一种新型lncRNA及其抑制剂、诊断试剂、药物和应用
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种全新的和癌症相关的lncrna序列。
背景技术：
鼻咽癌是一种独特的上皮性恶性肿瘤，鼻咽癌不仅给患者健康带来严重损害，而且也给社会家庭带来沉重的精神及经济负担。鼻咽癌有较高的转移和侵袭倾向，淋巴结转移发生较早。大多数鼻咽癌患者确诊时己错失最佳诊断和治疗时机，丧失治愈机会，导致疾病进展、肿瘤转移，甚至步入晚期。鼻咽癌的诊断主要依靠其独特的临床和病理特征缺乏早期诊断、综合治疗及病情监测中有效的分子标记物，是限制鼻咽癌预后改善的重要障碍之一。因此，加强鼻咽癌早期诊断研究，建立新的早期鼻咽癌或转移性鼻咽癌的诊断标准，进而探索新的干预措施，防止鼻咽癌的进一步复发及转移，提髙鼻咽癌术前术后的治疗效果，増加患者的存活率和生活质量对疾病的治疗和预防具有重大的意义。
lncrna是指转录的rna分子长度超过200个核苷酸，在常规意义上没有或几乎没有功能蛋白编码能力，特点是保守性差并且尚未完全明了其多种调节基因表达机制。调节机制涉及转录水平、转录后水平和表观遗传水平。根据与蛋白质编码基因的位置关系，lncrnas可分为5类：正义、反义、基因间、内含子和双向lncrnas。
在鼻咽癌中已发现了一些功能性的lncrna，比如：lncrnaafap1-as1作为mir-423-5p的竞争性内源性rna(cerna)，通过调节rho/rac途径促进鼻咽癌细胞的转移；linc01133通过直接与ybx1结合促进鼻咽癌细胞的增殖，侵袭和迁移；lncrnadancr作为鼻咽癌预后生物标志物，并通过与nf90/nf45互作增加hif-1α的mrna稳定性，并促进鼻咽癌的转移和癌变进程。lncrna的分子作用机制可以分为4种类型：①lncrna可以作为影响基因转录的分子信号，即lncrna的转录可以发生在特定的时间和地点，以整合生长发育线索，解释细胞背景，或对不同的刺激作出反应，可作为重要生物功能事件的标记。②可作为诱饵，即lncrnas被转录，然后结合靶基因，但它自己本身不会发挥任何其他功能。lncrna充当靶基因的“分子汇”，靶基因它们本身是转录因子，或染色质修饰物，或其他调控分子，rna抑制它的靶基因执行功能。与mirna结合形成竞争性rna(cerna)就是这种原型。③可作为向导，即rna结合蛋白质的向导，然后指导核糖核蛋白复合物定位于特定靶标。④可以作为支架，这可能是功能上最复杂的一类，lncrna具有不同的结合域可同时结合不同的效应分子。
技术实现要素：
本发明第一目的在于，提供了一种全新序列的新型lncrna。
本发明第二目的在于，提供所述的新型lncrna在作为生物标志物在制备鼻咽癌诊断或预后评价的产品中的应用。
本发明第三目的在于，提供一种通过评价新型lncrna表达量来判断鼻咽癌诊断或预后评价的产品。
本发明第四目的在于，提供一种抑制新型lncrna表达的抑制剂。
本发明第五目的在于，提供一种所述的抑制剂在制备治疗鼻咽癌的产品中的应用。
本发明第六目的在于，提供一种包含所述的新型lncrna抑制剂的药物组合物。
本发明第七目的在于，提供一种依赖所述的新型lncrna表达来筛选治疗鼻咽癌的候选药物的方法。
我们发现一种长链非编码rna新型转录本，其基因号：ensg00000259345，位于人染色体15q14，经过3’race和5’race获取其全长为1487bp，其核酸序列如下：
ctttgactcggaaagggaactccctgaccccttgcgcttcccaggtgaggcaatgcctcgccctgcttcggctcgtgcacagtgcatgcacccactggcctgcatccactgtctggcactccctagtgagatgaacccggtacctcagatggaaatgcagaaatcacccgtcttctgcgtcgctcacgctgggagctgtagaccggagctgttcctattcggccatcttgggtctggattcggcattacatgtcttaacggaaaaatcaactcaagatggattaaggacttaaacctaagacttgaaactataaaaattctagaagataacattggaaaaacccttctagacattgacttagataagtatttcatgaccaagaacccaaaagcaaatgcaataaaaacaaagataaataactaggacctaactgaactaagagcttttgtgcagcaaaaagaacagtcagcagagtaaacagacaacctacagagtgggagaaaatcttcacaatctatacatctgacaaaggactaatattcagaatccacaacaaacacaaatcagtgaaaaaatcctatcaaaaagtgggctaaggacataaatagacaattctcaaaagaagatatacaaacgtccaataaacatgcaaaaaatgctcaacatcactaatgatcagggaaatgcaaatcaaaaccacaatgtgatatcactttgctcctgcaagaatggccataatcaaaaaattgaaaaacagtagatgttggcgtgggtgtggtgataagggaacacttctacactgctggtgggaatgtaaactagtacagccactgtggaaaatggtgtggagattccttaaagaatgaaaagtagaactaccatttgatccagcaatccagttactgggtatctacccagaggaaaataagtcattattagaaaaagataacttgcacacacatgtttatagcagcgcagttcacgattgcaaaatcgtggaaccatccaaatacccatcaatcaatgagtaaagaaactgtggtgtgtatatatatatatatatatatgatggtatactacatagccataaaaaggaatgaatcaacagcatttgcagtgacctggatgagactggagactattattctaagtgaagtaactcaggaatggaaaaccaaacatcgtatgttctcactgatatatgggagctaagctatgaggacgcaagggcataggaatgatacaatggactttggggatttggggaaagggataggagggggcaagggataaaagacttcaactagggtgctgtgtatactgctcaggtgatgggtccaccaaaatattgcaaatcaccactaaagaacttatgtaaccaaatatcacctgtaccccaataacttatggaaaaataaaaagtataaataaaataaaaaataaaataaatgcacaccccaatcccatacaaaaaaaaaaaaaaaaa。
(其序列见序列表seqidno.1所示)。
作为优选，所述的新型lncrna为癌症的诊断或预后评价的标记物；所述的癌症优选为鼻咽癌。
本发明提供了一种全新序列的lncrna，且发现其表达水平与癌症例如鼻咽癌患者的临床病理特征和预后相关。研究还发现，该新型lncrna可以作为癌症例如鼻咽癌的标记物用于癌症的诊断和预后评价，此外，其过表达还会导致癌细胞增值和转移，敲低其表达可用于癌症例如鼻咽癌的治疗和预防转移。
本发明创新地发现新型lncrna在鼻咽癌患者中异常高表达，并与ebv(鼻咽癌病毒)相关，通过一系列分子生物学实验，结合人群样本验证，揭示该新型lncrna在鼻咽癌中异常表达的临床意义以及生物学功能，并进一步阐明它在鼻咽癌发生过程中可能的分子机制，为评价新型lncrna作为鼻咽癌早期诊断、预后评估以及治疗靶标的生物标志物提供理论依据。
本发明创新地发现，鼻咽癌发生发展相关的新型lncrna，为鼻咽癌的诊断和治疗提供分子靶标，实现患者的个性化诊疗。
本发明提供了一种新型lncrna作为生物标志物在制备鼻咽癌诊断或预后评价的产品中的应用。
本发明研究发现，新型lncrna的表达上调可以用于预期以及诊断鼻咽癌。
本发明还提供了一种鼻咽癌诊断或预后评价的产品，包括可检测(靶向结合)所述新型lncrna表达的试剂。
研究发现，所述的新型lncrna在鼻咽癌患者中表达上调，通过测定鼻咽癌患者样品中的lncrna的表达量，可以用于用于诊断鼻咽癌，或者用来评价预后情况。
作为优选，所述试剂包括通过深度测序技术、核酸扩增技术和原位杂交(ish)检测样本中新型lncrna表达水平的试剂。
本发明提供了一种诊断鼻咽癌的产品，包括芯片、制剂、试剂盒或核酸膜条，产品包括检测样本中新型lncrna水平的试剂。
进一步优选，所述的试剂为可特异识别新型lncrna的探针或者引物。
