用于细胞融合的淋巴细胞的制备方法

用于细胞融合的淋巴细胞的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于细胞融合的淋巴细胞的制备方法，包括如下步骤：麻醉并固定小鼠；在第0天，用抗原对小鼠的接近淋巴结的10个位点进行皮下注射，分别为颈背部的两个位点，腋窝、腹股沟、大腿和小腿的两侧并列位点，每个位点注射的抗原量为1.8~2.2μg；在第3天用抗原对小鼠的上述10个位点的相近位点进行皮下注射，每个位点注射的抗原量为0.8~1.2μg；在第7天用抗原对小鼠的后脚的两个足垫进行皮下注射，每个足垫注射的抗原量为19~21μg；在第12~14天，取小鼠的淋巴结制成单细胞悬液，得到用于细胞融合的淋巴细胞。这种用于细胞融合的淋巴细胞的制备方法，与传统的腹腔及皮下注射免疫的方法相比，免疫时间较短且较节省抗原。
【专利说明】用于细胞融合的淋巴细胞的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫学领域，特别是涉及一种用于细胞融合的淋巴细胞的制备方法。【背景技术】
[0002]单克隆抗体技术的基本原理是将分泌抗体但不能长期培养的B细胞与能在体外长期培养的骨髓瘤细胞进行杂交，筛选得到的杂交瘤细胞既能分泌抗体又有骨髓瘤细胞无限增殖的特性，由一个杂交瘤细胞繁殖、分泌的抗体称为单克隆抗体，它只针对一个抗原表位。细胞融合的B细胞是从抗原免疫的动物的脾脏或淋巴结中分离出来的，免疫后的脾脏和淋巴结中含有大量分泌高亲和力和高特异性抗体的B细胞。选择合适的动物免疫方案是获得高质量的McAb的首要前提。一般根据抗原性质，免疫原性和小鼠的免疫反应性决定注射途径，免疫次数，间隔时间和持续时间。
[0003]传统的用于细胞融合的淋巴细胞的多采用腹腔及皮下注射免疫的方法制备，制备时采用的抗原包括颗粒性抗原和可溶性抗原。
[0004]颗粒性抗原免疫原性强，如肿瘤细胞、淋巴细胞、细菌等可作为抗原，不加佐剂直接进行免疫，就可获得较好的免疫效果。以细胞性抗原为例，第一次腹腔或尾静脉注射I X 1(TI X IO7细胞/鼠，间隔2~3周重复注射f 2次，融合前3d用同样剂量腹腔或静脉注射加强免疫一次。
[0005]可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，如系半抗原,应先制备成人工免疫原，再加佐剂。蛋白质、荚膜多糖、病毒、立克次体以及与蛋白质结合的半抗原等均可采用可溶性抗原的方法免疫。一般取5(T100yg抗原与等量完全弗氏佐剂(CFA)充分乳化后腹腔或背部皮下多点注射，以后每间隔2周以同样剂量抗原加等量不完全弗氏佐剂腹腔或皮下注射，共3飞次，一般在融合前3d腹腔或静脉注射无佐剂抗原50-100 μ g加强免疫。这是目前最常用的免疫方式。
[0006]然而，腹腔及皮下注射免疫的方法制备用于细胞融合的淋巴细胞，免疫周期较长，至少需要4次以上的免疫后才能进行细胞融合，免疫时间至少需2个月以上；同时对抗原的需求量大，一般需100-200μ g/次/鼠，这大大地增加了单克隆抗体制备的成本，特别是对价格昂贵的抗原。

【发明内容】

[0007]基于此，有必要提供一种免疫时间较短且较节省抗原的用于细胞融合的淋巴细胞的制备方法。
[0008]一种用于细胞融合的淋巴细胞的制备方法，用于单克隆抗体制备，包括如下步骤:
[0009]步骤一、麻醉并固定小鼠；
[0010]步骤 二、在第O天，用抗原对步骤一得到的小鼠的接近淋巴结的10个位点分别进行皮下注射，所述10个位点分别为颈背部的两个位点，腋窝、腹股沟、大腿和小腿的两侧并列位点，每个位点注射的抗原量为1.8^2.2 μ g ;
[0011]步骤三、在第3天用所述抗原对步骤二得到的小鼠的所述10个位点的相近位点分别进行皮下注射，每个位点注射的抗原 量为0.8^1.2 μ g ;
[0012]步骤四、在第7天用所述抗原对步骤三得到的小鼠的后脚的两个足垫分别进行皮下注射，每个足垫注射的抗原量为1扩21 μ g ；
[0013]步骤五、在第12~14天，取步骤四得到的小鼠的淋巴结进行研磨，制成单细胞悬液，得到所述用于细胞融合的淋巴细胞。
[0014]在一个实施例中，所述抗原为颗粒性抗原。
[0015]在一个实施例中，所述抗原为用弗氏完全佐剂乳化的可溶性抗原。
[0016]在一个实施例中，步骤一中，所述小鼠为6~8周龄的雌性BALB/C小鼠。
