专利名称：：鸡nd-ib-ai-eds四联油乳剂灭活疫苗抗原浓缩技术的制作方法鸡ND-IB-AI-EDS四联油乳剂灭活疫苗抗原浓縮技术
技术领域：
本方法为鸡ND-IB-AI-EDS四联油乳剂灭活疫苗制备过程中病毒抗原的浓縮技术。
背景技术：
：随着我国养鸡业的发展，养殖规模和养殖密度越来越大，由于蛋鸡和种鸡的饲养周期较长，受疾病侵害的危险性也大，迫使养殖场频繁地给鸡群接种不同种类的单苗，不仅耗费大量的人力、物力，还给鸡群造成严重的应激反应，影响生产性能。二联、三联和多联疫苗，接种一次可以预防两种、三种甚至多种疾病，使疫苗接种变得更加简便且经济实惠，在生产实践中应用越来越多，受到广大养殖户的喜爱。多联疫苗的生产，单位体积内抗原含量是否充足是决定疫苗质量的关键，而单纯改变疫苗乳化工艺中的油水比例以及通过改变病毒增殖条件提高病毒含量均不能达到多联苗生产所需要的抗原量。因此应用先进的抗原浓縮技术，提高疫苗中的抗原浓度，确保单位疫苗中足够的抗原含量，同时尽量减小免疫剂量，是目前多联疫苗生产中急需解决的关键技术。中空纤维超滤技术具有单位体积内膜表面体积大、耗能低、效率高、滞留低等特点。其工作原理是原液通过泵，在一定压力成湍流状态下在中空纤维超滤膜内或膜外表面分布流动，溶剂或小于膜截流分子量的物质透过膜经收集成为超滤液，而大于膜截流分子量的物质及胶体颗粒则被截流，如要返回到原液中时，其原液的浓度会逐渐升高，俗称浓縮液，如此反复，从而实现原液的浓縮目的。本技术应用天津工业大学膜分离技术研究所生产的内压式中空纤维超滤器浓縮器对病毒抗原进行浓縮，旨在解决长期鸡ND-IB-AI-EDS四联油乳剂灭活疫苗抗原量低的问题。
发明内容1发明目的本发明的目的是建立可靠、高效率的鸡ND-IB-AI-EDS四联油乳剂灭活疫苗抗原浓縮技术，以确保生产出的四联苗中四种病毒的浓度均达到抗原量，能够保护鸡群免受新城疫病毒(NDV)、H9型禽流感病毒(AIV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、减蛋下降综合症病毒(EDSV)的侵袭。2发明的具体步骤2.1设备本方法采用由天津工业大学膜分离技术研究所生产的内压式中空纤维超滤器，'选用不锈钢机械泵，采用低噪音、耐腐蚀、无污染、易灭菌的聚四氟乙稀材料，整机无机械磨擦，无剧烈振动、易清洗。接口密闭，循环闭路，便于无菌操作。该设备为两级过滤，一级滤柱可截留病毒液中颗粒物质、碎片以及蛋白等胶冻样物质，为二级过滤创造一个良好的过滤环境。二级滤柱截留分子量40KD，为该滤过装置的主要部分，病毒液通过中空纤维滤柱时水分等小于截留分子量的物质在循环过程中被滤过，而病毒被截留，从而达到病毒液浓縮的目的。2.2浓缩材料新城疫病毒(NDV)、H9型禽流感病毒(AIV)、传染性支气管炎病毒(IBV)病毒液，将以上三种病毒液分别通过超滤装置进行浓縮后，与减蛋下降综合症病毒(EDSV)按比例混合用于疫苗的制备。2.3病毒液浓縮和疫苗制备流程2.3.1粗滤将病毒液倒入料桶中，经过300目的铜网滤出病毒液中残留的组织或细胞团块，流出的病毒液称为粗滤液。2.3.2精滤在0.15MPa的压力下，将粗滤液压入到一级滤柱内，在持续的压力下，粗滤液在中空纤维柱内流动，小于膜截流分子量的病毒液通过中空纤维膜流出一级滤柱(称为精滤液)，大分子量的蛋白质等物质被截留在柱内。2.3.3超滤将精滤液在0.15MPa的压力下注入二级滤柱内，在持续的压力下，精滤液在中空纤维柱内循环流动，小于膜截流分子量的溶剂通过中空纤维膜流出，病毒粒子被截留。流出的溶剂中应不含有病毒粒子。通过计算流出的溶剂的量与病毒原液的体积相比，即可计算出病毒液被浓縮的倍数。2.3.4收料当通过计算体积比，病毒液达到了浓縮倍数时，停止超滤。将中空纤维柱中余下的病毒浓縮液，从出口流入收料装置内。整个病毒浓縮过程结束。2.3.5病毒液灭活浓缩后的新城疫病毒(NDV)、H9型禽流感病毒(AIV)、传染性支气管炎病毒(IBV)病毒液和减蛋下降综合症病毒(EDSV)中加入0.2%的甲醛进行灭活。