专利名称：一种人的血清抑制基因的制作方法
众所周知，细胞增殖调控与肿瘤，骨质增生，伤口愈合等疾病和人类健康问题紧密联系，是探讨这一类疾病的发病机制和检测治疗的基础。然而目前虽然了解某些基因与细胞的增殖调控有关，如CDK基因家族，cyclin基因家族，CDI基因家族，蛋白激酶，泛素依赖的蛋白水解酶等。但细胞增殖控制的机制，或者说控制细胞的开关并不清楚，人们还不能随心所欲的改变细胞生长和分化。继续克隆一些新的与细胞生长控制有关的基因，探讨其功能，对了解细胞周期控制机制，并应用与疾病的诊断治疗是及其重要的。
细胞增殖过程分为四个时期，即G1，S，G2和M期。G1期是细胞增殖前期，细胞完成一次增殖即进入G1期，如果细胞不进入下一次增殖，即传入G0期(即休止期)。如果细胞启动了增殖程序，细胞从G1期转入S期，进行DNA的复制。完成DNA复制后，细胞转入G2期，进行分裂前的准备。完成分裂前的准备后从G2期转入M期，细胞进行分裂，一分为二，由一个细胞分裂成两个细胞。分裂完成后又进入G1期。整个分裂周期有两个控制位点，一是G1/S过度，二是G2/M过度。一般认为G1/S过度点最关键，G2/M过度点的作用是保证细胞完成DNA复制后才进行M期。目前还不知道哪一个是控制G1/S的关键基因，或者说至关重要的基因。
本发明的目的在于提供一种能够控制G1/S过度点，并对了解细胞周期控制的机制，对肿瘤诊断与治疗有重要的参考价值的人的血清抑制基因。
本发明是这样实现的血清是大多数细胞培养的必须成份，它含有刺激细胞生长的细胞因子。无血清时，细胞处于G0期，停止增殖。在培养基中加入血清因子，细胞即可开始增殖，所以控制血清可以控制细胞的增殖。通过比较血清培养细胞和无血清培养细胞中基因表达的差异，是克隆控制细胞增殖相关基因的有效途径。根据NCBI数据库资料查询，序列的W95909用于DNA芯片检测结果显示(见
图1)，该序列在血清饥饿后，恢复血清培养30分钟和12小时，表达水平骤然下降。根据细胞周期推断，该基因的表达是处于G1/S期和G2/M期过度控制点。根据这一线索，通过计算机克隆及PCR扩增、重组克隆、测序等技术，获得了该基因。再通过蛋白质氨基酸序列的同源比较，与线粒体转录终止因子有29％的同源性，由此可以判断该基因是一个转录终止因子。人的血清抑制基因(Si-2)即是这样克隆得到的基因。Si-2基因全长1.478Kb，蛋白质编码框365个氨基酸残基。其氨基酸序列和核苷酸序列分别如下MLWKLLLRSQSCRLCSFRKMRSPPKYRPFLACFTYTTDKQSSKENTRTVEKLYKCSVDIRKIRRLKGWVLLEDETYVEEIANILQELGADETAVASILERCPEAIVCSPTAVNTQRKLWQLVCKNEEELIKLIEQFPESFFTIKDQENQKLNVQFFQELGLKNVVISRLLTAAPNVFHNPVEKNKQMVRILQESYLDVGGSEANMKVWLLKLLSQNPFILLNSPTAIKETLEFLQEQGFTSFEILQLLSKLKGFLFQLCPRSIQNSISFSKNAFKCTDHDLKQLVLKCPALLYYSVPVLEERMQGLLREGISIAQIRETPMVLELTPQIVQYRIRKLNSSGYRIKDGHLANLNGSKKEFEANFGKIQAKKVRP1 ggtgctgaga actgtcggga gcttcttgag accgaggacc gaaatcccgg ctccaggcct61 cggggactgc ggactgtggg gaggctggcc ggagagagag ggaaggacgg ggcctggccc121 ccgggactcc ctgtgccttg cttggagctg acgccgacgg ggaactgaca agatcacatt181 ttgagaagaa gttggaaaga atcccaagtg gatgaactga atatctggat gaggacaaga241 tctgtgggga gagactgtaa gatagaatga gtccatttaa gtcccaggac ggtggaaact301 agctagtaga ttgcagccat gttgtggaag ctgctgctga gatcccagtc ctgcaggctg361 tgttctttca gaaagatgcg atcacctcca aaatacagac ctttcttagc atgcttcacc421 tatacaactg ataaacagtc gagcaaagaa aatacaagaa cagtggaaaa gctctataaa
