一种鲟鱼外周血淋巴细胞的分离方法与流程

本发明涉及细胞的分离方法，具体涉及一种鲟鱼外周血淋巴细胞的分离方法。

背景技术：

淋巴细胞参与特异性免疫反应，在免疫应答中起主要作用。鱼类的淋巴细胞是白细胞中数量最多的一类，通常占白细胞总量的90％左右，其个体小，含有较大的细胞核。与哺乳动物类似，鱼类淋巴细胞包括t淋巴细胞和b淋巴细胞两种，其中，t淋巴细胞主要介导细胞免疫并在免疫应答中起调节作用，而b淋巴细胞在体液免疫中参与抗体的合成。对淋巴细胞功能及活化机制等方面的研究一直是免疫学研究的热点，而制备高活性和高纯度的淋巴细胞是进行这些研究的先决条件。

密度梯度离心法是利用不同细胞沉降系数有差异的原理，使细胞在一定离心力作用下以各自的速度沉降，从而形成区带，使得不同类型的细胞得以分离和纯化。淋巴细胞分离液是基于密度梯度离心原理设计的淋巴细胞分离试剂，利用淋巴细胞分离液能够获得高纯度的淋巴细胞。但是分离不同种属外周血中的淋巴细胞要求使用不同质量浓度的分离液。

根据文献报道，针对鲟鱼的淋巴细胞分离液及淋巴细胞分离方法尚未建立。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种鲟鱼外周血淋巴细胞的分离方法。

本发明提供的鲟鱼外周血淋巴细胞的分离方法包括如下步骤：将鲟鱼外周血加入淋巴细胞分离液中，离心，离心管内液体出现分层，由上至下分别为血浆层、淋巴细胞富集层、淋巴细胞分离液层和红细胞堆积层；收集所述淋巴细胞富集层，得到鲟鱼外周血淋巴细胞；

所述淋巴细胞分离液的制备方法如下：将percoll原液与质量分数为8.5％的nacl水溶液按照体积比为9:1的比例混匀，得到100％percoll液，再将所述质量分数为0.85％的nacl水溶液与所述100％percoll液按照体积比为3:7的比例混匀，得到淋巴细胞分离液。

上述方法中，所述鲟鱼外周血与所述淋巴细胞分离液的体积比为2:1。所述鲟鱼外周血为抗凝鲟鱼外周血，所述抗凝鲟鱼外周血是将鲟鱼外周血与抗凝剂混匀得到的，所述抗凝鲟鱼外周血中的鲟鱼外周血与抗凝剂的体积比为1:1，所述抗凝剂具体为肝素钠溶液。

上述方法中，所述收集淋巴细胞富集层的方法为用移液器逐层吸取。具体方法如下：使用移液器吸取最上层的血浆层，弃血浆层，然后吸取淋巴细胞富集层。

上述方法中，所述离心的条件为500g离心40min。

上述方法中，所述鲟鱼为小体鲟。

本发明的另一个目的是提供上述方法的新用途。

本发明提供了上述方法在提高鲟鱼外周血淋巴细胞的回收率中的应用。

本发明还提供了上述方法在提高鲟鱼外周血淋巴细胞的存活率中的应用。

本发明还有一个目的是提供上述淋巴细胞分离液。

上述淋巴细胞分离液在鲟鱼外周血淋巴细胞的分离中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的最后一个目的是提供一种分离鲟鱼外周血淋巴细胞的产品。

本发明提供的分离鲟鱼外周血淋巴细胞的产品其包括上述淋巴细胞分离液。

本发明的方法包括如下步骤：将鲟鱼外周血加入淋巴细胞分离液中，离心，离心管内液体出现分层，由上至下分别为血浆层、淋巴细胞富集层、淋巴细胞分离液层和红细胞堆积层；收集所述淋巴细胞富集层，得到鲟鱼外周血淋巴细胞；所述淋巴细胞分离液的浓度为1.092g/ml。本发明的方法具有操作简便、回收率高和淋巴细胞存活率高的特点。

附图说明

图1为不同比重淋巴细胞分离液分离鲟鱼淋巴细胞的效果对比图。

图2为淋巴细胞分离液分离鲟鱼淋巴细胞结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的全部试剂均需进行灭菌处理，试剂混合需在无菌操作环境下进行。