更进一步优选，特异性识别新型lncrna的探针，其序列为：
5’-agacatgtaatgccgaatcca-3’(其序列见序列表seqidno.2所示)。
更进一步优选，所述的特异性扩增新型新型lncrna的引物，正向引物：5'-gcatccactgtctggcactc-3'(其序列见序列表seqidno.3所示)；
反向引物：5'-gatggccgaataggaacagc-3'(其序列见序列表seqidno.4所示)。
本发明还提供了一种抑制新型lncrna表达的抑制剂，其能够抑制lncrna表达或转录的干扰分子。
本发明创新地发现，机体中的新型lncrna的表达提升与鼻咽癌细胞的增值以及转移有关联，通过对患者使用可降低机体新型lncrna表达的抑制剂，有助于抑制鼻咽癌细胞的增值和转移，可以用于鼻咽癌的治疗。
作为优选，所述抑制剂选自：以新型lncrna为靶序列、且能够抑制新型lncrna表达或转录的干扰分子，优选包括：shrna(小发夹rna)、小干扰rna(sirna)、dsrna、微小rna、反义核酸，或能表达或形成所述shrna、小干扰rna、dsrna、微小rna、反义核酸的构建物。
进一步优选，所述的抑制剂为shrna。
优选地，shrna的序列为：5′-ucuggauucggcauuacau-3′(其序列见序列表seqidno.5所示)。干扰效果65％。
本发明还提供了一种所述的抑制剂在制备治疗鼻咽癌的产品中的应用。本发明所述的抑制剂，通过抑制体系中的新型lncrna来抑制癌细胞增值和转移，可以达到治疗鼻咽癌的作用。所述的鼻咽癌为原发性鼻咽癌或转移性鼻咽癌。
本发明还提供了一种药物组合物，包括有效量的所述的新型lncrna的抑制剂。
在本发明中，所述药物组合物还包括与所述抑制剂相配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。
所述的药物组合物为治疗癌症的药物组合物；进一步优选为治疗鼻咽癌的药物组合物。
本发明的药物还可与其他治疗鼻咽癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。
更进一步优选，所述的鼻咽癌为原发性鼻咽癌或转移性鼻咽癌。
本发明提供了一种筛选治疗鼻咽癌的候选药物的方法，所述方法包括：
步骤(1)：用待筛选物质处理表达或含有新型lncrna基因的体系；
步骤(2)：检测步骤(1)处理后的体系中新型lncrna的表达；筛选出可降低体系新型lncrna表达量的物质，即为候选药物。
作为优选，所述体系选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
作为优选，筛选出表达量降低20％以上，优选降低50％以上、进一步优选降低80％以上的物质。本发明中，若所述待筛选的药物可以抑制鼻咽癌的表达水平(优选显著降低，如低20％以上，较佳的低50％以上；更佳的低80％以上)，则表明该候选药物是治疗鼻咽癌的候选药物。
所述候选药物包括(但不限于)：针对新型lncrna或其上游或下游基因设计的干扰分子、核酸抑制物、小分子化合物等。
有益效果
1、本发明创新地提供了一种全新序列的lncrna，且发现其与癌症特别是鼻咽癌存在关联性，可以用于鼻咽癌的诊断标记物。
2、本发明还研究发现，所述的新型lncrna的过表达诱使癌细胞的增值和转移，通过所述的抑制剂敲低该新型lncrna的表达，可以抑制癌细胞增值和转移，可以用于鼻咽癌的治疗。
3、本发明提供了一种通过新型lncrna的抑制表达情况来筛选鼻咽癌药物的全新思路和方法。
附图说明
图1是利用qpcr检测新型lncrna在鼻咽癌组织和细胞系中表达情况；
图2是利用原位杂交(ish)检测新型lncrna在鼻咽癌组织芯片中的ish典型染色；
图3是新型lncrna表达与鼻咽癌患者预后相关的生存分析图；
图4是sirna转染和shrna慢病毒感染后，在cne1和5-8f细胞中验证敲低效率图；
图5是采用cck-8，edu细胞增殖实验和平板克隆检测敲低新型lncrna后对cne1和5-8f细胞的增殖影响
图6是运用transwell迁移实验检测敲低新型lncrna后，cne1和5-8f细胞的迁移影响
图7是qpcr检测新型lncrna在转染过表达质粒后cne1和5-8f细胞表达情况
图8是是采用cck-8，edu细胞增殖实验和平板克隆检测过表达新型lncrna后对cne1和5-8f细胞的增殖影响
图9是运用transwell迁移实验检测过表达新型lncrna后对cne1和5-8f细胞的迁移影响
图10是敲低新型lncrna可抑制鼻咽癌5-8细胞在裸鼠体内的生长情况
图11是he和ihc染色显示敲低新型lncrna细胞的裸鼠移植瘤组织cdk4和ki67的表达情况。
图12.rip分析新型lncrna与cdk4相互作用(左)；新型lncrna参与cdk4/cdk6/cyclind1/rb/e2f1信号通路，调节鼻咽癌细胞增殖(右)。
图13为实施例1的5-race步移pcr电泳结果分析图；dl5000marker：100，250，500，750，1000，1500，2000，3000，5000；lane：5-race步移pcr电泳结果(269bp)
图14为实施例1的3-racepcr电泳结果分析图；dl5000marker：100，250，500，750，1000，1500，2000，3000，5000；lane：3-racepcr电泳结果(852bp)；
图15为实施例1的新型lncrna基因pcr扩增结果图；m：dl5kdnamarker(100，250，500，750，1000，15000，2000，3000，5000bp)1：新型lncrna部分基因pcr扩增产物(约1470bp)。
具体实施方式
一、药品以及器材
细胞系
1)人永生化鼻咽上皮细胞株np69和鼻咽癌细胞株c666-1购自中南大学现代分析测试中心细胞生物学实验室。
2)鼻咽癌细胞系cne1、cne2、6-10b、5-8f和hne3为本实验室液氮罐中保存。
临床组织样本
第1组样本：20例鼻咽癌和14例慢性炎性鼻咽上皮(npe)新鲜活检组织，用于逆转录荧光定量聚合酶链反应(rt-qpcr)分析。第1组的鼻咽癌和npe活检组织通过中南大学湘雅医院的组织病理学检查证实(患者未进行放疗，化疗或手术)。新鲜组织离体后，立即浸入rnalater溶液中，然后立即浸入液氮中并转移至实验室-80℃冰箱中。所有样本的收集都是在患者同意后进行的。
第2组样本：组织阵列包括130个石蜡包埋的鼻咽癌样本购于上海芯超公司，用于原位杂交(ish)分析。该研究是根据赫尔辛基宣言进行的，该方案经中南大学湘雅医院伦理委员会批准(项目识别代码：201612797)
1)抗体
表1抗体来源与工作浓度
2)主要试剂
fbs：biowests.a.s公司提供。rpmi1640、角质形成细胞-sfm、青霉素-链霉素、dmso，gibco公司提供。嘌呤霉素，索莱宝公司提供。rna保护液，ambion公司提供。trizol，invitrogen公司提供。goscripttmreversetranscriptionsystem试剂盒、
实验中所用的质粒和慢病毒
1)用于过表达的质粒及相应对照空载质粒购自上海吉凯基因，并经测序验证其质量。根据我们验证的新型lncrna的序列，过表达质粒所用载体名称：gv146，元件顺序：cmv-mcs-ires-egfp-sv40-neomycin。
2)用于敲低的慢病毒及对照慢病毒都购自上海吉凯基因，并经测序验证其质量。根据3条sirna的敲低效率，选择敲低效率最高的sirna-1，根据其核心靶序列设计shrna慢病毒系统。shrna慢病毒所用载体名称：gv248，元件顺序：hu6-mcs-ubiquitin-egfp-ires-puromycin。
二、实验步骤以及结果
实施例1：race获得新型lncrna全长序列
人鼻咽癌细胞系cne1在rpmi1640培养基中贴壁培养，其中含10％fbs+1％双抗(青霉素-链霉素)
实验主要步骤
总rna提取
a:采用
新型lncrna的5-race实验
模板采用generacertmkit(invitrogen)进行合成，具体方法参考试剂盒说明书。
a:引物设计
利用数据库中的序列，采用primerpremier6.0软件进行5-race引物的设计，然后进行引物合成，具体引物序列如下：
表1：第一部分5-race步移引物名称及序列
b:5-racepcr反应体系及条件
表2：5-racepcr第一轮反应体系
表3：5-racepcr第一轮反应条件
表4：5-racepcr第二轮反应体系
表5：5-racepcr第二轮反应条件
c:5-racepcr电泳结果
