(1H，m，2′-H)、3.80(1H，m.4-H)、3.78(1H，m，3-H)、3.78(1H，m，(3)-H)、3.68(2H，m，(5)-CH2的H2)、3.62(1H，m，(2)″-H)、3.60(1H，m，3″-H)、3.60(1H，m，5″-H)、3.58(1H，m，(5)-H)、3.56(1H，m，(4)-H)、3.17(1H，t，J＝7.9Hz，2″-H)、1.15(3H.d，J＝6.4Hz，5′-CH3的H3)、1.11(3H，d，J＝6.7Hz，(5)′-CH3的H3)糖组成L-岩藻糖∶不饱和的D-葡糖醛酸∶D-葡糖醛酸∶D-甘露糖＝2∶1∶1∶2(L-岩藻糖和D-甘露糖各2分子，不饱和的D-葡糖醛酸和D-葡糖醛酸各1分子)硫酸基4分子(结合于还原性末端D-甘露糖的L-岩藻糖的3位、另一个L-岩藻糖的2位和4位以及还原性末端D-甘露糖的6位)而1H-NMR中的峰的归属序号如下式(25)。 另外，作为本发明的第一项发明糖化合物也可以通过使从作为本分明的第三项发明的属于Fucoidanobacter属的细菌得到的菌体提取物或培养上清作用于岩藻依聚糖来制造。
作为本分明的第三项发明的菌株只要是属于Fucoidanobacter属的本发明的菌株哪种都可以，举一个具体的例子，例如Fucoidanobacter marinusSI-0098菌株。
该菌株是本发明者从青森县的海水中新发现的菌株，它的细菌学的性质如下。2、Fucoidanobacter marinus SI-0098a、形态方面的性质(1)本菌株是球状短杆菌，有时呈现双球菌的形态。
宽0.5-0.7μm长0.5-0.7μm(2)有无胞子无(3)革兰氏染色 阴性b、生理方面的性质(1)生育的温度范围在37℃可以生育。最适生育温度是15～28℃。
(2)对氧的嗜好 好氧型
(3)对过氧化氢酶 阳性(4)对氧化酶 阴性(5)对脲酶阴性(6)水解淀粉 阳性明胶 阴性酪蛋白阴性七叶苷阳性(7)硝酸盐的还原 阴性(8)吲哚的生成阴性(9)硫化氢的生成 阳性(10)奶的凝固 阴性(11)钠的需求性 阳性(12)盐的需求性在0％食盐培养基中的生育 阴性在1％食盐培养基中的生育 阴性在海水培养基中的生育 阳性(13)醌系甲基萘醌7(14)菌体内DNA的GC含量61％(15)细胞壁的二氨基庚二酸 阴性(16)羟乙酰基试验阴性(17)羟基脂肪酸的存在 阳性(18)OF-测定0(19)菌落颜色 没有生成有特征的菌落色素(20)运动性有(21)滑动性无(22)鞭毛极单毛本菌株按照Bergey′s Manual of determinative bacteriology，第9卷(1994)记载的基本分类被分为第4类(革兰氏阴性好氧性杆菌和球菌)。然而，本菌株在电子传递链中有甲基萘醌类7，GC含量为61％等方面与属于第4类的菌有很大的不同。基本上革兰氏阴性菌在电子传递链上有泛醌，而革兰氏阳性菌有甲基萘醌类。
虽然作为革兰氏阴性菌的Flavobacterium属以及Cytophaga属例外地在电子传递链上有甲基萘醌类，但属于这些属的细菌的GC含量，作为土壤细菌Cytophaga arvensicola为43～46％，作为海洋细菌的Cytophagadiffluens、Cytophaga fermentans、Cytophaga marina、以及Cytophagauliginosa是42％，与本菌株的性质完全不同。比较本菌株和已鉴定的菌株的16rDNA序列的相同性，即使在相同性最高的已鉴定的菌株Verrucom-icrobium spinosum其相同性也只是76.6％。16SrDNA序列的相同性在90％以下时，一般都认为两个细菌的属是不同的，本发明者断定本菌株是不属于已知属的新属的细菌，由此本菌株被命名为Fucoidanobacter marinusS1-0098。
而上述菌株被表示为Fucoidanobacter marinus SI-0098，以FERM BP-5403(原保藏日平成7年3月29日，向国际保藏单位的移管申请日平成8年2月15日)保藏于国立生命科学和人体技术研究所〖收件人日本国茨城县筑波市东1丁目1番3号(邮政编码305)〗。