2.3.6疫苗制备将经灭活检验合格的浓縮ND、IB、AI(H9)、EDS病毒抗原按适当比例混合，加入少量吐温-80，制备水相后，与油相按l:3的比例混合，加入终浓度为0.01%的硫柳汞，乳化制备成ND-IB-AI-EDS浓縮四联油乳剂灭活疫苗。图1内压式中空纤维微滤膜组件模式图超滤过程中起决定作用的是超滤膜。中空纤维超滤膜是以高分子材料采用特殊工艺制造而成的非对成半透膜，它呈中空纤维毛细管状微孔密布管壁。在压力作用下原液在膜内或膜外流动，其中，溶剂或小分子物质透过膜经收集成为超滤液，其它大分子物质及胶体颗粒则被膜面阻挡，被循环流动的原液带走而成为浓缩液，从而达到物质的分离、浓缩、和提纯之目的。图2中空纤维超滤器滤柱实例图具体实施例方式实例1禽ND-IB-AI-EDS四联油乳剂灭活疫苗病毒抗原浓縮和免疫对比试验K材料与方法U病毒液NDV、IBV、AIV(H9亚型)、EDS活病毒液与灭活病毒液均由本室提供。1.2主要仪器设备中孔纤维超滤器，天津工业大学膜分离技术研究所生产；胶体磨，沈阳新光机器厂产品；均质机，购自上海华东均质机厂。1.3灭活前病毒抗原浓縮试验应用中孔纤维超滤器将收获的NDV、IBV、AIV(H9)浓縮4倍，计算浓縮时间和滤过水的体积，并分别采集浓縮前、浓縮后病毒样品和等压冲洗水、反洗水样品，应用微量法测定样品对1%鸡红细胞的HA效价，计算病毒截留率。IBV样品测定前先用1%胰蛋白酶进行预处理。1.4灭活后病毒抗原浓缩试验用灭活后的ND、IB、AI病毒液进行浓縮试验，测定浓縮前、后病毒样品对1。/。鸡红细胞的HA效价，计算病毒截留率。IBV样品测定前先用1%胰蛋白酶进行预处理。1.5疫苗制备将经灭活检验合格的浓缩ND、IB、AI(H9)病毒抗原按适当比例混合，加入少量吐温-80，制备水相后，与油相按l:3的比例混合，加入终浓度为0.01%的硫柳汞，乳化制备成ND-IB-AI浓縮三联油乳剂灭活疫苗。同时用未浓缩的ND、IB、AI(H9)病毒抗原按相同的抗原体积比例制备非浓縮三联疫苗。1.6免疫对比试验将20日龄非免疫雏鸡分成2组，每组10只，第l组用浓縮疫苗免疫，第2组用非浓缩疫苗免疫，每只鸡接种0.25ml。分别与免疫前和免疫后l、4、8、12周检湖!IND、IB、AI(H9)血清抗体HI效价。2、实验结果2.1浓缩效率测定应用滤器对NDV、IBV、AIV按预先设计分别进行4倍浓縮，并分别采集浓縮前、浓縮后病毒样品和滤过液、等压冲洗水、反洗水样品，测定样品对1%鸡红细胞的HA效价，计算病毒截留率。结果见表2-l、表2-2、表2-3、表2-4。表2-l:未灭活病毒液浓缩前后的HA效价(Log2)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2-1结果表明，3种病毒液浓縮试验均达到预期的效果，病毒液浓縮4倍后，其HA效价较浓縮前提高了两个滴度。同时滤过液的HA效价经检测为零，说明该装置具有良好的严谨性，病毒的截留率为100%。表2-2:浓缩后四次冲洗液的HA效价<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>AIV10200由表2-2可知，两次等压冲洗的样品中皆可检测到HA效价，特别是第一次等压冲洗样品的HA效价接近于浓縮前病毒液。因此可在浓縮后用适量无菌水等压冲洗两次，冲洗液回收利用，提高病毒的回收率；反洗及反顶洗样品中未能检测到HA效价，证明反洗及反顶洗液中无病毒或极少病毒存在，可在洗涤后弃去。表2-3:病毒浓缩倍数与其体积变化的关系<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2-3结果显示，病毒的浓縮倍数与浓縮前后病毒液的体积变化及HA效价变化呈直线的线性关系，可以在实际生产中根据排放液与原液体积的比例关系或HA效价的变化来确定浓缩倍数。表2-4:病毒液灭活前后浓缩效果比较<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2-4结果表明，在病毒灭活前和灭活后进行浓縮，对于浓縮效果没有影响，因此，在疫苗研制过程中可根据不同病毒的特性和保存条件以及疫苗的生产工艺选择浓縮时机。