pcr结束后，采用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行分析(结果如下图13)，5-racepcr呈现出一条特异性条带，切胶回收后，连接pgm-t载体，转化高效化学感受态细胞dh5α，然后进行测序分析。
d:测序结果分析
①5-race获得序列大小：269bp
②5-race获得具体序列如下：
gactgaaggagtagaaactttgactcggaaagggaactccctgaccccttgcgcttcccaggtgaggcaatgcctcgccctgcttcggctcgtgcacagtgcatgcacccactggcctgcatccactgtctggcactccctagtgagatgaacccggtacctcagatggaaatgcagaaatcacccgtcttctgcgtcgctcacgctgggagctgtagaccggagctgttcctattcggccatcttgggtctggattcggcattacatg
方框代表5-race接头序列，下划线部分代表r2引物位置新型lncrna基因的3-race实验
模板采用generacertmkit(invitrogen，货号：l1500-01)进行合成，具体方法参考试剂盒说明书。
a:引物设计
利用数据库中的序列，采用primerpremier6.0软件进行3-race引物的设计，然后进行引物合成，具体引物序列如下：
表1：3-race引物名称及序列
b:3-racepcr反应体系及条件
表2：3-racepcr第一轮反应体系
表3：3-racepcr第一轮反应条件
表4：3-racepcr
表5：3-racepcr第二轮反应条件
c:3-racepcr电泳结果
pcr结束后，采用1.2％琼脂糖凝胶电泳进行分析(结果如下图14)，3-racepcr呈现出一条特异性条带，切胶回收后，连接pgm-t载体，转化高效化学感受态细胞dh5α，然后进行测序分析。
d:测序结果分析
①3-race获得序列大小：852bp
②3-race获得具体序列如下：
gctcaacatcactaatgatcagggaaatgcaaatcaaaaccacaatgtgatatcactttgctcctgcaagaatggccataatcaaaaaattgaaaaacagtagatgttggcgtgggtgtggtgataagggaacacttctacactgctggtgggaatgtaaactagtacagccactgtggaaaatggtgtggagattccttaaagaatgaaaagtagaactaccatttgatccagcaatccagttactgggtatctacccagaggaaaataagtcattattagaaaaagataacttgcacacacatgtttatagcagcgcagttcacgattgcaaaatcgtggaaccatccaaatacccatcaatcaatgagtaaagaaactgtggtgtgtatatatatatatatatatatgatggtatactacatagccataaaaaggaatgaatcaacagcatttgcagtgacctggatgagactggagactattattctaagtgaagtaactcaggaatggaaaaccaaacatcgtatgttctcactgatatatgggagctaagctatgaggacgcaagggcataggaatgatacaatggactttggggatttggggaaagggataggagggggcaagggataaaagacttcaactagggtgctgtgtatactgctcaggtgatgggtccaccaaaatattgcaaatcaccactaaagaacttatgtaaccaaatatcacctgtaccccaataacttatggaaaaataaaaagtataaataaaataaaaaataaaataaatgcacaccccaatcccatacaaaaaaaaaaaaaaaaa
方框代表3-race接头序列，下划线部分代表f2引物
新型lncrna基因拼接结果
a:新型lncrna的大小：1487bp:
b:新型lncrna的具体序列如下：
ctttgactcggaaagggaactccctgaccccttgcgcttcccaggtgaggcaatgcctcgccctgcttcggctcgtgcacagtgcatgcacccactggcctgcatccactgtctggcactccctagtgagatgaacccggtacctcagatggaaatgcagaaatcacccgtcttctgcgtcgctcacgctgggagctgtagaccggagctgttcctattcggccatcttgggtctggattcggcattacatgtcttaacggaaaaatcaactcaagatggattaaggacttaaacctaagacttgaaactataaaaattctagaagataacattggaaaaacccttctagacattgacttagataagtatttcatgaccaagaacccaaaagcaaatgcaataaaaacaaagataaataactaggacctaactgaactaagagcttttgtgcagcaaaaagaacagtcagcagagtaaacagacaacctacagagtgggagaaaatcttcacaatctatacatctgacaaaggactaatattcagaatccacaacaaacacaaatcagtgaaaaaatcctatcaaaaagtgggctaaggacataaatagacaattctcaaaagaagatatacaaacgtccaataaacatgcaaaaaatgctcaacatcactaatgatcagggaaatgcaaatcaaaaccacaatgtgatatcactttgctcctgcaagaatggccataatcaaaaaattgaaaaacagtagatgttggcgtgggtgtggtgataagggaacacttctacactgctggtgggaatgtaaactagtacagccactgtggaaaatggtgtggagattccttaaagaatgaaaagtagaactaccatttgatccagcaatccagttactgggtatctacccagaggaaaataagtcattattagaaaaagataacttgcacacacatgtttatagcagcgcagttcacgattgcaaaatcgtggaaccatccaaatacccatcaatcaatgagtaaagaaactgtggtgtgtatatatatatatatatatatgatggtatactacatagccataaaaaggaatgaatcaacagcatttgcagtgacctggatgagactggagactattattctaagtgaagtaactcaggaatggaaaaccaaacatcgtatgttctcactgatatatgggagctaagctatgaggacgcaagggcataggaatgatacaatggactttggggatttggggaaagggataggagggggcaagggataaaagacttcaactagggtgctgtgtatactgctcaggtgatgggtccaccaaaatattgcaaatcaccactaaagaacttatgtaaccaaatatcacctgtaccccaataacttatggaaaaataaaaagtataaataaaataaaaaataaaataaatgcacaccccaatcccatacaaaaaaaaaaaaaaaaa
新型lncrna在正常鼻炎组织中验证全长实验
a：新型lncrna基因进行pcr扩增及回收
①模板：鼻炎组织cdna
②引物序列(去除序列中a尾)
表1：引物名称及序列
③pcr扩增体系及条件
表2：pcr扩增反应体系
表3：pcr扩增反应条件
④pcr扩增结果
pcr结束后，采用1.2％琼脂糖凝胶电泳进行分析(结果如下图15)，pcr产物呈现出一条特异性条带，切胶回收后，连接pgm-t载体，转化高效化学感受态细胞dh5α，然后进行测序分析。
⑤测序结果
新型lncrna在正常鼻炎组织中的序列为：