下述实施例中的percoll原液购自宝如亿(北京)生物技术有限公司，货号为ge17-0891-01。

下述实施例中的肝素钠溶液由溶质和溶剂组成，溶剂为质量分数为0.85％的nacl水溶液，溶质为肝素钠，肝素钠的质量分数为1％。

下述实施例中的浓度为1.075g/ml、1.080g/ml、1.086g/ml和1.092g/ml的淋巴细胞分离液中的浓度是指实际密度。

实施例1、一种鲟鱼外周血淋巴细胞的分离方法

一、不同比重的percoll工作液的配制

配制不同比重的percoll工作液，并置于无菌尖头离心管中。具体步骤如下：

(1)55％的percoll工作液(浓度为1.075g/ml的淋巴细胞分离液)

55％的percoll工作液的具体配制方法如下：将percoll原液(percoll原液的密度为1.131g/ml)与质量分数为8.5％的nacl水溶液(质量分数为8.5％的nacl水溶液的密度为1.099g/ml)按照体积比为9:1的比例混匀，配制成100％percoll液，再将质量分数为0.85％的nacl水溶液(质量分数为0.85％的nacl水溶液的密度为1.0099g/ml)与100％percoll液按照体积比为9:11的比例混匀，配制成55％的percoll工作液。

(2)60％的percoll工作液(浓度为1.080g/ml的淋巴细胞分离液)

60％的percoll工作液的具体配制方法如下：将percoll原液与质量分数为8.5％的nacl水溶液按照体积比为9:1的比例混匀，配制成100％percoll液，再将质量分数为0.85％的nacl水溶液与100％percoll液按照体积比为4:6的比例混匀，配制成60％的percoll工作液。

(3)65％的percoll工作液(浓度为1.086g/ml的淋巴细胞分离液)

65％的percoll工作液的具体配制方法如下：将percoll原液与质量分数为8.5％的nacl水溶液按照体积比为9:1的比例混匀，配制成100％percoll液，再将质量分数为0.85％的nacl水溶液与100％percoll液按照体积比为7:13的比例混匀，配制成65％的percoll工作液。

(4)70％的percoll工作液(浓度为1.092g/ml的淋巴细胞分离液)

70％的percoll工作液的具体配制方法如下：将percoll原液与质量分数为8.5％的nacl水溶液按照体积比为9:1的比例混匀，配制成100％percoll液，再将质量分数为0.85％的nacl水溶液与100％percoll液按照体积比为3:7的比例混匀，配制成70％的percoll工作液。

二、鲟鱼外周血淋巴细胞的分离

1、实验材料

以3尾小体鲟外周血为实验材料，外周血均为抗凝外周血，抗凝外周血中小体鲟外周血和抗凝剂(肝素钠水溶液)的体积比为1:1。

2、外周血淋巴细胞的分离

将1.2ml抗凝外周血沿管壁分别缓慢加入到含有0.6ml不同比重(55％、60％、65％和70％)的percoll工作液的无菌尖头离心管中，拧紧离心管盖，使用水平转子(eppendorf5804r台式高速冷冻离心机，a-4-44水平转子)500g离心40min。

水平离心后观察发现，离心管内液体明显分为4层(图1和图2)，由上至下依次如下：最上层略偏黄色的血浆层、第2层灰白呈膜状的淋巴细胞富集层、第3层无色透明的淋巴细胞分离液层以及最下层红色的红细胞堆积层。

2、外周血淋巴细胞的收集

使用移液器吸取最上层的血浆层，弃血浆层，然后吸取淋巴细胞富集层。

3、淋巴细胞回收率的统计

利用血球计数板对淋巴细胞富集层中的淋巴细胞进行计数，并计算淋巴细胞回收率。淋巴细胞回收率＝从外周血中回收的淋巴细胞数量/同体积外周血中淋巴细胞数量×100％，即表1中的分离的淋巴细胞数量与血液中淋巴细胞数量的比值。

结果如表1所示。从表1中结果可知，70％的percoll工作液，即浓度为1.092g/ml的淋巴细胞分离液，可以从鲟鱼外周血中分离出较多的淋巴细胞，平均回收率为89.62+8.08％。

表1、不同密度淋巴细胞分离液的分离效果

4、淋巴细胞存活率的统计

台盼蓝拒染法检测淋巴细胞存活率。具体步骤如下：将淋巴细胞液(步骤2中吸取的淋巴细胞富集层)与0.4％台盼蓝染液(碧云天，货号c0011)按照体积比1:1混匀，在3-5min内使用血球计数板进行计数，被染成蓝色的是死细胞，无色的为活细胞，并计算回收后的淋巴细胞的存活率。

结果表明：回收后的淋巴细胞存活率均大于99％。