专利名称：黄鳝芳香化酶保守区的原核表达载体pMAL-Arom19及其构建方法和应用方法
技术领域：
本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种高效表达黄鳝芳香化酶保守区蛋白(Aroml9)的原核表达载体pMAL_Aroml9及其构建方法，以及在Aroml9保守区蛋白的原核表达和制备抗Aroml9多克隆抗体中的应用，及其具体应用方法。
背景技术：
芳香化酶(Aromatase 19，Aroml9)是类固醇激素代谢中的一种重要酶类，属于细胞色素P450家族中的一员，广泛存在于大多数脊椎动物的脑和垂体中，它可催化某些雄激素转化为雌激素，是雌激素生物合成中的关键酶和限速酶。研究表明，芳香化酶可以影响哺乳动物中枢神经系统的功能和发育，调节神经内分泌和繁殖功能以及性行为，并参与非哺乳动物性腺分化的调控，很多实验已证实芳香化酶可控制多种鱼类的性别分化和性别转 化。迄今为止，已从虹鳟、鲫、斑马鱼、日本鳗鲡等淡水硬骨鱼和牙鲆、欧洲舌齿鲈等海水硬骨鱼类的卵巢中克隆出性腺芳香化酶基因，甚至软骨鱼类大西洋中的芳香化酶基因也被克隆。此外，在金鱼、斑马鱼、虹鳟等鱼类中已克隆出芳香化酶基因的第二种形式一脑芳香化酶，舌齿鲈脑中较低的芳香化酶活性也暗示着在这种鱼可能也存在着芳香化酶的第二种基因形式。Andersen与Riley等研究了抗虹鳟Aroml9的免疫接种,提出了一种有望控制鱼类性成熟的方法，认为免疫抑制技术在控制虹鳟生殖方面有一定的应用潜力。黄鳝(Monopterus albus),俗称鳝鱼,属于硬骨鱼纲、合觸目、合觸科、黄鳝属，广泛存在于亚洲地区，中国仅产I种。其体型细，形状似蛇或鳗，营养价值极高。在黄鳝的生活史中存在着特殊的生殖发育现象——自然性逆转。研究表明，第一次性成熟发育周期内黄鳝为雌性发育，雌性性成熟产卵后，生殖腺内卵细胞败育，卵巢结构逐步退化，同时雄性生殖细胞开始发育，通过雌雄间性阶段过渡到雄性发育。黄鳝性逆转在基因水平上的调控以及性别决定基因一直是研究者们关注的热点，而性别决定又是一个涉及进化时空的多基因活动的复杂调控过程。因此对性激素具有调节作用的芳香化酶研究具有一定的生产意义。高效表达芳香化酶基因的重组载体的制备可以高效获取重组蛋白，可以满足其在鱼类人工繁殖中的运用，同时制备的抗体在现有研究中还未见有报道。
发明内容
发明目的本发明的目的是提供一种Aroml9的原核表达载体pMAL- Aroml9,该载体含有T7启动子和终止子、细菌核糖体结合位点RBS和Aroml9基因保守区序列及一个麦芽糖结合蛋白标签；利用该载体转化大肠杆菌，可实现Aroml9蛋白的高水平表达，表达的重组蛋白质以可溶性形式存在于上清中(占大肠杆菌可溶性总蛋白43. 8%)，通过亲和层析纯化很容易获得高纯度的重组蛋白质，用于蛋白质的制备。纯化Aroml9蛋白的操作相当简单，成本也不高，极易重复使用。技术方案为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案
本发明提供一种黄鳝芳香化酶保守区的原核表达载体pMAL_Aroml9，该载体由表达载体pMAL-c2x构建而得，含有T7启动子和终止子、细菌核糖体结合位点PBS、Aroml9基因保守区序列及一个麦芽糖结合蛋白标签序列。作为本发明一种方案，所述载体中的Aroml9来源于黄鳝。进一步说明所述原核表达载体pMAL-Aroml9,其特征在于所述Aroml9基因的上游有T7启动子和细菌核糖体结合位点RBS，T7启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列，紧靠Aroml9基因的起始密码子上游还有一个麦芽糖结合蛋白标签序列。