ctttgactcggaaagggaactccctgaccccttgcgcttcccaggtgaggcaatgcctcgccctgcttcggctcgtgcacagtgcatgcacccactggcctgcatccactgtctggcactccctagtgagatgaacccggtacctcagatggaaatgcagaaatcacccgtcttctgcgtcgctcacgctgggagctgtagaccggagctgttcctattcggccatcttgggtctggattcggcattacatgtcttaacggaaaaatcaactcaagatggattaaggacttaaacctaagacttgaaactataaaaattctagaagataacattggaaaaacccttctagacattgacttagataagtatttcatgaccaagaacccaaaagcaaatgcaataaaaacaaagataaataactaggacctaactgaactaagagcttttgtgcagcaaaaagaacagtcagcagagtaaacagacaacctacagagtgggagaaaatcttcacaatctatacatctgacaaaggactaatattcagaatccacaacaaacacaaatcagtgaaaaaatcctatcaaaaagtgggctaaggacataaatagacaattctcaaaagaagatatacaaacgtccaataaacatgcaaaaaatgctcaacatcactaatgatcagggaaatgcaaatcaaaaccacaatgtgatatcactttgctcctgcaagaatggccataatcaaaaaattgaaaaacagtagatgttggcgtgggtgtggtgataagggaacacttctacactgctggtgggaatgtaaactagtacagccactgtggaaaatggtgtggagattccttaaagaatgaaaagtagaactaccatttgatccagcaatccagttactgggtatctacccagaggaaaataagtcattattagaaaaagataacttgcacacacatgtttatagcagcgcagttcacgattgcaaaatcgtggaaccatccaaatacccatcaatcaatgagtaaagaaactgtggtgtgtatatatatatatatatatatgatggtatactacatagccataaaaaggaatgaatcaacagcatttgcagtgacctggatgagactggagactattattctaagtgaagtaactcaggaatggaaaaccaaacatcgtatgttctcactgatatatgggagctaagctatgaggacgcaagggcataggaatgatacaatggactttggggatttggggaaagggataggagggggcaagggataaaagacttcaactagggtgctgtgtatactgctcaggtgatgggtccaccaaaatattgcaaatcaccactaaagaacttatgtaaccaaatatcacctgtaccccaataacttatggaaaaataaaaagtataaataaaataaaaaataaaataaatgcacaccccaatcccatac
通过加上17个a尾就得到新型lncrna的全长序列。
实施例2：
lncrna在鼻咽癌组织和细胞系中表达情况研究：
实验主要步骤
细胞培养：细胞培养于37℃、5％co2的恒温恒湿培养箱中，人永生化鼻咽上皮细胞株np69在角质形成细胞-sfm培养基中贴壁培养，其中含有牛垂体提取物。
人鼻咽癌细胞系c666-1、cne1、cne2、6-10b、5-8f和hne3在rpmi1640培养基中贴壁培养，其中含10％fbs+1％双抗(青霉素-链霉素)
rna提取与rna的逆转录
trizol法抽提总rna：
a:细胞：弃培养基，以pbs轻轻洗涤1-3次，弃pbs，收获细胞1～5×107，加入1mltrizol混匀；用1mltip枪头(无酶)反复吹打抽吸，室温静置5min。组织：取50～100mg组织(新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可)置2ml尖底离心管中，加入3-4颗直径4mm钢珠(经depc水处理过夜，高压灭菌后再烘干)，加入1mltrizol对称放于组织研磨器中，40-50hz充分匀浆5-10min，室温静置5min。
b:加入0.2ml氯仿，于涡旋混匀器上剧烈振荡15～30s，静置2～3min。4℃离心，12000g×15min后。样品分为三层：底层为黄色有机相，里面含有氯仿、苯酚和变性蛋白质；中间层为白色膜状，其中沉淀有dna和上层为无色水相。rna主要在水相中，水相体积约为所用trizol试剂的60％。
c:小心吸取上清至一新的1.5mlep管(无酶)中(如要分离dna和蛋白质可保留有机相)，加入0.5ml异丙醇，将管中液体颠倒多次使之混匀，室温静置10min
d:4℃离心，12000g×10min。离心前看不出rna沉淀，离心后在管侧和管底出现白色沉淀。弃上清，加入1ml75％乙醇(冰冷，用depc水配制)，振摇以充分洗涤沉淀。
a.e:4℃离心，12000g×5min。弃上清，短暂离心，小心吸取弃去上清。
离心管倒扣在滤纸上，自然干燥10min，使剩余乙醇挥发。加入适量(20ul-30ul)depc(rnase-free)水溶解rna,吹打混匀。
f:用紫外分光光度计检测样品rna的浓度和纯度(a260nm/a280nm吸光度比值，比值在1.8～2.0之间则rna纯度较高)，如满足实验需求，可继续进行rna逆转录，或放于-80℃冰箱保存。
rna的逆转录
a:使用promega公司的goscript逆转录试剂盒进行逆转录。将试剂盒各组分置于冰上融化后，表2加入各组分，配制rt-mix(按总反应体积20μl计算)；配制rt-mix的总体积＝每管加入量×样品数，计算的样品数要比实际样品数多1-2个，将液体挂壁造成的体积损失计算其中。
表2逆转录反应体系
b:将配好的rt-mix分至各ep管，加入总rna(1-2μg)，并加水将体积补齐至20μl：
c:设置逆转录反应程序：42℃、15min的延伸；70℃、15min的逆转录酶灭活；4℃终止。逆转录程序完成后得到的cdna，稀释10-100倍，可直接用于实时荧光定量pcr，或储存于-20℃
实时荧光定量pcr
a:使用promega公司的
第一步：预变性循环数：1次95℃10min
第二步：扩增反应循环数：40次；95℃15s；60℃1min
第三步：熔解曲线(meltcurve)分析(用仪器默认的程序)
c:每次实验至少做3个平行复孔，以β-actin为内参，数据并进一步以阴性对照归1来表达。用2-δδct方法计算靶基因的相对表达量。该实验进行三次独立重复实验。
新型lncrna在鼻咽癌组织和细胞系中表达情况见图1所示。a.用逆转录聚合酶链反应(rt-qpcr)检测14例npe组织和20例鼻咽癌组织中新型lncrna的表达。结果用log2(2-δδct)表示。b.rt-qpcr鼻咽癌细胞株(c666-1、cne1、5-8f、cne2、6-10b和hne3)中新型lncrna的表达,结果发现：相对于14例慢性炎性npe组织，新型lncrna在20例鼻咽癌组织中高表达表达；新型lncrna在6个鼻咽癌细胞系中的表达普遍高于np69细胞系，其中在c666-1细胞中表达最高，提示新型lncrna可能与鼻咽癌ebv(eb病毒)相关。
实施例3：
lncrna在鼻咽癌组织芯片中的ish典型染色研究：
原位杂交(ish)
a.采用福尔马林固定石蜡包埋组织芯片(4mm厚切片)进行原位杂交。为了原位检测新型lncrna的相对表达量，将组织阵列与新型lncrna互补的5‘-和3’-地高辛标记的寡核苷酸探针(exiqon，美国)杂交。该探针序列与新型lncrna互补，序列如下：5‘-agacatgtaatgccgaatcca-3’。根据ish标准操作流程进行操作，操作过程注意全程无酶。杂交时使用硝基蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯彩色底物(roche，瑞士)。
b.将组织芯片放入烘箱中，60-65℃，烘烤1小时。探针的预处理：准备1×rna-ish缓冲液(100ul2×rna-ish缓冲液和10uldepch2o)。若要将探针稀释成500nm的浓度(1:200的稀释比例)，将1ul的lna探针放于无rna酶的pcr管中，90℃变性4min。放在冰上，短暂离心后加入200ul的1×rna-ish缓冲液。-20℃保存备用
c.样本脱蜡(此步骤在通风橱中进行)，二甲苯5min×3次；去除二甲苯：(100％乙醇，上下浸洗10次，两次；100％乙醇，5min；96％乙醇，上下浸洗10次；96％乙醇，5min；70％乙醇，上下浸洗10次；乙醇70％，5min；pbs洗涤2-5min)。
d.蛋白酶消化样本：组织芯片放于40ml蛋白酶k缓冲液(5ug/ml)中，37℃(用温度计确认为37℃)，2min；pbs轻轻震摇2次；酒精脱水(70％乙醇，上下浸洗10次；乙醇70％，1min；96％乙醇，上下浸洗10次；96％乙醇，1min；100％乙醇，上下浸洗10次；100％乙醇，1min)；干净的滤纸空气干燥15min。