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图1为Si-2基因同源序列W95909在血清饥饿恢复后血清培养的芯片检测结果。图中从左至右为血清饥饿，恢复血清15分钟，30分钟，1小时，2小时，4小时，6小时，8小时，12小时，16小时，20小时，24小时的表达结果。绿色为表达降低，红色为表达增强，黑色为表达不变。
附图2为Si-2基因蛋白质序列与人线线粒体转录终止因子的同源性比较。
附图3为Si-2基因蛋白质序列与海胆粒体转录终止因子的同源性比较。
附图4、附图4(续)为Si-2基因测序图谱。
附图5、附图5(续)为Si-2基因测序结果。
下面结合附图对本发明作进一步详述本实验室近年来一直从事细胞周期调控研究，并通过血清饥饿处理进行细胞基因表达的差异比较克隆新的细胞周期调控基因。通过网络查询，发现Stanford大学DavidBotstein小组的血清处理细胞的芯片检查结果中，有一个EST序列的表达水平在血清饥饿后恢复血清培养30分中时，骤然下降，这正与本实验室近年来希望寻找的基因的表达模式一致。根据这一信息，通过计算机网络发现这是一测序工程小组测出的300多碱基的序列，其功能并不知道。我们采用计算机与网络资料查询，并通用的方法进行计算机网络克隆，获得一个全长1.478Kb的序列，在人类基因组中第12号染色体短臂24.1位点(12q24.1)找到了全部序列。于是，通过PCR扩增获，得到了该序列的全部编码框(见图4、图5、)。该序列已被GenBank收录。该基因的氨基酸序列和核苷酸序列分别如下MLWKLLLRSQSCRLCSFRKMRSPPKYRPFLACFTYTTDKQSSKENTRTVEKLYKCSVDIRKIRRLKGWVLLEDETYVEEIANILQELGADETAVASILERCPEAIVCSPTAVNTQRKLWQLVCKNEEELIKLIEQFPESFFTIKDQENQKLNVQFFQELGLKNVVISRLLTAAPNVFHNPVEKNKQMVRILQESYLDVGGSEANMKVWLLKLLSQNPFILLNSPTAIKETLFFLQEQGFTSFEILQLLSKLKGFLFQLCPRSIQNSISFSKNAFKCTDHDLKQLVLKCPALLYYSVPVLEERMQGLLREGISIAQIRETPMVLELTPQIVQYRIRKLNSSGYRIKDGHLANLNGSKKEFEFAFGKIQAKKVRP1 ggtgctgaga actgtcggga gcttcttgag accgaggacc gaaatcccgg ctccaggcct
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本发明的人的血清抑制基因具有能够控制G1/S过度点的作用，对了解细胞周期控制的机制有重要的参考价值，具有可应用于肿瘤诊断与治疗等优点。
权利要求
一种人的血清抑制基因，其特征在于该血清抑制基因全长1.478Kb，蛋白质编码框为365个氨基酸残基；其氨基酸序列和核苷酸序列分别如下MLWKLLLRSQSCRLCSFRKMRSPPKYRPFLACFTYTTDKQSSKENTRTVEKLYKCSVDIRKIRRLKGWVLLEDETYVEEIANILQELGADETAVASILERCPEAIVCSPTAVNTQRKLWQLVCKNEEELIKLIEQFPESFFTIKDQENQKLNVQFFQELGLKNVVISRLLTAAPNVFHNPVEKNKQMVRILQESYLDVGGSEANMKVWLLKLLSQNPFILLNSPTAIKETLEFLQEQGFTSFEILQLLSKLKGFLFQLCPRSIQNSISFSKNAFKCTDHDLKQLVLKCPALLYYSVPVLEERMQGLLREGISIAQIRETPMVLELTPQIVQYRIRKLNSSGYRIKDGHLANLNGSKKEFEANFGKIQAKKVRP1 ggtgctgaga actgtcggga gcttcttgag accgaggacc gaaatcccgg ctccaggcct61 cggggactgc ggactgtggg gaggctggcc ggagagagag ggaaggacgg ggcctggccc121 