本发明还提供所述的原核表达载体pMAL_Aroml9的构建方法,包括如下步骤(I)从GenBank中查找黄鳝Aroml9的全长基因序列，并米用Primer5. O设ii 对特异性引物上游引物I: 5’- CAGTGTGTGTTGGAGATGGTGA-3'下游引物2: 5’- TTCATCATCACCATGGCAATGT -3'以提取自黄鳝的脑总RNA为模板进行反转录合成第一链cDNA，以反转录产物为模板及合成的上下游引物进行PCR扩增，反应条件为94 °C预变性3min，94 °C变性30s，58 °C退火 45s, 72°C延伸 lmin, 30 个循环，72°C延伸 7min ；(2) PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后用凝胶回收试剂盒回收，将回收产物与pMD18-T载体，16 °C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌JM109，随机挑取细菌，提取质粒后用EcoR I、Hind III双酶切初步鉴定后，将阳性克隆进行DNA测序，测序结果用生物软件DNAstar、CLUSTAL X 等进行分析；(3)将阳性质粒和原核表达质粒pMAL-C2X分别用EcoR I、Hind III 37°C双酶切，用凝胶回收试剂盒回收Aroml9片段和线性化pMAL质粒,按照T4 DNA连接酶的说明书设计连接反应体系，构建表达质粒pMAL-Aroml9，并转化大肠杆菌JM109，筛选阳性克隆，随机挑取1-2个克隆进行酶切鉴定，获得黄鳝芳香化酶保守区的原核表达载体pMAL-Aroml9。本发明还提供所述的原核表达载体pMAL-Aroml9在制备Aroml9抗体的抗原中的应用。本发明同时提供所述的原核表达载体pMAL-Aroml9在制备Aroml9重组蛋白中的应用，其具体应用方法如下(I)将pMAL_Aroml9转化大肠杆菌TBl,挑取阳性克隆接种含50 μ g/mL的氨节青霉素的LB液体培养基中，37°C摇振培养过夜；(2)取培养菌液以1/10的比例接种于新鲜的含氨苄青霉素的LB液体培养基中，分别以O. 5、lmol/L浓度的IPTG诱导，37°C摇振培养4h后，收集菌体，加入溶菌酶至终浓度为lmg/mL,冰浴 30min ；(3)加入DNA酶和RNA酶至终浓度为5 μ g/mL, 4°C孵育10 min ;所得产物9000g离心30 min，将上清转移备用，上清即为表达的融合蛋白；(4)将上清蛋白质上样于平衡缓冲液平衡好的Amylose_sepharoml9se亲和柱中，其中所述平衡缓冲液为 20mmol/LTris-HCL, 200mmol/LNaCl, lmmol/LEDTA, pH7. 4 ；(5)用缓冲液平衡至基线后，开始用洗脱缓冲液，所述洗脱缓冲液为平衡缓冲液，再加lOmmol/L麦芽糖，洗脱液中即为纯化后的融合蛋白；(6 )最后SDS-PAGE电泳检测；在纯化好的蛋白中加入Factor Xa至终浓度为200 μ g/mL,室温作用4h,同上过Amylose- sepharomse亲和柱,用平衡缓冲液洗脱下的即为Aroml9蛋白。有益效果与现有技术相比，本发明具有如下有益效果I、本发明构建的黄鳝Aroml9基因保守区片段的原核表达载体能高效的表达目的蛋白，并满足相关实验的需要。2、用重组蛋白免疫小鼠制备的多克隆抗血清具有较高的效价，特异性也较好；该抗体能特异性的与黄鳝Aroml9保守区蛋白反应,具有较高的抗体效价。 3、本发明中Aroml9蛋白高效价抗体的成功制备表明Aroml9保守区蛋白具有较强的免疫原性，能够刺激机体产生免疫应答，为调控黄鳝性逆转的研究提供了一个新的方法。