培养作为本分明的第三项发明的属于Fucoidanobacter属的细菌，通过使该菌体提取物或培养液上清作用于岩藻依聚糖，可以使本发明的第一项发明的糖化合物游离出来。作为培养的菌株只要是属于Fucoidanobacter属的，通过使其菌体提取物或培养液上清作用于岩藻依聚糖，可以得到本发明的第一项发明的糖化合物的菌株，无论哪种都可以，举个具体的例子，如Fucoidanobacter marinus SI-0098菌株。
向Fucoidanobacter属的细菌的培养基中加的营养源只要是该菌株能利用的、能够使该菌株由岩藻依聚糖生产可能生成作为本发明的第一项发明的糖化合物的菌体提取物以及培养上清的营养源都可以。作为碳源，例如可以利用岩藻依聚糖、海藻粉末、藻酸、岩藻糖、葡萄糖、甘露醇、甘油糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、淀粉等，作为氮源，酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、肉汤、脱脂大豆、硫铵、氯化铵等比较合适。此外，也可以加入钠盐、磷酸盐、钾盐、镁盐、锌盐等无机物，以及金属盐类。
另外，本菌株在含有上述营养源的海水或人工海水中也可以非常好地生育。
在培养作为本发明的第三项发明的属于Fucoidanobacter属的细菌时，一般培养温度为15～30℃、培养基的pH为5～9比较好，在5～72小时的通气搅拌培养下，该菌体提取物以及培养上清的内向型岩藻依聚糖分解酶的活性达到最高。根据使用的菌株、培养基的组成等设定培养条件，使该菌株生产的菌体提取物以及培养上清的内向型岩藻依聚糖分解活性达到最高。
在适当的培养基中培养属于Fucoidanobacter属的SI-0098菌株，培养结束后如果离心可得到该菌体和培养上清，再利用通常的破碎细胞的手段，例如通过超声处理等破碎菌体，然后离心，可得到菌体提取液。
将通过限界过滤浓缩的培养液上清或菌体提取液与含有氯化钠的磷酸缓冲液混合，再加入岩藻依聚糖，使其反应。
反应结束后，利用分子量分级用的柱子将反应液分级，可以得到作为本发明的第一项发明的糖化合物。
作为本发明的第一项发明的糖化合物可以用作糖链工程用试剂，如果按照特公平5-65108号记载的方法进行PA化，制备PA化物，则可以提供作为糖链工程用试剂的非常有用的物质。预料本发明的糖化合物具有作为抗癌剂、癌转移抑制剂、抗病毒剂的生理活性。
以下，用实施例给出了作为本发明的第一项发明的糖化合物的制造方法，但本发明并不限于以下的实施例的范围。实施例1将Flavobacterium sp.SA-0082(FERM BP-5402)接种于分注入由葡萄糖0.1％、胨1.0％、含有酵母提取液0.05％的人工海水(JamarinLaboratory制)pH7.5组成的培养基600ml的、经过灭菌(120℃，20分钟)的2升的三角烧瓶里，24℃下培养20小时后作为种子培养液。将取自竹篮孔样花纹海带的岩藻依聚糖0.3％、胨0.5％、酵母提取液0.01％、以及含有消泡剂(信越化学工业制KM70)0.01％的人工海水(JamarinLaboratory制)pH7.5组成的培养基20升加入30升的发酵罐里，于120℃，灭菌20分钟。冷却后接种上述的种子培养液600ml，24℃下，在每1分钟10升的通气量和每分钟125转的搅拌速度的条件下培养20小时。培养结束后，将培养液离心分离得到菌体和培养液上清。
利用限界过滤(过滤膜的排阻分子量为1万，Amicon制)将培养液上清浓缩，测定本发明内向型岩藻依聚糖分解酶时可以检测出6mU/ml的活性。
另外，将这次培养得到的菌体悬浮于含有200mM的食盐的20mM的醋酸-磷酸缓冲液(pH7.5)中，超声破碎后，离心分离得到菌体提取液。测定菌体提取液中的本发明内向型岩藻依聚糖分解酶的活性，为20mU/ml。