e.杂交(杂交温度为探针的tm—21℃)：每张玻片上加20ul的杂交液；探针浓度根据说明书进行稀释，按50nm/200nm稀释浓度进行摸索。盖上盖玻片，用胶水封片(防止干片)，杂交温度下放(50-60℃)1h。
f.严格的洗片：用镊子小心把封片胶撕掉，把玻片放入下面溶液梯度洗片：(5×ssc，50℃，5min；1×ssc，50℃，5min；0.2×ssc，50℃，5min；0.2×ssc，室温，5min)；室温，pbs洗涤5min
g.免疫检测：将玻片甩干，在室温湿盒上滴加封闭液(1ml封闭液：10×roche封闭液100ul，1×顺丁烯二酸缓冲液900ul)，封闭15min；用纸吸干封闭液后，在湿盒上滴加anti-dig-apfabfragments，稀释比例1:800(1ul探针：800ul封闭液)，在1：500-1：2000之间摸索，4℃过夜；室温，pbst洗涤3min×3次。
h.颜色反应(室温，避光)：室温下，加入400ulnbt/bcip避光反应，显色数小时；室温，pbst洗涤5min×3次；在水中洗片1min×2次；加200ul核固红染液，10s；把片子在自来水中冲洗10min；中性树脂封片。
半定量评分标准
a:用半定量计分法测定探针的染色强度水平和阳性细胞比率。染色强度评分为：0，无细胞染色；1，浅蓝色；2，中度蓝紫色；3，深蓝紫色。阳性细胞的比例评分如下：0，无阳性细胞；1，0-25％的阳性细胞；2，26-50％的阳性细胞；3，51-75％的阳性细胞；4，76-100％的阳性细胞。最终评分是用两个分数相乘计算出来的。所有评分由两名病理学专家通过双盲的方法独立决定。
b:最终评分的中位数(4分)被定义为临界值：最终评分≤4被定义为低新型lncrna表达，而最终评分>4被定义为：高新型lncrna表达
新型lncrna在鼻咽癌组织芯片中的ish典型染色图见图2。a.新型lncrna几乎为阴性表达，染色强度评分为0。b.新型lncrna弱表达，染色强度评分为1。c.新型lncrna中等表达，染色强度评分为2。d.新型lncrna高度表达，染色强度评分为3，放大倍数4×，比例尺＝400μm。放大倍数20×；比例尺＝100μm。
运用与新型lncrna互补的5‘-和3’-dig标记的寡核苷酸探针对130例鼻咽癌组织芯片进行了ish分析(图2a-d)。且显微镜下观察ish染色发现，新型lncrna主要定位于鼻咽癌细胞的胞浆。
实施例4：新型lncrna在鼻咽癌中的临床病理特征统计分析及单因素多因素分析
实验主要步骤
所有组织芯片经ish染色，病理专家评分后，运用统计分析运用spss18.0、graphpadprism7.0和microsoftexcel等软件。应用2×2χ2检验分析新型lncrna表达水平与鼻咽癌临床病理特征的关系。采用独立样本t检验和mann-whitneyu检验评价两组间的差异。根据cox比例风险回归模型进行单因素和多因素回归分析。所有数据均来自三个独立的实验，并表示为均数±sd或均数±sem。p值<0.05具有显著性。
表1.新型lncrna表达与鼻咽癌临床病理特征的关系
注：tnm分期，依据美国癌症联合委员会/国际抗癌联盟分期手册(第7版，2010年)；
*表示p<0.05。
根据ish半定量评分结果将130例鼻咽癌组织样本分为两组，66/130(50.8％)的鼻咽癌组织样本属于新型lncrna高表达组，其余64例(48.2％)属于新型lncrna低表达组。新型lncrna的表达与鼻咽癌的t分期(p＝0.003)、n分期(p＝0.004)、m分期(p<0.001)、临床分期(p＝0.003)、生存状态(p＝0.002)、复发(p＝0.033)显著相关。而新型lncrna的表达与患者年龄(p＝0.601)、性别(p＝0.179)、病理分型(p＝0.079)等临床病理特征无相关性(表3)
表2.单因素和多因素分析新型lncrna表达与鼻咽癌患者总生存率关系
注：tnm分期，根据美国癌症联合委员会/国际抗癌联盟分期手册(2010年第7版)；*p<0.05。
单因素生存分析显示：新型lncrna表达(p＝0.009)、t分期(p＝0.001)、n分期(p＝0.001)、m分期(p<0.001)和临床分期(p＝0.001)与鼻咽癌患者的总生存期密切相关(表4)。多因素生存分析显示：t分期(p＝0.022)和m分期(p<0.001)被认为是影响鼻咽癌患者总生存期的独立因素(表4)。
实施例5：
新型lncrna表达与鼻咽癌患者预后相关的生存分析研究：实验主要步骤
根据ish半定量评分结果，采用kaplan-meier生存分析绘制生存曲线，并进行对数秩和检验(log-ranktest)。
图3.新型lncrna表达与鼻咽癌患者预后相关的生存分析。a.总生存率和b.无病生存率的kaplan-meier曲线。p值采用log-rank检验。
采用kaplan-meier生存分析和log-rank检验，分析新型lncrna表达与鼻咽癌患者预后的关系。分析结果提示：新型lncrna高表达的鼻咽癌患者总生存期短(p＝0.0048)，无病生存时间短(p＝0.03)(图3a-b)
实施例6：
新型lncrna敲低表达研究：实验主要步骤：
sirna转染(脂质体转染)
使用invitrogen公司的lipofectimin3000转染试剂进行sirna(锐博生物科技公司设计合成)转染。转染前一天铺板，加入含适量细胞的悬液(用无抗生素完全培养基重悬)，“+字”摇晃培养板，使细胞均匀分布。过夜培养后使细胞密度在30-50％之间，进行脂质体转染
a.以6孔板为例，在1.5mlep管中将50pmol相应的sirna与125μlopti-mem(低血清培养基)混匀；在另一支1.5mlep管中，将5μllipofectimin3000与125μlopti-mem混匀(设置不同组调整lipofectimin3000和sirna的量以选择最佳转染条件)，室温静置5min；
b.将两管中的溶液轻轻混合，室温静置5-10min，等待复合物形成；在有或无血清/抗生素培养基(1750ul)培养的细胞中，直接加入250ul混合的转染复合物，凑成2ml转染体系。轻轻摇晃6孔板进行混匀，放进培养箱中继续培养；
c.转染8-12h后，显微镜下观察细胞状态，可以选择更换2ml新鲜的全培养基，继续培养24-72h后观察测定基因的敲低效率
图4.sirna转染和shrna慢病毒感染后，在cne1和5-8f细胞中验证敲低效率。a.用rt-qpcr检测cne1和5-8f细胞的基因敲除效率。b.建立稳定敲低新型lncrna的细胞系，经rt-qpcr证实。sh-1：稳定感染敲低新型lncrna的细胞系。sh-nc：稳定感染阴性对照慢病毒的细胞系。结果用2-δδct表示。*，p<0.05，**p<0.01。
首先确定了新型lncrna在6株鼻咽癌细胞系中的表达普遍高于np69细胞(人永生化鼻咽上皮细胞)。我们选择了两个新型lncrna表达较高的鼻咽癌细胞株-cne1和5-8f进行功能研究。设计并合成了三条针对新型lncrna的sirna序列，用来干扰新型lncrna的表达(图4a)。结果表明，si-1和si-3能有效地抑制新型lncrna的表达，其中si-1的干扰效果更佳，在两种细胞中的干扰效率均在65％左右。因此，我们根据si-1核心靶序列设计了一个的shrna慢病毒系统。然后，我们用sh-1慢病毒感染构建新型lncrna表达下调的稳转细胞株，并用rt-qpcr检测其表达(图4b)。
实施例7：
新型lncrna敲低表达与鼻咽癌细胞增殖关系研究：实验主要步骤
cck-8细胞增殖实验
a.为测定细胞增殖水平，使用了日本dojindo实验室的细胞计数试剂盒-8(cck-8)测定。
b.用完全培养基制成单细胞悬液，以每孔3×104个/ml的细胞密度接种于96孔板中，每孔加100μl细胞悬液，每组细胞设置5个平行孔，每组细胞同时都接种于4块96孔板(4块板分别标好0h、24h、48h、72h四个检测时间点)；
c.cck-8混合液的配制(现配现用，避光使用)：rpmi1640培养基：cck-8＝10:1，混合液总体积以每孔100μl计算；
d.培养6～8h待细胞贴壁后，弃培养基，然后每孔加入100μl提前配制的cck-8混合液，注意加入3个空白孔(只加入cck-8混合液，无细胞)；接着放入37℃，co2培养箱中培养0.5h，1h，1.5h，2h后，观察cck-8混合液的颜色(由红色变为橘色)，分别在紫外分光光度计上测定每个孔的吸光度值(λ＝450nm)，根据吸光度值和cck-8混合液颜色选择一个合适的孵育时间，cne1和5-8f的最佳孵育时间为2h；
e.以第一次加入cck-8混合液的时间计为0h，接着分别检测24h、48h、72每孔的吸光度值。