图I Aroml9基因的TA克隆策略；图 2 黄鳝 Aroml9 基因的检测，M: DNAmarker; I: Product of RT-PCR ;图3 重组质粒pMD18-T-Aroml9的限制性酶切分析，M:DNA分子量标记I :pMD18-T-Aroml9 经 EcoRI 和 Hind III双酶切；图4鉴定大肠杆菌中Aroml9融合蛋白的SDS-PAGE分析,M:蛋白质分子量标记；I: TBl/pMAL-Aroml9 经 O. 3M IPTG 诱导 4h 后表达的 MBP_Aroml9 蛋白；2: TBl/pMAL 经 O. 3MIPTG诱导4h后产生的MBP蛋白；3: E. coli TBl。
具体实施例方式试剂与仪器设备试剂主要为分子生物学试剂，TaqDNA聚合酶、T4 DNA连接酶、AMV反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、EcoR I、Hind III等为大连宝生物公司产品；聚丙烯酰胺、RNase抑制剂等购自上海生工生物工程公司；Factor Xa、Amylose-sepharomrose柱、抗麦芽糖结合蛋白(MBP)单抗均购自纽英伦生物技术(北京)公司；其他生化试剂均为国产分析纯。弗氏完全、不完全佐剂，ELISA反应板等均购自上海申能博彩生物有限公司。仪器PCR仪购自BioRad公司，实验结果记录和蛋白分析使用的是柯达公司的凝胶成像系统，DNA序列分析使用DNAstar软件，全自动测序工作由上海生工生物工程公司完成，酶标测定仪购自TECAN公司。所有引物和DNA序列均在上海生工生物工程公司合成。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例I Aroml9保守区基因的扩增与TA克隆Aroml9基因的扩增及TA克隆的策略如图I所示，首先从GenBanK中查找Aroml9的全长基因序列(GenBanK号EU840259. I),采用Primer5. O设计了一对特异性引物上游引物I :5’_ CAGTGTGTGTTGGAGATGGTGA-3'下游引物2:5’- TTCATCATCACCATGGCAATGT -3'反转录引物AP购自上海生工生物工程公司。采用RNA抽提试剂盒提取黄鳝(购自无锡中桥菜市场)脑总RNA进行纯度鉴定后合成第一链cDNA，以反转录产物为模板及合成的上下游引物进行PCR扩增，反应条件为94°C预变性3 min，94°C预变性30s，58°C退火45s，72°C延伸lmin，30个循环，72°C延伸5 min。PCR产物的克隆与鉴定PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后用凝胶回收试剂盒回收，将回收产物与PMD18-T载体连接过夜，连接产物转化大肠杆菌JM109，随机挑取细菌，提取质粒后用EcoR I、HindIII双酶切初步鉴定后，将阳性克隆送交上海生工进行DNA测序。测序结果用DNAstar、CLUSTAL X等软件进行分析。实验结果表明扩增到了预期大小即约639bp的目的cDNA片段(见图2)，将其进行BLAST检索，进行同源性比对，结果表明其同源性为94%。实施例2原核表达载体pMAL_Aroml9的构建在用实施例I中方法获得正确的Aroml9保守区序列后将其和原核表达质粒pMAL分别用EcoR I ,Hind III37°C双酶切，用凝胶回收试剂盒回收Aroml9片段和线性化pMAL质粒，按照T4 DNA连接酶的说明书设计连接反应体系,构建表达质粒pMAL- Aroml9(见图2), 并转化大肠杆菌JM109，筛选阳性克隆，随机挑取10个克隆提取质粒，提取的质粒经EcoR I和Hind III双酶切鉴定，酶切结果表明pMAL-Aroml9酶切后有一条约639 bp的条带(见图3)，说明Aroml9成功克隆入T载体中，将重组质粒pMAL_Aroml9送测序公司测序，测序结果表明成功的将Aroml9 cDNA克隆到表达载体中。