专利名称：一种低血清高效培养鸡毒支原体弱毒株培养基及其制备方法
技术领域：
本发明属于兽医生物学技术领域，涉及一种低血清高效培养鸡毒支原体弱毒株培养基及其制备方法。
背景技术：
鸡毒支原体主要引起鸡、火鸡的慢性呼吸道疾病，是一种严重危害养禽生产的病原体，其主要危害是该病在规模化鸡场中经常缓慢流行，导致产蛋鸡产量下降，肉鸡和生长鸡的发育受阻、饲料报酬降低；由于感染鸡群的免疫抑制引起其它疫病的继发或伴发，给养鸡业造成的主要损失是发病鸡群的死淘率明显上升。鸡毒支原体活疫苗和灭活疫苗联合使用可以减少鸡毒支原体水平传播和垂直传播，但优质疫苗的前提需要有一种好的培养基来支撑。培养基是人工合成各种营养物质供微生物生长的基质。目前培养鸡毒支原体主要应用改良Frey氏或其他支原体培养基。其制苗添加的血清量普遍为10_30%之间。以上述传统培养鸡毒支原体培养基所需血清量比本发明血清量高5%_25%，过量的血清制备的疫苗无疑给鸡只增加异源体对鸡体的过敏应激反应，最终影响疫苗的免疫效力。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种低血清高效培养鸡毒支原体弱毒株培养基及其制备方法，用以降低培养鸡毒支原体所需血清用量，提高鸡毒支原体抗原效价。本发明另一目的是提供该鸡毒支原体弱毒株培养基的制备方法。本发明所述问题是以下述技术方案解决的:
一种低血清高效培养鸡毒支原体弱毒株培养基及其制备方法，所述低血清高效培养鸡毒支原体弱毒株培养基按如下工艺配制:基础培养基:(1)MEM6-7g
(2)酵母浸出粉2-4g
(3)胰蛋白胨6-8g
(4)葡萄糖6-8g
(5)质量浓度为1%的酚红溶液l-2ml
(6)Na2HPO4 12H20l-2g
(7)KH2PO40.05-0.09g(8 ) NaCl 2-3g
(9)蒸馏水1000ml在116°C灭菌30min，待冷却后，在无菌条件下加入下列辅助培养基成分，制成供培养鸡毒支原体培养基。辅助培养基:
(10)猪血清40-5 0ml
(11)质量浓度为20%新鲜酵母浸出液80-90ml
(12)质量浓度为3%谷氨酰胺(过滤除菌)90-100ml
(13)质量浓度为10%精氨酸溶液20ml
(14)青霉素0.002-0.015mg/ml用lmol/L氢氧化钠溶液调整PH至7.6-7.8。本发明还提供了该鸡毒支原体培养基的制备方法，其特征在于制备步骤如下:I制备基础培养基:取上述(I)- (8)成分逐一溶入IOOOml蒸馏水，高压灭菌后备用。2制备辅助培养基:取上述(9)- (14)混和、搅拌，即得辅助培养基。3将基础培养基和辅助培养基混和，调pH至7.6-7.8，分装备用。本发明的低血清高效培养鸡毒支原体弱毒株培养基运用微生物学、无机、有机分析化学的技术原理，对不同的氮源、碳源、蛋白质、无机盐和胆固醇等诸多营养组分的组合进行了筛选，对培养基的PH值、渗透压等进行分析，研究出了适合低血清高效培养鸡毒支原体弱毒株的培养基。该培养基的配方中除基本成份外，在培养基中还添加了新鲜酵母浸出液、谷氨酰胺、精氨酸，上述成分的添加能明显提高鸡毒支原体的活菌滴度；未添加前的活菌滴度为109CCU/ml，添加后活菌滴度为10nCCU/ml。而本发明最大的优势在于猪血清用量仅为5%左右，大大减轻了异源体血清对鸡体的过敏应激反应，为我们的养殖事业保驾护航。
具体实施例方式实施例1
本发明培养基的制备基础培养基:
(1)MEM3.1g
(2)酵母浸出粉1.3g
(3)胰蛋白胨3.3g
(4)葡萄糖3.3g