向上述的培养液上清的浓缩液中加入硫酸铵至终浓度达90％的饱和度，搅拌溶解后离心分离，将沉淀与上述菌体提取液同样悬浮于缓冲液里，用含有50mM的食盐的20mM的醋酸-磷酸缓冲液(pH7.5)充分透析。通过离心分离去除透析产生的沉淀后，让样品吸附于预先用含有50mM的食盐的20mM的醋酸-磷酸缓冲液(pH7.5)平衡好的DEAE-sepharose FF柱，用相同的缓冲液充分洗净吸附物，利用50mM至600mM的食盐梯度将吸附物洗脱出，收集活性级分。然后向该活性级分中加入食盐使它的终浓度达到4M后，使它吸附于预先用含有4M的食盐的20mM的磷酸缓冲液(pH8)平衡好的Phenyl Sepharose CL-4B柱，用相同的缓冲液充分洗净吸附物，利用4M至1M的食盐梯度将吸附物洗脱出，收集活性级分。利用限界过滤器(Amicon制)将该活性级分浓缩后，利用预先用含有50mM的食盐的10mM的磷酸缓冲液平衡好的Sephacryl S-200柱进行凝胶过滤，收集活性级分。然后向该活性级分中加入食盐使它的终浓度达到3.5M后，使它吸附于预先用含有3.5M的食盐的10mM的磷酸缓冲液(pH8)平衡好的PhenylSepharose HP柱，用相同的缓冲液充分洗净吸附物，利用3.5M至1.5M的食盐梯度将吸附物洗脱出，收集活性级分，得到纯化的酶。从SephacrylS-200的保留时间可以求出该酶的分子量约为7万。表1给出了以上的纯化过程。
表1
实施例2将F1avobacterium sp.SA-0082(FERM BP-5402)接种于分注入由葡萄糖0.25％、胨1.0％、含有酵母提取液0.05％的人工海水(JamarinLaboratory制)pH7.5组成的培养基600ml的、经过灭菌(120℃，20分钟)的2升的三角烧瓶里，24℃下培养24小时后作为种子培养液。将由葡萄糖0.25％、胨1％、酵母提取液0.05％、以及含有消泡剂(信越化学工业制KM70)0.01％的人工海水(Jamarin Laboratory制)pH7.5组成的培养基20升加入30升的发酵罐里，于120℃，灭菌20分钟。冷却后接种上述的种子培养液600ml，24℃下，在每1分钟10升的通气量和每分钟125转的搅拌速度的条件下培养24小时。培养结束后，将培养液离心分离得到菌体和培养液上清。
利用限界过滤(过滤膜的排阻分子量为1万，Amicon制)将培养液上清浓缩，测定本发明内向型岩藻依聚糖分解酶时可以检测出1mU/ml的活性。
另外，将这次培养得到的菌体悬浮于含有200mM的食盐的20mM的醋酸-磷酸缓冲液(pH7.5)中，超声破碎后，离心得到菌体提取液。测定菌体提取液中的本发明内向型岩藻依聚糖分解酶时可以检测出5mU/ml的活性。
向该提取液中加入硫酸铵至终浓度达90％的饱和度，搅拌溶解后离心分离，将沉淀与上述菌体提取液同样悬浮于缓冲液里，用含有50mM食盐的20mM的醋酸-磷酸缓冲液(pH7.5)充分透析。通过离心去除透析产生的沉淀后，让样品吸附于预先用含有50mM的食盐的20mM的醋酸-磷酸缓冲液(pH7.5)平衡好的DEAE-sepharose FF柱，用相同的缓冲液充分洗净吸附物，利用50mM至600mM的食盐梯度将吸附物洗脱出，收集活性级分。然后向该活性级分中加入食盐使它的终浓度达到4M后，使它吸附于预先用含有4M食盐的20mM的磷酸缓冲液(pH8)平衡好的Phenyl Sepharose CL-4B柱，用相同的缓冲液充分洗净吸附物，利用4M至1M的食盐梯度将吸附物洗脱出，收集活性级分。利用限界过滤器(Amicon制)将该活性级分浓缩后，利用预先用含有50mM食盐的10mM的磷酸缓冲液平衡好的SephacrylS-300进行凝胶过滤，收集活性级分。从Sephacryl S-300的保留时间可以求出该酶的分子量约为46万。用含有25mM食盐的10mM的磷酸缓冲液(pH7)对该活性级分透析。将该酶液吸附于预先用含有250mM食盐的10mM的磷酸缓冲液(pH7)平衡好的Mono Q HR5/5柱，用相同的缓冲液充分洗净吸附物，利用250mM至450mM的食盐梯度将吸附物洗脱出，收集活性级分，得到纯化的酶。表2给出了以上的纯化过程。
表2
实施例3使本发明的实施例1得到的内向型岩藻依聚糖分解酶(菌体内酶)作用于纯化的取自竹篮孔样花纹海带的岩藻依聚糖，进行分解物的制备。
即，将2.5％的岩藻依聚糖溶液16ml、50mM的磷酸缓冲液(pH7.5)12ml、4M的氯化钠4ml和32mU/ml的本发明的内向型岩藻依聚糖分解酶溶液8ml混合，25℃，反应48小时。