实施例3黄鳝芳香化酶保守区的原核表达载体pMAL-Aroml9用实施例2所述方法构建的黄鳝芳香化酶保守区的原核表达载体pMAL-Aroml9，其特征为由表达载体pMAL-c2x构建而得，该载体含有T7启动子和终止子、细菌核糖体结合位点PBS、Aroml9基因保守区序列及一个麦芽糖结合蛋白标签序列。进一步说明所述原核表达载体pMAL-Aroml9,其特征在于所述Aroml9基因的上游有T7启动子和细菌核糖体结合位点RBS，T7启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列，紧靠Aroml9基因的起始密码子上游还有一个麦芽糖结合蛋白标签序列。实施例4重组Aroml9蛋白的表达与鉴定将pMAL-Aroml9转化大肠杆菌TBl，挑取阳性克隆接种含50 μ g/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C摇振培养过夜，取培养菌液以1/10的比例接种于新鲜的含氨苄青霉素的LB液体培养基中，分别以O. 5、I mo I/L浓度的IPTG诱导，37°C摇振培养4h后，收集菌体，重悬于100 μ L SDS-PAGE上样缓冲液中，离心后加上样缓冲液煮沸破碎细胞，参照《分子克隆》及试剂手册进行12%浓度的SDS-PAGE电泳(见图4)鉴定蛋白的表达量。由图4可知，加入IPTG诱导后，转入载体pMAL的细菌总蛋白提取物中出现了分子量约为42kD的蛋白条带(图4泳道2中)，而转入重组质粒的细菌总蛋白提取物中出现了新的蛋白质，分子量约为65. 6kD (图4泳道I中)。由于pMAL表达质粒本身可编码42. 5kD的麦芽糖结合蛋白(Maltosebinding protein, MBP),而Aroml9分子量约为23. I kD,理论上融合蛋白的分子量约为65. 6kD。这与预期结果相一致，重组表达载体经IPTG诱导后，融合蛋白得到表达，而大肠杆菌TBl没有相应的蛋白表达。目的蛋白表达量经软件分析，约达到了细菌表达蛋白总量的43.8%。以抗MBP蛋白的抗血清进行的Western blot试验表明在大小为65. 6 kD和42. 5 kD可见两条清楚的蛋白条带。实施例5重组Aroml9蛋白的大量表达与纯化取过夜培养的10 mL细菌于IL LB (含葡萄糖)中，37°C摇振培养3h，加入IPTG至终浓度为O. 5mmol/L再继续培养2h，4000g离心20min收集菌体，重悬于50mL柱缓冲液中。加入溶菌酶至终浓度为lmg/mL，冰浴30min。最后加入DNA酶和RNA酶至终浓度为5 μ g/11^，41孵育101^11。9000g离心30min，将上清转移备用，上清即为表达的融合蛋白。将上清蛋白质上样于平衡缓冲液(20mmol/LTris-HCL，200mmol/LNaCl, lmmol/LEDTA, pH7. 4)平衡好的Amylose-sepharomse亲和柱中，用缓冲液平衡至基线后，开始用洗脱缓冲液(平衡缓冲液+lOmmol/L麦芽糖中)洗脱，洗脱液中即为纯化后的融合蛋白，最后SDS-PAGE电泳检测。在纯化好的蛋白中加入Factor Xa至终浓度为200 μ g/mL,室温作用4h,同上过Amylose-sepharomse亲和柱,用平衡缓冲液洗脱下的即为Aroml9蛋白。同样作SDS-PAGE电泳检测。检测结果表明纯化蛋白为单一条带，分子量为65. 6kD左右,相对于未融合蛋白MBP的分子量明显偏大。取纯化好的蛋白经Factor X酶切4h后，经SDS-PAGE电泳检测，目的蛋白为两个条带即分子量为42. 5kD的为MBP，分子量为23. IkD的Aro m19蛋白。再经Amylose sepharoml9se过柱后，得到纯化的Aroml9蛋白。