(5)质量浓度为1%的酚红溶液0.75ml
(6)Na2HPO4 12H200.6g
(7)KH2PO40.04g
(8)NaCl1.15g·
(9)蒸馏水500ml在116°C灭菌30min，待冷却后，在无菌条件下加入下列辅助培养基成分，制成供培养鸡毒支原体培养基。辅助培养基:
(10)猪血清25ml
(11)质量浓度为20%新鲜酵母浸出液45ml
(12)质量浓度为3%谷氨酰胺(过滤除菌)50ml(13 )质量浓度为10%精氨酸溶液 IOml
(14)青霉素 0.008mg/ml将基础培养基(I)- (8)成分逐一溶入500ml蒸馏水中高压灭菌，冷却后添加辅助培养基，lmol/L氢氧化钠溶液调整pH至7.7，制得低血清高效鸡毒支原体培养基。实施例2本发明培养基的制备基础培养基:(I ) MEM5.1g
(2)酵母浸出粉2.2g
(3)胰蛋白胨5.4g
(4)葡萄糖5.4g
(5)质量浓度为1%的酚红溶液1.2ml
(6)Na2HPO4 12H200.96g
(7)KH2PO40.04g
(8)NaCl1.84g
(9)蒸馏水800ml在116°C灭菌30min，待冷却后，在无菌条件下加入下列辅助培养基成分，制成供培养鸡毒支原体弱毒株培养基。辅助培养基:
(10)猪血清40ml
(11)质量浓度为20%新鲜酵母浸出液72ml (12)质量浓度为3%谷氨酰胺(过滤除菌)80ml
(13)质量浓度为10%精氨酸溶液16ml
(14)靑苒尜0.012mg/ml将基础培养基(I)- (8)成分逐一溶入800ml蒸馏水中高压灭菌，冷却后添加辅助培养基，lmol/L氢氧化钠溶液调整pH至7.7，制得低血清高效鸡毒支原体培养基。实施例3应用鸡毒支原体(F36)分别通过本发明支原体培养基、改良Frey氏培养基、支原体培养基对鸡毒支原体(F36)进行比较培养试验:I本发明培养基的制备基础培养基:
(I ) MEM6.3g
(2)酵母浸出粉2.7g
(3)胰蛋白胨6.7g
(4)葡萄糖6.7g
(5)质量浓度为1%的酚红溶液1.5ml
(6)Na2HPO4.12H201.2g
(7)KH2PO40.08g
(8)NaCl2.3g
(9)蒸馏水1000ml
在116°C灭菌30min，待冷却后，在无菌条件下加入下列辅助培养基成分，制成供培养鸡毒支原体培养基。辅助培养基:
(10)猪血清50ml
(11)质量浓度为20%新鲜酵母浸出液90ml
(12)质量浓度为3%谷氨酰胺(过滤除菌)IOOml
(13)质量浓度为10%精氨酸溶液20ml
(14)青霉素0.015mg/ml将基础培养基(I) - (8)成分逐一溶入IOOOml蒸馏水中高压灭菌，冷却后添加辅助培养基，lmol/L氢氧化钠溶液调整pH至7.7，制得低血清高效鸡毒支原体培养基。2配制改良Frey氏培养基基础液
NaCl5g
KCl0.4g
MgS04.7H200.2g
Na2HPO4.12H,Ol.6g
KH2PO4Olg
葡萄糖IOg
乳蛋白水解物5g溶于1000ml去离子水中，115°C 20分钟灭菌。培养基
基础液〗00ml
猪血清13ml
25%酵母浸出液IOml
青霉素10万单位
1/80醋酸铊Iml以IN NaOH 调 pH 值至 .103支原体培养基配制“支原体培养基”
PPLO 肉汤21.0g
葡萄糖5.0g10%的精氨酸溶液10.0ml
10倍浓缩MEM培养液10.0ml
1%醋酸铊溶液1Oml
25%酵母浸出液1OOml
8万单位/ml青霉素10.0ml