ccgggactcc ctgtgccttg cttggagctg acgccgacgg ggaactgaca agatcacatt181 ttgagaagaa gttggaaaga atcccaagtg gatgaactga atatctggat gaggacaaga241 tctgtgggga gagactgtaa gatagaatga gtccatttaa gtcccaggac ggtggaaact301 agctagtaga ttgcagccat gttgtggaag ctgctgctga gatcccagtc ctgcaggctg361 tgttctttca gaaagatgcg atcacctcca aaatacagac ctttcttagc atgcttcacc421 tatacaactg ataaacagtc gagcaaagaa aatacaagaa cagtggaaaa gctctataaa481 tgttcagttg acattaggaa aattcgtaga ttaaaaggat gggtactttt agaggatgaa541 acctatgttg aagaaattgc gaatatttta caagaactag gtgccgatga gactgctgta601 gccagtattt tggaacgctg cccggaagca attgtctgta gtccaaccgc tgttaacacc661 cagagaaaac tctggcagtt ggtctgcaaa aatgaggaag agttaatcaa gttaatagag721 cagtttccag aatctttctt tactattaaa gaccaagaga accagaagct gaatgttcag781 ttctttcaag agttgggact aaaaaatgtg gtcattagca gacttttgac agctgcacct841 aatgtttttc ataatcctgt tgagaagaat aagcaaatgg taagaattct ccaagagagt901 tatctagatg taggtggctc tgaggccaac atgaaagttt ggctactaaa attgttaagc961 caaaacccat ttattttgtt aaattctccc acagctataa aggaaacact agaatttctc1021 caggagcaag gtttcaccag ctttgaaatt ctccagcttc tatccaaact caaaggattt1081 ctttttcaac tttgcccaag aagtatacag aatagtattt ccttctctaa aaatgctttt1141 aaatgcacag atcatgacct gaagcaatta gttttgaaat gtcctgccct tttatattat1201 tctgttccag ttttagaaga gagaatgcaa ggattattga gagaaggaat ttccatagct1261 cagataagag agacgccaat ggttcttgaa ttaacaccac agatagtaca gtacaggata1321 aggaaactga attcctcagg ctacagaata aaggatggac atctagcaaa tctaaatgga1381 tcaaaaaaag agtttgaagc taattttggc aaaattcagg ccaaaaaagt aaggccatta1441 tttaaccctg tggcaccatt aaatgttgaa gaatgaca
全文摘要
本发明涉及一种人的血清抑制基因,属生物学技术领域。本发明采用计算机与网络资料查询,并按现有技术进行计算机克隆,获得一个全长1.478Kb的序列,在人类基因组中第12号染色体短臂24.1位点(12q24.1)找到了全部序列,并通过PCR扩增获,得到了该序列全部编码序列。人的血清抑制基因(Si－1)具有能够控制G1/S过度点的作用,对了解细胞周期控制的机制有重要的参考价值,具有可应用于肿瘤诊断与治疗等优点。
文档编号C12N15/11GK1361283SQ00136900
公开日2002年7月31日 申请日期2000年12月25日 优先权日2000年12月25日
发明者谭德勇, 何云刚, 赖建华, 钱伟, 余敏 申请人:云南大学