实施例6对ICR小鼠免疫原性试验结果(I)疫苗准备与免疫程序取重组菌37°C培养、纯化后，与完全弗氏佐剂以I: I的比例混合均匀，免疫15只小鼠,每只小鼠腹腔注射70 μ g纯化蛋白进行免疫,初免后小鼠每间隔2周以与初免相同的剂量加强免疫4次。每次免疫后I周尾静脉采血，制备血清。同时以生理盐水腹腔注射10只小鼠为空白对照。最后大量取血制备抗血清。(2)间接ELISA检测Aroml9血清抗体通过间接ELISA方法测定Aroml9特异的血清抗体效价=ELISA按常规方法进行。将纯化的重组蛋白4°C过夜包被，PBST (含O. 02%Tween-20的PBS)洗涤3次后，用含10%FCS的PBS加满各孔4°C封闭24h，PBST洗涤3次。样品血清作倍比稀释(100 μ L/孔)，同时设立阴性对照(I :100稀释的免疫前小鼠血清)和空白对照(PBS)，37°C水浴孵育2h，PBST洗涤3次，每孔加入IOOyL I 25000稀释的HRP标记羊抗鼠IgG酶标二抗，37°C水浴孵育2h，PBST洗涤3次，每孔加入100 μ L OPD底物进行，测定0D490值，以Ρ/Ν (待检样品0D490/阴性样品0D490)彡2. I判为阳性。(3)初免I周后，免疫组小鼠的血清中就能检测到重组蛋白诱导产生的特异抗体，在加强免疫后第6周抗体滴度为I. 542±0. 23，达到峰值，而空白对照组不能产生特异抗体，且免疫组与空白组抗体效价值差异显著(Ρ〈0. 05)。通过上述的实验，本发明达到了如下的结果利用本发明的原核表达载体pMAL-Aroml9，该载体是含有黄鳝芳香化酶保守区的原核表达载体。本发明采用RT-PCR方法从黄鳝脑中扩增出长约639bp的目的序列Aroml9基因保守区片段，克隆至T载体中，经酶切鉴定和序列测定分析确认序列的正确性后将其克隆到表达载体pMAL-c2x中构建重组表达质粒pMAL-Aroml9，并在大肠杆菌TBl中获得了高表达，目的蛋白约占菌体总蛋白的43. 8%。菌体经溶菌酶裂解,制备无细胞抽提液,Amylose-sepharomse柱层析后得到分子量为65. 6kD单一条带的目的蛋白。目的蛋白经Factor Xa酶切裂解,Amylose-sepharomse过柱纯化后得到纯化的Aroml9蛋白。以70 μ g/只的剂量4次免疫ICR小鼠，免疫小鼠可以检测到特异性针对Aroml9蛋白的血清抗体应答，免疫组抗体水平显著高于空白组(P〈0. 05)，且加强免疫第6周后抗体效价为I. 542±0. 23，达到高峰值，说明表达产物具有免疫原性，可以刺激机体产生免疫应答。
权利要求
1.黄鳝芳香化酶保守区的原核表达载体pMAL-Aroml9,其特征在于所述原核表达载体由表达载体pMAL-c2x构建而得，该载体含有T7启动子和终止子、细菌核糖体结合位点PBS、Aroml9基因保守区序列及一个麦芽糖结合蛋白标签序列。
2.如权利要求I所述的原核表达载体pMAL-Aroml9,其特征在于所述载体中的Arom19来源于黄鳝。
3.如权利要求I所述的原核表达载体pMAL-Aroml9,其特征在于所述Aroml9基因的上游有17启动子和细菌核糖体结合位点RBS，T7启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列，紧靠Aroml9基因的起始密码子上游还有一个麦芽糖结合蛋白标签序列。