猪(马)血清1OOmI用去离子水定容至1000ml，用氢氧化钠溶液(2M)调整pH值至7.8,0.22微米滤过除囷备用。4鸡毒支原体培养将购自中国兽医药品监察所的鸡毒支原体弱毒菌株(F36株)，分别接种本发明的低血清高效培养鸡毒支原体弱毒株培养基、改良Frey氏培养基和支原体培养基3种培养基，种子继代复壮后，分别按10% (V/V)的比例接种，37°C培养，当培养液的颜色变黄、pH由
7.7降至6.5时，无菌取出培养物。5活菌滴度(CXU)测定每个菌株取15只无菌试管,每管装4.5ml含鸡毒支原体培养基,在第I管加入
0.5ml生长良好的培养物，混合均匀后，吸取0.5ml加入第2根管，如此进行10倍系列稀释至最末I管，同时设未加菌液的鸡毒支原体培养基作为阴性对照。试验管设三个重复。之后，将试管放置37°C恒温箱中静止培养，每日观察I次，主要观察培养基的颜色变化，连续观察时间为10天，最后发生颜色变化的试管稀释度即为该培养物的CCU滴度。此试验共进行了 3次。6 结果6.1鸡毒支原体弱毒菌株F36株接种3种培养基3次生长试验(XU (颜色变化单位)测定结果见表I表I鸡毒支原体弱毒菌株F36株接种3种培养基3次生长试验CCU测定结果
权利要求
1.一种低血清高效培养鸡毒支原体弱毒株培养基及其制备方法，其特征是培养基包括:基础培养基:(I ) MEM6-7g(2)酵母浸出粉2-4g(3)胰蛋白胨6-8g(4)葡萄糖6-8g(5)质量浓度为1%的酚红溶液l-2ml(6)Na2HPO4 12H20l-2g(7)KH2PO40.05-0.09g(8)NaCI2-3g(9)蒸馏水1000ml在116°C灭菌30min，待冷却后，在无菌条件下加入下列辅助培养基成分，制成供培养鸡毒支原体弱毒株培养基。辅助培养基:(10)猪血清40-50ml(11)质量浓度为20%新鲜酵母浸出液80-90ml(12)质量浓度为3%谷氨酰胺(过滤除菌)90-100ml(13)质量浓度为10%精氨酸溶液20ml(14)青霉素O 002-0.015mg/ml用lmol/L氢氧化钠溶液调整PH至7.6-7.8。
2.如权利要求1所述的低血清高效培养鸡毒支原体弱毒株培养基，其特征是每IOOOml培养基中加猪血清40-50ml。
3.如权利要求1所述的一种低血清高效培养鸡毒支原体弱毒株培养基及其制备方法，包括如下步骤:Cl)制备基础培养基:取上述(I) - (8)成分逐一溶入IOOOml蒸馏水，高压灭菌后备用；(2)制备辅助培养基:取上述(9)- (14)混和、搅拌，即得辅助培养基将高压灭菌冷却后的基础培养基和辅助培养基混和，调PH至7.6-7.8，分装备用。
4.如权利要求1所述的一种低血清高效培养鸡毒支原体弱毒株培养基及其制备方法适用于鸡毒支原体所有活疫苗抗原的制备。
全文摘要
本发明涉及低血清高效培养鸡毒支原体弱毒株培养基及其制备方法，属于兽医生物学技术领域。包括(1)基础培养基；(2)辅助培养基，主要有MEM、酵母浸出粉、胰蛋白胨，葡萄糖，无机盐等组成，该培养基能够既保证半成品生长滴度高而且稳定。用本发明方法制备的半成品菌液效价高达1011CCU/ml；同时该培养基采用降低猪血清培养鸡毒支原体，减轻了异源体猪血清对鸡体的过敏应激反应，既考虑到动物的生物安全，又提高了抗原效价，而且降低了生产成本。
文档编号C12R1/35GK103074246SQ20121031707
公开日2013年5月1日 申请日期2012年8月31日 优先权日2012年8月31日
发明者不公告发明人 申请人:南京天邦生物科技有限公司