[0017]在一个实施例中，步骤一中，所述麻醉小鼠的操作具体为用苯巴比妥钠对所述小鼠进行腹腔注射，剂量为100mg/kg。
[0018]在一个实施例中，步骤五中，所述淋巴结为两侧腋窝淋巴结、前腿淋巴结、腹股沟淋巴结和后腿胭淋巴结中的至少一个。
[0019]在一个实施例中，步骤五中，还包括检测小鼠血清效价在1:3200以上的操作。
[0020]这种用于细胞融合的淋巴细胞的制备方法，具有免疫速度快的优点，12~14天即可完成免疫；同时需要的抗原量少，总共仅需70μ g/鼠。与传统的腹腔及皮下注射免疫的方法相比，这种用于细胞融合的淋巴细胞的制备方法免疫时间较短且较节省抗原，从而有效地降低单克隆抗体制备的时间和成本。
【专利附图】

【附图说明】
[0021]图1为一实施方式的用于细胞融合的淋巴细胞的制备方法；
[0022]图2为小鼠的接近淋巴结的10个位点的示意图；
[0023]图3为用于研磨制成单细胞悬液并用于细胞融合的小鼠的淋巴结的示意图。【具体实施方式】
[0024]为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的【具体实施方式】做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
[0025]一实施方式的用于细胞融合的淋巴细胞的制备方法，如图1所示，步骤如下。
[0026]一种用于细胞融合的淋巴细胞的制备方法，用于单克隆抗体制备，包括如下步骤:
[0027]S10、麻醉并固定小鼠。
[0028]小鼠可以为6~8周龄的雌性BALB/C小鼠。
[0029]麻醉剂可以为苯巴比妥钠，腹腔注射的剂量为100mg/kg。
[0030]S20、在第O天，用抗原对SlO得到的小鼠的接近淋巴结的10个位点分别进行皮下注射，10个位点具体为颈背部的两个位点，腋窝、腹股沟、大腿和小腿的两侧并列位点，每个位点注射的抗原量为1.8^2.2 μ g。[0031]抗原可以为颗粒性抗原，也可以可溶性抗原。
[0032]颗粒性抗原可以直接使用，可溶性抗原需要用弗氏完全佐剂乳化。
[0033]用弗氏完全佐剂乳化的可溶性抗原中。
[0034]弗氏完全佐剂与可溶性抗原的比例范围可以较宽，只要能够将可溶性抗原完全乳化即可。可以使得弗氏完全佐剂与可溶性抗原的体积比为1:1。
[0035]如图2所示，S20中用抗原对小鼠进行注射的10个接近淋巴结的位点分别为颈背部的两个位点，腋窝、腹股沟、大腿和小腿的两侧并列位点。
[0036]在优选的实施方式中，每个位点注射的抗原量为2 μ g。
[0037]S30、在第3天用抗原对S20得到的小鼠的上述10个位点的相近位点分别进行皮下注射，每个位点注射的抗原量为0.8^1.2 μ g。
[0038]抗原为步骤SlO采用的抗原。
[0039]在优选的实施方式中，每个位点注射的抗原量为I μ go
[0040]S40、在第7天用抗原对S30得到的小鼠的后脚的两个足垫分别进行皮下注射，每个足垫注射的抗原量为1^21 μ g。
[0041]在优选的实施方式中，每个足垫注射的抗原量为20 μ g。
[0042]抗原为步骤S 10采用的抗原。
[0043]S50、在第12~14天，取S40得到的小鼠的淋巴结进行研磨，制成单细胞悬液，得到用于细胞融合的淋巴细胞。
[0044]如图3所示，所述小鼠的淋巴结，具体为小鼠的两侧腋窝淋巴结、前腿淋巴结、腹股沟淋巴结和后腿胭淋巴结中的至少一个。
[0045]S50中还包括在取小鼠淋巴结进行研磨之前，检测小鼠血清效价在1:3200以上的操作。
[0046]这种用于细胞融合的淋巴细胞的制备方法，具有免疫速度快的优点，12~14天即可完成免疫；同时需要的抗原量少，总共仅需70μ g/鼠。与传统的腹腔及皮下注射免疫的方法相比，这种用于细胞融合的淋巴细胞的制备方法免疫时间较短且较节省抗原，从而有效地降低单克隆抗体制备的时间和成本。
[0047]具体实施例。
[0048]实施例1
[0049]用于细胞融合的淋巴细胞的制备。本实施例中采用牛血清白蛋白BSA作为抗原，弗氏完全佐剂购自sigma公司，货号为F5881，规格为10ml，雌性BALB/C小鼠购自广东省医学实验动物中心。
[0050]取7周龄的雌性BALB/C小鼠5只，腹腔注射苯巴比妥钠100mg/kg，进行麻醉，然后对小鼠进行固定。
[0051]在第O天，用弗氏完全佐剂乳化可溶性抗原，抗原和弗氏完全佐剂1:1混合，在小鼠的10个最接近淋巴结的位点分别进行注射，十个位点分别为颈背部的两个位点，腋窝、腹股沟、大腿和小腿的两侧并列位点，每个位点注射的抗原量为2 μ g。