f.数据处理：实验组吸光度值＝吸光度值(实验组)－吸光度值(空白组)。以4个时间点为横坐标，不同实验组的吸光度值为纵坐标绘制细胞生长折线图。
edu细胞增殖实验
a.使用广州锐博生物科技公司的5-乙炔基-20-脱氧尿嘧啶(edu)试剂盒检测细胞增殖增殖时期(s期)水平。用荧光显微镜检测的方法，以96孔板为例，取对数生长期细胞，以每孔4×103～1×105个细胞接种于96孔板中，每组重复5孔，培养至正常生长阶段，后面根据试剂盒操作流程进行操作；
b.图像获取及数据处理：染色后立即进行观测，每组在荧光显微镜下测定5个视野，每个视野拍一个edu阳性细胞(红色荧光)的图片，拍一个hoechst细胞核(蓝色荧光)的图片，将两张图片融合取差值，最后数据以edu阳性细胞所占比率表示。
克隆形成实验
a.取生长状态良好的细胞，消化下来制成单个悬浮细胞，先将细胞密度稀释至5×103个/ml，然后取100μl细胞悬液接种于6孔板(每孔500个细胞)中，每组3个重复孔；
b.放于37℃，co2恒温培养箱中继续培养7-10天。当在显微镜下观察，单个克隆中细胞数目大于50个(肉眼可见克隆集落)，即可终止培养。弃去旧培养基，用冷pbs洗涤3次，4％多聚甲醛固定15min，0.1％结晶紫室温染色15min。pbs洗3次，自然干燥；
c.数据处理：相机拍照，计数克隆数。
图5.敲低新型lncrna抑制了cne1和5-8f细胞的增殖。a.cck-8细胞增殖实验测定的吸光度折线图。b.edu代表性的荧光显微镜照片和edu阳性细胞率的柱状图。放大倍数10×。比例尺＝100μm。c.平板克隆代表性的照片和克隆形成数的柱状图。*p<0.05，**p<0.01。
研究了敲低新型lncrna后鼻咽癌细胞系(cne1和5-8f)的增殖能力是否有变化。在cck-8细胞增殖实验中(图5a)，根据不同时间点的吸光度值(od)反映细胞数量和增殖水平，实验结果显示：与相应的同源对照细胞组(sh-nc)相比，新型lncrna敲低组(sh-1)的细胞表现出较低的细胞生长速度；根据edu细胞增殖实验(图5b)的荧光显微镜照片和edu阳性细胞率的柱状图得出，新型lncrna敲低组(sh-1)的edu阳性细胞比率明显更低于相应的同源对照细胞组(sh-nc)；平板克隆实验(图5c)显示：新型lncrna敲低组(sh-1)细胞形成的克隆数明显少于相应的同源对照细胞组(sh-nc)。
实施例8：
新型lncrna敲低表达与鼻咽癌细胞迁移研究：实验主要步骤：
伤口愈合实验
a.将细胞以较高的密度接种到6孔板中，“+”摇晃6孔板，使细胞分布均匀，培养24h后，使细胞密度达到90％以上；
b.弃掉旧培养基，在6孔板反面，每个孔用mark笔划三条横线横穿过孔作为标记，用无菌的100μltip头垂直得在cne1和5-8f细胞的上轻轻划3条竖痕，用pbs轻轻冲洗掉划痕上脱落的细胞；
c.以mark笔横线与竖划痕交叉处为观察点，每个孔9个观察点中选取5个随机的观察点，在0h和48h两个时间点于显微镜下观察及拍照；
d.数据处理：划痕愈合距离％＝(0h的划痕宽度-48h的划痕宽度)/0h的划痕宽度。
transwell细胞迁移实验
a.用rpmi1640培养基将细胞密度稀释成2×104个/ml，取100μl细胞悬液铺进24孔板上方的transwell小室(8-μm孔径，corning)中；在24孔板下室加入500μl含10％fbs的rpmi1640培养基，将上面的小室浸泡在底部的有血清的培养基中，将24孔板放入37℃，co2恒温培养箱，培养24～36h；
b.用镊子将小室取出，pbs轻轻洗3遍，并将小室倒扣在滤纸上吸尽多余pbs，用4％多聚甲醛固定细胞30min，接着用棉签轻轻擦去小室上部未迁移的细胞，以滤纸吸去多余液体；将小室放于0.1％结晶紫溶液中进行染色20min，pbs洗3次，这些操作过程中注意避免与小室底部发生摩擦小室的底部为迁移了的细胞；
c.将小室倒置在载物台的玻片上，观察并拍照；
d.数据处理：每个小室选取五个随机的视野进行拍照，计数迁移细胞数。
图6.敲低新型lncrna抑制了cne1和5-8f细胞的迁移。a.transwell迁移实验的代表性显微镜照片和迁移的细胞数的柱状图。放大倍数10×。比例尺＝100μm。b.伤口愈合试验的代表性显微镜照片和细胞迁移率(％)的柱状图。放大倍数10×。比例尺＝100μm。*，p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
transwell迁移实验(图6a)结果表明：新型lncrna敲低组(sh-1)的迁移细胞数明显少于相应的同源对照细胞组(sh-nc)；伤口愈合实验(图6b)结果显示：与相应的同源对照细胞(sh-nc)相比，新型lncrna敲低组(sh-1)的细胞迁移面积比率更低。
实施例9：
新型lncrna过表达研究：实验主要步骤
慢病毒感染：
1)感染预实验
a.为确定慢病毒感染的moi(moi＝(病毒滴度×病毒体积)/细胞数目)和最佳的感染条件，先应进行预实验。
b.接种细胞：用完全培养基制备密度约3-5×104个/ml的细胞悬液，取100ul/孔分为4组(control:空白对照组；m：常规培养基；a：常规培养基+a感染液；p：常规培养基+p感染液)，每组3个病毒滴度(moi＝10；50；100)，共12个孔分别加入96孔板中，继续培养24h。
c.用无血清培养基将慢病毒稀释为两种浓度(1×107tu/ml和1×108tu/ml)；吸掉各孔旧培养基，按照表2-8加入相应体积的溶液(a感染液：hitransga病毒感染试剂，即感染增强液，能显著提高病毒感染能力，细胞毒性极低，适合敏感细胞使用，储存浓度25×；p感染液:hitransgp病毒感染试剂，即感染增强液，能显著提高病毒感染能力，细胞毒性显著低于polybrene，储存浓度25×)，混匀，继续培养；
d.感染后8-12h显微镜下观察细胞形态，如发生变化则更换完全培养基，继续培养；
e.荧光表达丰度较高时(约感染72h)，用荧光显微镜观察，感染效率80％左右，且细胞生长状态良好的组所对应的moi和感染条件即可做为正式实验的最佳转染条件。
2)感染正实验
a.根据预实验结果确定最佳感染条件，cne1细胞最佳感染条件：moi＝50和p感染液；5-8f最佳感染条件：moi＝50和p感染液；
b.用完全培养基制备密度为3～5×104个/ml的细胞悬液，并根据表2-9接种相应体积的细胞到培养板中，培养过夜后使细胞密度大概为30～50％。
c.根据体积更换培养基并加入相应感染增强液，根据细胞所适合的moi及病毒滴度，加入相应的病毒量。37℃培养8～12h显微镜下观察细胞状态，更换培养基继续培养。接触了病毒的实验耗材放入废液瓶中(需实验结束后高温高压灭活病毒)。
d.感染48～72h后，观察荧光判断感染效率，或qpcr验证敲低效率。
3)筛选稳转细胞
a.感染48-72小时后，待细胞(cne1和5-8f)密度达80％～90％时，即可对细胞进行传代，接着用含有相应筛选抗生素(嘌呤霉素)的培养基来筛选细胞；
b.不同细胞对嘌呤霉素的敏感性不同，需要设置嘌呤霉素浓度梯度的实验组以确定最低有效筛选浓度。将待筛选的未转染的目的细胞株，接种在24孔板中，过夜培养后细胞密度达30％-50％为宜。第二天，弃掉旧培养基，洗2～3遍，加入含不同嘌呤霉素浓度的培养基(2.0μg/ml、2.5μg/ml、3.0μg/ml、3.5μg/ml、4.0μg/ml、4.5μg/ml和5μg/ml)，以培养4～5天90％以上细胞都死亡的药物浓度为筛选浓度；
选用预实验摸索出的cne1和5-8f的最佳筛选浓度(4μg/ml)筛选细胞两周。待细胞状态稳定，出现较少或没有死细胞时，使用维持浓度(为筛选浓度的1/3～1/2)的嘌呤霉素(2μg/ml)来维持培养已感染的细胞。构建稳转细胞株的过程中应及时冻存保种，以备后续实验的使用。
图7.转染过表达质粒后，在cne1和5-8f细胞中通过qrt-pcr检测验证过表达效率。oe：过表达新型lncrna的细胞株。vector：空载体dna质粒转染的细胞株。结果用2-δδct表示。***p<0.001。
为了证实新型lncrna过表达对鼻咽癌细胞增殖和迁移的影响，用gv146载体插入新型lncrna的全长序列进行过表达。首先，我们检测了这两种细胞系的过表达效率。结果表明，新型lncrna成功地过表达(图7)。
实施例10:新型lncrna过表达与鼻咽癌细胞增殖关系研究：
实验主要步骤:见实施例6
图8.过表达新型lncrna促进cne1和5-8f细胞增殖。a.cck-8细胞增殖实验测定oe和vector组的吸光度折线图。b.edu在oe和vector组的荧光显微镜照片和edu阳性细胞率的柱状图。放大倍数10×。比例尺＝100μm。c.平板克隆在oe和vector组的照片和克隆形成数的柱状图。*，p<0.05，**p<0.01。