反应液经Cellulofine GCL-300柱(生化学工业社制)进行分子量分级，收集分子量2000以下的级分。该级分经Micro Acilyzer G3(旭化成社制)脱盐后，再经DEAE-Sepharose FF分成3个级分。结果得到上述物质(a)、(b)、(c)的量分别为41mg、69mg、以及9.6mg。实施例4使本发明的实施例2得到的内向型岩藻依聚糖分解酶(菌体外酶)作用于纯化的取自竹篮孔样花纹海带的岩藻依聚糖，进行分解物的制备。
即，将2.5％的岩藻依聚糖溶液16ml、50mM的磷酸缓冲液(pH7.5)1 2ml、4M的氯化钠4ml和32mU/ml的本发明的内向型岩藻依聚糖分解酶溶液8ml混合，25℃，反应48小时。
反应液经Cellulofine GCL-300柱(生化学工业社制)进行分子量分级，收集分子量2000以下的级分。该级分经Micro Acilyzer G3(旭化成社制)脱盐后，再经DEAE-Sepharose FF分成3个级分，冷冻于燥。结果得到上述物质(a)、(b)、(c)的量分别为40mg、65mg、以及9.2mg。实施例5将由得自竹篮孔样花纹海带的岩藻依聚糖0.3％、胨0.5％、酵母提取液0.05％、以及含有消泡剂(信越化学工业制KM70)0.01％的人工海水(Jamarin Laboratory制)pH7.5组成的培养基600ml加入到三角烧瓶里，灭菌(120℃，20分钟)，然后将Fucoidanobacter marinus SI-0098(FERM BP-5403)接种于该培养基中，25℃下，在每分钟120转的搅拌速度的条件下培养48小时。培养结束后，将培养液离心分离得到菌体和培养液上清。
利用限界过滤(过滤膜的排阻分子量为1万，Amicon制)将培养液上清浓缩，测定本发明内向型岩藻依聚糖分解酶时可以检测出0.2mU/ml的活性。
另外，将这次培养得到的菌体悬浮于含有200mM食盐的20mM的醋酸-磷酸缓冲液(pH7.5)中，超声破碎后，离心得到菌体提取液。测定菌体提取液中的本发明内向型岩藻依聚糖分解酶时可以检测出20mU/ml的活性。实施例6使本发明的实施例5得到的Fucoidanobacter marinus SI-0098菌株的菌体内酶作用于纯化的取自竹篮孔样花纹海带的岩藻依聚糖，进行分解物的制备。
即，将2.5％的岩藻依聚糖溶液16ml、含有800mM氯化钠的100mM的磷酸缓冲液(pH8)20ml和20mU/ml的本发明的实施例5得到的Fucoid-anobacter marinus SI-0098菌株的菌体内酶溶液4ml混合，5℃，反应48小时。
反应液经Cellulofine GCL-300柱进行分子量分级，收集分子量2000以下的级分。该级分经Micro Acilyzer G3(旭化成社制)脱盐后，再经DEAE-Sepharose FF分成3个级分，冷冻干燥。结果得到上述物质(a)、(b)、(c)的量分别为38mg、60mg、以及8.2mg。
本发明提供可以用于岩藻依聚糖的结构解析、岩藻依聚糖的酶分解物的鉴定以及生物活性的检定中的糖化合物；在岩藻依聚糖的部分分解以及岩藻依聚糖寡糖的生产等与岩藻依聚糖有关的研究中有用的新的内向型岩藻依聚糖分解酶；以及在糖化合物的制造中有用的新的微生物。
权利要求
1.内向型岩藻依聚糖分解酶，其特征是具有下述的理化性质，(I)作用作用于岩藻依聚糖，至少可以使下述式(7)和式(8)表示的糖化合物游离出来；(II)最适pH该酶的最适pH是6～10；(III)最适温度该酶的最适温度是30～40℃。
2.电子传递链中含有甲基萘醌、GC含量约为60％的Fucoidanobacter属的细菌。
全文摘要
本发明提供新的内向型岩藻依聚糖分解酶、以及在糖化合物的制造中有用的新的微生物。
文档编号C07H1/00GK1330143SQ0013482
公开日2002年1月9日 申请日期2000年12月1日 优先权日1995年4月28日
发明者酒井武, 木村眸, 儿岛薰, 中西芳邦, 加藤郁之进, 猪饲胜重, 秋吉纯子 申请人:宝酒造株式会社, 株式会社糖锁工学研究所