4.如权利要求1 3中任一项所述的原核表达载体pMAL-Aroml9的构建方法,其特征在于由下述方法构建而得 从GenBank中查找黄鳝Aroml9的全长基因序列，并米用Primer5. 0设ii^一对特异性引物 上游引物 1:5’- CAGTGTGTGTTGGAGATGGTGA-3' 下游引物 2: 5’- TTCATCATCACCATGGCAATGT -3' 以提取自黄鳝的脑总RNA为模板进行反转录合成第一链cDNA，以反转录产物为模板及合成的上下游引物进行PCR扩增，反应条件为94°C预变性3min，94°C变性30s，58°C退火45s, 72°C延伸 lmin, 30 个循环，72°C延伸 7min ； PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后用凝胶回收试剂盒回收，将回收产物与PMD18-T载体，16°C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌JM109，随机挑取细菌，提取质粒后用EcoR I、Hind III双酶切初步鉴定后，将阳性克隆进行DNA测序，测序结果用生物软件DNAstar、CLUSTAL X等进行分析； 将阳性质粒和原核表达质粒PMAL-C2X分别用I ,Hindlll 37°C双酶切，用凝胶回收试剂盒回收Aroml9保守区片段和线性化pMAL质粒,按照T4 DNA连接酶的说明书设计连接反应体系，构建表达质粒pMAL-Aroml9，并转化大肠杆菌JM109，筛选阳性克隆，随机挑取1-2个克隆进行酶切鉴定，获得黄鳝芳香化酶保守区的原核表达载体pMAL-Aroml9。
5.如权利要求3中任一项所述的原核表达载体pMAL-Aroml9在制备Aroml9保守区抗体的抗原中的应用。
6.用权利要求I 3中任一项所述的原核表达载体pMAL-Aroml9在制备Aroml9重组蛋白中的应用，其具体应用方法如下 将pMAL-Aroml9转化大肠杆菌TBl，挑取阳性克隆接种含50 u g/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C摇振培养过夜； 取培养菌液以1/10的比例接种于新鲜的含氨苄青霉素的LB液体培养基中，分别以.0.5、lmol/L浓度的IPTG诱导，37°C摇振培养4h后，收集菌体，加入溶菌酶至终浓度为Img/mL,冰浴 30min ； 加入DNA酶和RNA酶至终浓度为5 u g/mL，4°C孵育10 min ;所得产物9000g离心30min，将上清转移备用，上清即为表达的融合蛋白； 将上清蛋白质上样于平衡缓冲液平衡好的Amylose_sepharoml9se亲和柱中，其中所述平衡缓冲液为 20mmoI/LTris-HCL, 200mmol/LNaCl, lmmol/LEDTA, pH7. 4 ； 用缓冲液平衡至基线后，开始用洗脱缓冲液，所述洗脱缓冲液为平衡缓冲液，再加lOmmol/L麦牙糖，洗脱液中即为纯化后的融合蛋白； 最后SDS-PAGE电泳检测；在纯化好的蛋白中加入Factor Xa至终浓度为200 u g/mL，室温作用4h，同上过Amylose- sepharoml9se亲和柱，用平衡缓冲液洗脱下的即为Aroml9蛋白。
全文摘要
本发明提供一种Arom19的原核表达载体pMAL-Arom19，该载体含有T7启动子和终止子、细菌核糖体结合位点RBS和Arom19基因保守区片段及一个麦芽糖结合蛋白标签。构建此载体的方法为采用RT-PCR方法从黄鳝脑中扩增出长约639bp的目的序列Arom19基因保守区，克隆至T载体中，经酶切鉴定和序列测定分析确认序列的正确性后，将此片段克隆到表达载体pMAL-c2x中构建重组表达质粒pMAL-Arom19。利用该载体转化大肠杆菌实现Arom19保守区蛋白的高水平表达，进一步纯化获得高纯度的重组Arom19蛋白质。实验证实，用本发明提供载体制备Arom19保守区蛋白具有较强的免疫原性，能刺激机体产生免疫应答。
文档编号C12N15/70GK102796754SQ201210275140
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月3日 优先权日2012年8月3日
发明者丁炜东, 曹丽萍, 曹哲明, 邴旭文 申请人:中国水产科学研究院淡水渔业研究中心