我们采用了cck8实验(图8a)、edu实验(图8b)和平板克隆法(图8c)，都得出了与敲低新型lncrna相反的结果，即：过表达新型lncrna组(oe)的细胞比空载体转染组(vector)细胞具有更快的生长速度，更高的edu阳性细胞比率，更多的细胞克隆数。
实施例11：新型lncrna过表达与鼻咽癌细胞迁移关系研究：
实验主要步骤:见实施例7
a.transwell迁移实验oe和vector组的显微镜照片和迁移的细胞数的柱状图。放大倍数10×。比例尺＝100μm。b.伤口愈合试验oe和vector组的显微镜照片和细胞迁移面积比率(％)的柱状图。放大倍数10×。比例尺＝100μm。**p<0.01，***p<0.001。
transwell迁移实验显示：在cne1和5-8f细胞中，新型lncrna过表达组(oe)与空载体转染组(vector)相比，迁移细胞数目明显更多(图9a)。此外，伤口愈合实验显示：过表达新型lncrna组(oe)的细胞比转染空载体组(vector)细胞的迁移面积比率更高(图9b)。
实施例12：新型lncrna敲低表达裸鼠体内研究：
实验主要步骤：裸鼠皮下成瘤模型
a.通过中南大学实验动物部订购4周龄的balb/c裸鼠，并在屏障环境spf级别的条件下饲养。这项动物研究获得了中南大学动物伦理委员会的批准(项目识别码：2018sydw0111，批准日期：2018年4月12日)。
b.将裸鼠随机分为两组(n＝5只/组)，即sh-nc组和sh-1组，并做标记。待裸鼠在屏障环境内适应3～4天后，将慢病毒感染后的稳转株细胞5-8f(5×106个)悬浮于100μl无血清的rpmi1640培养液中，经皮下注射到裸鼠左(sh-1组)右(sh-nc组)前侧腋下。
c.皮下接种肿瘤细胞后，每周2次观察裸鼠生长情况及皮下肿瘤组织的形成情况，并用游标卡尺测量肿瘤组织的宽度(w)和长度(l)，按v＝1/2(l×w2)计算肿瘤体积。注射后3周，颈椎脱臼处死小鼠，并进行两组裸鼠大体拍照；分离肿瘤，肿瘤组织拍照并称量肿瘤的重量；
d.将肿瘤组织块剪成两部分，一部分放入液氮中保存，另一部分放入装有中性福尔马林的冻存管中。泡在中性福尔马林的组织块，接着进行石蜡包埋、he染色和免疫组织化学染色。
he染色和免疫组织化学染色(ihc)
1)苏木精—伊红染色法(hematoxylin-eosinstaining)，简称he染色法，苏木精染液为碱性，能使染色质及核酸染上紫蓝色；伊红为酸性染料，能使细胞质及细胞外基质染上红色。各种组织或细胞成分与病变的一般形态结构特点均可显示出来。根据索莱宝公司的h&e染色试剂盒进行脱蜡、水化、he染色、脱水透明和封片等操作。
2)免疫组织化学染色(ihc，注意：整个操作过程中避免干片)
a.烘片：实验进行前先将石蜡切片(置于切片架，不要叠片)放于65℃烘箱2h-6h，使切片上的石蜡融化且不易脱片；
b.脱蜡水化：待切片冷却置室温后，将切片置于切片架依次放于二甲苯中进行脱蜡，随后用梯度酒精将切片水化(二甲苯i/松节油i15min；二甲苯ii/松节油ii15min；100％酒精5min；95％酒精5min；80％酒精5min；75％酒精5min)。ddh2o摇床轻摇浸洗3min×3次；pbs摇床轻摇浸洗5min；
c.抗原修复：加热柠檬酸钠缓冲溶液(ph6.0)至沸腾后，将切片放入后继续加热(为避免水剧烈沸腾而引起切片脱落，沸腾后停止5分钟，需保持温度在95℃以上，继续加热5min，维持15-25min)。自然冷却至室温(约30min～1h)，ddh2o摇床轻摇浸洗3min×3次；pbs摇床轻摇浸洗5min；
d.去除组织中内源性过氧化氢酶(中杉金桥公司的ihc通用二步法检测试剂盒)：滴加过氧化氢酶阻断剂覆盖组织，室温静置10～20min；pbs摇床轻摇浸洗5min×3次；
e.封闭：用滤纸小心吸干组织周围的水滴，但勿碰触组织；滴入封闭液(山羊血清)覆盖组织，室温静置20min；
f.孵一抗：把羊血清甩干，或用滤纸吸去多余液体(但勿碰触组织，勿洗)，用1×pbs-t配制一定浓度的一抗(根据预实验选择合适的抗体浓度)，滴加50μl，使一抗覆盖组织，置于4℃冰箱湿盒中过夜。第二天拿出湿盒后室温放置30min，pbs摇床轻摇浸洗5min×3次；
g.滴入反应增强液覆盖组织，室温孵育5-20min(设置时间梯度选择最佳孵育时间)，pbs摇床轻摇浸洗5min×3次；
h.敷二抗：用滤纸吸去组织旁边的液体，滴加1滴增强酶标山羊抗小鼠/兔igg聚合物，均匀覆盖组织，室温放置20～30min，随后pbs摇床轻摇浸洗5min×3次；
i.加dab显色液一滴(a液：b液＝1:50)染色30s～5min(肉眼看出颜色即可)，或在显微镜下观察控制染色程度；自来水冲洗10min；
j.苏木精复染20s～1min；自来水冲洗10～20分钟；脱水、透明、封片、拍照。
图10.敲低新型lncrna可抑制裸鼠体内鼻咽癌的生长。a.将慢病毒感染构建的稳转细胞系接种于裸鼠皮下，sh-nc和sh-1组(n＝5)每周测量两次肿瘤体积。b.sh-nc和sh-1组的新鲜肿瘤组织照片。c.sh-nc和sh-1组的新鲜肿瘤重量。*p<0.05。
采用balb/c裸小鼠鼻咽癌裸鼠皮下成瘤模型，研究新型lncrna在体内鼻咽癌发生发展中的作用。首先，将慢病毒感染后的稳转株细胞5-8f(两组：sh-1和sh-nc)注射到裸鼠的右或左前侧腋下，每周测量两次肿瘤体积。与对照组相比，敲低新型lncrna的表达对肿瘤的生长有明显的抑制作用(图10a)。接种21天后，sh-1组肿瘤大小和质量明显小于对照组(sh-nc)(图10b-c)
图11.he和ihc染色显示敲低新型lncrna可抑制体内鼻咽癌的生长。a.he染色裸鼠肿瘤组织切片的组织形态学分析；放大倍数20×；比例尺＝100μm。b.ihc检测裸鼠肿瘤组织中ki-67的表达；放大倍数20×；比例尺＝100μm。两组裸鼠肿瘤组织中ki67阳性细胞率(％)的柱状图。c.ihc检测裸鼠肿瘤组织中cdk4的表达；放大倍数20×；比例尺＝100μm。两组裸鼠肿瘤组织中cdk4阳性细胞率(％)的柱状图**p<0.01。
he染色显微镜下可观察到：sh-nc组肿瘤细胞浸润皮肤附属物(图11a)，黑箭头所示)，而sh-1组未见肿瘤细胞浸润(图11a)。此外，我们用ki-67(增殖相关核抗原)免疫组织化学方法进一步研究了新型lncrna在体内对肿瘤细胞增殖的影响。实验结果进一步表明，sh-1组裸鼠肿瘤组织中的增殖细胞数(ki-67阳性比例)明显低于sh-nc组(图11b)，sh-1组裸鼠肿瘤组织中cdk4表达明显高于于sh-nc组(图11c)。
实施例13
新型lncrna与cdk4相互作用，通过激活cdk4/cdk6-cyclind1-rb-e2f1信号通路促进鼻咽癌细胞增殖。
实验主要步骤
rna结合蛋白免疫沉淀实验
a.使用millipore公司的magnariprna结合蛋白免疫沉淀试剂盒进行rip检测。rip实验可识别与特定细胞核或细胞结合蛋白相关的rna分子。
b.根据试剂盒操作流程简述如下：将2×107细胞用0.1ml完整rip裂解缓冲液(含rip裂解缓冲液、蛋白酶抑制剂和rnase抑制剂)裂解，于4℃、14，000rpm离心10min，上清液、磁珠和5μg目的抗体或阴性对照兔igg在4℃旋转孵育过夜。磁珠免疫复合物用预冷的rip洗涤缓冲液洗六次。然后，对rna进行纯化，并进行qrt-pcr。
c.数据处理：分别计算实验组与阴性对照组相对于“input”的表达量，计算公式：δct(实验组)＝ct(实验组)-[ct(input)-log2(input的稀释倍数)]；δct(阴性对照组)＝ct(阴性对照组)-[ct(input)-log2(input的稀释倍数)]；input的稀释倍数＝(input保留的体积/样品稀释后的总体积)-1，该实验input的稀释倍数为100；以2-δct(实验组)和2-δct(阴性对照组)代表实验组与阴性对照组相对于“input”的表达量；最后将阴性对照归一化。
免疫印迹实验
1)蛋白样品制备：
a.弃旧培养基，加入2ml预冷pbs，轻轻摇晃洗2遍；
b.6孔板加入200ul1×sds裂解液(内含20μllcocktail抑制剂和2ulpmsf)，冰上来回晃动6孔板，用枪头吹打使裂解液接触所有细胞，将裂解液转移至1.5mlep管中，冰上裂解15min；
c.置于沸水浴变性10min，4℃12,000rpm离心10min，离心后将上清转移至新的1.5mlep管中，-20℃保存备用或放置冰上等待上样。
2)免疫印迹相关溶液的配制
a.tris-甘氨酸电泳缓冲液(10×)：tris-base30.2g、甘氨酸188g、sds10g，用ddh2o定容至1000ml，室温保存，使用前稀释成1×。
b.转膜缓冲液(10×)：甘氨酸29g、tris-base58g、sds3.7g，加ddh2o至总体积为800ml，配制成储备液，室温保存，使用前将它稀释到1×，然后以4：1的体积比加入甲醇。