[0052]在第3天进行加强免疫，仍用弗氏完全佐剂乳化可溶性抗原，抗原和弗氏完全佐剂1:1混合，在上述10个位点的相近位点分别进行皮下注射，每个位点注射的抗原量为I μ go[0053]在第7天，用弗氏完全佐剂乳化可溶性抗原，抗原和弗氏完全佐剂1:1混合，注射小鼠的后脚的两个足垫，每个足垫注射的抗原量为20μ g。
[0054]在第12~14天，检测血清效价，效价达1:3200以上，取两侧腋窝淋巴结、前腿淋巴结、腹股沟淋巴结和后腿胭淋巴结进行研磨，制成单细胞悬液，得到7X IO6IX IO7个淋巴细胞进行融合。免疫后的淋巴结肿大明显，米粒大小，颜色白色透明，质地松软。
[0055]实施例2
[0056]实施例1中第12天得到的小鼠的血清效价检测。
[0057]分别对实施例1中第12天的5只小鼠尾部采血分离血清，间接ELISA检测结果显示小鼠的血清特异性抗体的效价。
[0058]间接ELISA实验:
[0059]将待测血清稀释了7 个梯度，分别为 1:200,1:400，1:800，I =1600,1 =3200,1:6400，1:12800o
[0060]BSA 用 0.05mM pH 9.6 碳酸盐缓冲液稀释至 100ng/mL，100 μ L/ 孔，37°C包被 3h ；PBS-T洗板3次，每次3min ；5%的脱脂奶粉，200 μ L/孔37°C封闭Ih ；PBS-T洗涤3次，3min/次；分别加稀释了七个梯度的待测血清和阴性对照血清，设计空白对照，37°C孵育1.5h ；PBS-T洗涤3次，3min/次；加HRP标记羊抗鼠IgG抗体，37°C孵育Ih ;PBS_T洗涤5次，3min/次；加TMB底物显色，37°C反应10min ；2M H2S0450 μ L/孔终止反应，15min内在酶标仪上用波长450nm测量A值。
[0061]间接ELISA检测结果显示5只小鼠的血清特异性抗体的效价分别为1:3200、1:3200、1:3200,1:6400 和 1:6400。
[0062]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【权利要求】
1.一种用于细胞融合的淋巴细胞的制备方法，用于单克隆抗体制备，其特征在于，包括如下步骤:步骤一、麻醉并固定小鼠；步骤二、在第O天，用抗原对步骤一得到的小鼠的接近淋巴结的10个位点分别进行皮下注射，所述10个位点分别为颈背部的两个位点，腋窝、腹股沟、大腿和小腿的两侧并列位点，每个位点注射的抗原量为1.8~2.2 μ g ；步骤三、在第3天用所述抗原对步骤二得到的小鼠的所述10个位点的相近位点分别进行皮下注射，每个位点注射的抗原量为0.8~1.2 μ g ;步骤四、在第7天用所述抗原对步骤三得到的小鼠的后脚的两个足垫分别进行皮下注射，每个足垫注射的抗原量为19~21 μ g ；步骤五、在第12~14天，取步骤四得到的小鼠的淋巴结进行研磨，制成单细胞悬液，得到所述用于细胞融合的淋巴细胞。
2.根据权利要求1所述的用于细胞融合的淋巴细胞的制备方法，其特征在于，所述抗原为颗粒性抗原。
3.根据权利要求1所述的用于细胞融合的淋巴细胞的制备方法，其特征在于，所述抗原为用弗氏完全佐剂乳化的可溶性抗原。
4.根据权利要求1所述的用于细胞融合的淋巴细胞的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述小鼠为61周龄的雌性BALB/C小鼠。
5.根据权利要求1所述的用于细胞融合的淋巴细胞的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述麻醉小鼠的操作具体为用苯巴比妥钠对所述小鼠进行腹腔注射，剂量为100mg/kg。
6.根据权利要求1所述的用于细胞融合的淋巴细胞的制备方法，其特征在于，步骤五中，所述淋巴结为两侧腋窝淋巴结、前腿淋巴结、腹股沟淋巴结和后腿胭淋巴结中的至少一个。
7.根据权利要求1所述的用于细胞融合的淋巴细胞的制备方法，其特征在于，步骤五中，还包括检测小鼠血清效价在1:3200以上的操作。
【文档编号】C12N5/0781GK103898052SQ201210568253
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月24日 优先权日:2012年12月24日
【发明者】万晓春, 王彩霞, 王宏 申请人:深圳先进技术研究院