2.2免疫对比试验免疫后不同时间血清HI抗体水平检测结果见表2-5。表2-5结果显示，浓縮疫苗免疫后，抗体产生速度要比非浓縮疫苗组快；而且在免疫后的同一吋期，浓縮疫苗免疫组抗体水平明显高于非浓缩疫苗组，表明浓縮疫苗的免疫效果要优于非浓縮疫苗。根据其抗体下降趋势分析，不难看出该疫苗具有更长的免疫持续期。表2-5:浓縮疫苗和非浓缩疫苗免疫效果比较<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>_非浓縮疫苗_2____6.93、小结与讨论3.1由表2-l、表2-2结果可知，应用中孔纤维超滤器可对NDV、IBV和AIV进行有效浓缩，其病毒的截留率为100%，通过对等压冲洗液回收利用，理论上可100%回收病毒，因此，该系统具有很高的病毒回收率。此外，该系统浓縮10000ml病毒液所需时间不超过20min，表明该设备具有较高的浓縮效率，可用于大规模病毒抗原的浓縮工艺。3.2免疫对比试验结果显示，与非浓縮疫苗组相比，浓縮疫苗免疫后，机体产生抗体速度更快，免疫后4周检测抗体，NDHI抗体水平由浓縮前的8.01og2上升到10.1og2，IBHI抗体水平由6.51og2上升到8.51og2，均达到21og2以上；AIHI抗体水平由7.51og2上升到S.91og2，明显高于非浓縮疫苗组，表明浓縮疫苗的免疫效果要优于非浓縮疫苗。根据其抗体下降趋势分析，不难看出该疫苗具有更长的免疫持续期。因此，研究的病毒抗原浓縮技术完全可用于多联疫苗生产中病毒抗原的浓縮，具有很好的应用价值。权利要求1、一种病毒抗原的浓缩技术，使用于鸡ND-IB-AI-EDS四联油乳剂灭活疫苗制备过程。2、根据权利要求1所述鸡ND-IB-AI-EDS四联油乳剂灭活疫苗抗原浓縮技术，其特征在于本方法用于新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、H9亚型禽流感病毒(AIV)的抗原浓縮。3、根据权利要求1所述的鸡ND-IB-AI-EDS四联油乳剂灭活疫苗抗原浓縮技术，其特征在于包括了粗滤、精滤、超滤、收料四个步骤。4、根据权利要求书3所述的病毒抗原浓縮技术，其特征在于在病毒抗原浓縮前，加入了预过滤过程即粗滤程序，选用300目的铜网，过滤出病毒液中残留的组织或细胞团块。5、根据权利要求书3所述的病毒抗原浓縮技术，其特征在于精滤过程中将滤液压入到一级滤柱内，过滤出病毒液中残留的大分子量的蛋白质等物质。6、根据权利要求书3所述的病毒抗原浓縮技术，其特征在于超滤过程选用40KD截流分子量的中空纤维超滤装置用于三种病毒成分的浓縮。选用该截留分子量的中空纤维膜既可阻挡病毒液中的病毒粒子透过中空纤维膜，又不会因截留分子量过小影响病毒液浓縮的效率。7、根据权利要求1所述的病毒抗原浓縮技术，其特征在于该技术除用于鸡ND-IB-AI-EDS四联油乳剂灭活疫苗制备外，还可用于新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、H9亚型禽流感病毒(AIV)任意两种以上病毒联苗的制备。全文摘要本发明提供了鸡ND-IB-AI-EDS四联油乳剂灭活疫苗制备过程中病毒抗原的浓缩技术。该方法的主要内容为将鸡新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、H9亚型禽流感病毒(AIV)分别通过内压式中空纤维超滤器，经过了粗滤、精滤、超滤、收料四个步骤进行浓缩，浓缩后的三种病毒抗原与减蛋下降综合症病毒(EDSV)混合，用于鸡ND-IB-AI-EDS四联油乳剂灭活疫苗制备。文档编号A61K9/107GK101181240SQ20061012940公开日2008年5月21日申请日期2006年11月14日优先权日2006年11月14日发明者丁伯良,健张,莉张,李秀丽,王英珍,鄢明华申请人:天津市畜牧兽医研究所