c.5×sds裂解液配方：
表55×sds裂解液
注：用ddh2o溶解，调节ph至7.0，室温保存。使用时，加ddh2o稀释成1×sds裂解液，加入cocktail抑制剂(10×)和pmsf蛋白酶抑制剂(100×)，用于裂解细胞。
d.常用不同浓度的sds-page凝胶配方：
表6sds-page凝胶
注：使用碧云天生物科技公司的sds-page凝胶试剂盒，aps粉末按说明用去离子水溶解后，分装保存于-20℃。此表为配一块sds-page凝胶的用量。
e.pbst：氯化钠80g、氯化钾2g、na2hpo4·12h2o35.8g、kh2po42.7g加1l去离子水溶解，调节ph约为7；加1ml吐温-20，混匀，室温储存。
f.封闭液(5％脱脂牛奶)：2.5g5％脱脂牛粉、50mlpbst。
3)sds-page电泳
a.灌胶与上样：用洗洁剂清洗玻璃板，自来水冲干净，再用ddh2o冲一遍，烘干冷却。配10％的分离胶，灌分离胶至短板边缘约1.5cm，并用ddh2o/无水乙醇封在分离胶上，当ddh2o和胶之间明显分界线时(约15-30min，温度越低凝得越慢)，可将ddh2o水/无水乙醇倒出，用干净滤纸将多余液体吸干。随后配5％的浓缩胶，灌浓缩胶至短板边缘，立即将梳齿平行向下插入浓缩胶中。待浓缩胶凝固后(约15min)，将胶板置于电泳槽中，加入适量的电泳缓冲液，小心将梳子平行向上拔出(注意不要损坏梳孔)，依次上样(使用10ultip上样)。
b.电泳：分离胶采用60-70v电压电泳，电泳20-30min左右，当样品进入分离胶时，电压调至100～120v，溴酚蓝指示的样品到达胶底部时即可停止电泳。
c.转膜：将pvdf膜放于甲醇中浸泡5～10min，在现配的含20％甲醇的转膜缓冲液中安装转膜的夹子：从负极(黑色板)到正极(透明板)依次为；两层滤纸→胶(已去除浓缩胶)→膜→两层滤纸(轻轻去除各层气泡)，装好电转移仪(注意正负极，将夹子的黑色面对应电转槽的黑色面)，加入现配的转膜缓冲液及冰盒，根据目的蛋白分子量的大小决定转膜时间的长短(目的蛋白分子量越大，转膜时间越长)。
d.封闭：将膜正面(与胶接触的那一面)朝上放入5％脱脂牛奶封闭液，室温摇床上封闭1～2h。
e.免疫反应：用pbst轻轻洗膜两次。根据说明书的合适抗体稀释比例稀释一抗，将膜正面平铺于孵育盒中，加入相应一抗，室温低速摇床上孵育3-4h或4℃过夜，第二天室温下低速摇30min；接着用pbst摇床上洗膜6min×4次。用pbst将二抗稀释至合适浓度，摇床上室温孵育1h，用pbst摇床上洗膜6min×4次。
f.化学发光显影：将等体积的ecl化学发光液a、b液(避光使用)混合于1.5mlep管中。将膜平放于发光板上，把发光液均匀滴加在膜表面，将膜放于显影仪中扫描，曝光时间一般为5s-2min。
g.将显影仪采集的图片在imagej软件中检测各蛋白条带的灰度值或光密度值，接着计算目的蛋白与内参的灰度值或光密度值之比，进行相对半定量分析。每种蛋白采用免疫印迹的方法检测三次。
图12.新型lncrna与cdk4相互作用并影响cdk4/cdk6，cyclind1，p-rb(ser780)，rb，e2f1表达。(a)在cne1和5-8f细胞中通过cdk4抗体对新型lncrna和cdk4之间的相互作用进行rip测定。通过qrt-pcr测定新型lncrna的水平，并通过“input”标准化。(b)通过rt-qpcr在sh-nc和sh-1细胞中测定cdk4的mrna表达。结果表示为log2(2-δδct)。数据表示为平均值±sd；n.s.表示p>0.05；t检验。(c)通过蛋白质印迹检测新型lncrna对cdk4/6，细胞周期蛋白d1，p-rb(ser780)，rb和e2f1的蛋白质表达水平的影响。gapdh和α-tublin作为内参。通过imagej量化条带强度。
然后，rip测定进一步证实了5-8f和cne1细胞中的新型lncrna/cdk4相互作用(图12a)。此外，我们敲低了新型lncrna的表达，以研究这样做是否会改变cdk4的mrna或蛋白水平。如结果所证明的，cdk4的mrna水平没有观察到显著变化(图12b)，但是在新型lncrna稳定敲低的cne1或5-8f细胞中，观察到cdk4蛋白水平的显著下调(图12c)。有趣的是，新型lncrna表达的敲低将影响cdk4/cdk6，cyclind1，p-rb(ser780)，rb，e2f1等蛋白的表达(图12c)。
表7：新型lncrna的引物和干扰序列列表
序列表
<110>中南大学湘雅医院
<120>一种新型lncrna及其抑制剂、诊断试剂、药物和应用
<160>11
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1487
<212>dna
<213>智人(homosapiens)
<400>1
ctttgactcggaaagggaactccctgaccccttgcgcttcccaggtgaggcaatgcctcg60
ccctgcttcggctcgtgcacagtgcatgcacccactggcctgcatccactgtctggcact120
ccctagtgagatgaacccggtacctcagatggaaatgcagaaatcacccgtcttctgcgt180
cgctcacgctgggagctgtagaccggagctgttcctattcggccatcttgggtctggatt240
cggcattacatgtcttaacggaaaaatcaactcaagatggattaaggacttaaacctaag300
acttgaaactataaaaattctagaagataacattggaaaaacccttctagacattgactt360
agataagtatttcatgaccaagaacccaaaagcaaatgcaataaaaacaaagataaataa420
ctaggacctaactgaactaagagcttttgtgcagcaaaaagaacagtcagcagagtaaac480
agacaacctacagagtgggagaaaatcttcacaatctatacatctgacaaaggactaata540
ttcagaatccacaacaaacacaaatcagtgaaaaaatcctatcaaaaagtgggctaagga600
cataaatagacaattctcaaaagaagatatacaaacgtccaataaacatgcaaaaaatgc660
tcaacatcactaatgatcagggaaatgcaaatcaaaaccacaatgtgatatcactttgct720
cctgcaagaatggccataatcaaaaaattgaaaaacagtagatgttggcgtgggtgtggt780
gataagggaacacttctacactgctggtgggaatgtaaactagtacagccactgtggaaa840
atggtgtggagattccttaaagaatgaaaagtagaactaccatttgatccagcaatccag900
ttactgggtatctacccagaggaaaataagtcattattagaaaaagataacttgcacaca960
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ataaaataaatgcacaccccaatcccatacaaaaaaaaaaaaaaaaa1487
<210>2
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
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<210>3
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
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<210>5
<211>19
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
ucuggauucggcauuacau19
<210>6
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<212>rna
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<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>11
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