专利名称：血清学h-y抗原基因dby抗体制备及其xy精子免疫分选法的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种血清学H-Y抗原基因DBY重组抗原肽，及其血清学H-Y抗原基因DBY抗体制备和XY精子免疫分选法。
背景技术：
雄性特异性弱组织相容性抗原(Malespecific minor histompatibilityantigens, H_Y抗原)最初发现是作为一种异性间移植抗原，为雄性动物特有的物质，在雄性个体中无组织和器官特异性。随着研究的深入，人们发现H-Y抗原是糖蛋白，存在于雄性哺乳动物细胞表面。H-Y抗体在哺乳动物性别鉴定和控制的理论和实践研究上具有重要意义，国内外多个实验室生产了 H-Y抗原抗血清及单克隆抗体，并进行了胚胎的性别鉴定和控制，但由于其抗原的特异性较弱和复杂性，抗体实际应用效果不理想，未能在生产中得到广泛应用。雄性传递偏移现象和性别偏移现象的发生证明了 X和Y精子间存在非共享蛋白(Hendriksen et al.，1996)，同时血清学H-Y抗原部分抗原表位的成功鉴定、X和Y精子免疫学分离实验结果以及Y精子特异性蛋白的检测结果都为X和Y精子膜蛋白差异的存在提供了间接的证据(Grant et al., 2008;Robbins et al., 2008;Zhang et al.，2008)。Blecher等(1999)用色谱柱得到相对保守的牛精子性别特异性蛋白(Sex specificproteins, SSPs),研究发现SSPs抗体可引起约 半数的牛精子凝集,未凝集精子体外受精，生产出90%以上雄性胚胎；Souza等(1999)纯化并产生了一个针对19kDa的牛精子膜蛋白的单克隆抗体，流式细胞仪分析显示结合约60%的精子，免疫组化仅有雄性组织被染色。然而，到目前为止，仍未见用上述法产生性别控制后代的实际应用研究报道。利用H-Y抗原进行胚胎早期性别鉴定和精子的分离应用于生产研究。无论是应用免疫技术分离X精子与Y精子，还是进行胚胎的性别鉴定，都必须依赖高纯度、高效价的特异H-Y抗体。早期研究已分别采用雄性动物细胞免疫雌性动物的方法和单克隆抗体技术来制备H-Y抗体，但其特异性不强，且操作繁琐。H-Y抗体纯度低、效价不高，这些都限制了 H-Y抗体的应用及H-Y抗原的研究。Y精子的血清学H-Y抗原是一弱自身组织抗原，这为H-Y抗原候选蛋白和抗体的筛选带来了挑战，借助基因序列信息和生物信息学技术来筛选血清学H-Y抗原的候选抗原表位，为血清学H-Y抗体的研究提供了新技术途径。DBY基因为血清学H-Y抗原的候选基因之一，定位于Y染色体短臂末梢AZFa区域Xpll.3-11.23，含有17个外显子，编码660个氨基酸残基，为ATP依赖性RNA解螺旋酶，是DEAD-Box (天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸序列)RNA解旋酶基因家族成员之一。DBY的转录子仅在雄性胚胎细胞中检测到，在胚胎性腺发育17.5天DBY基因表达水平达到最高峰，出生后有所降低，但在成年雄性性腺中仍维持较低水平；可育小鼠精子中，DBYmRNA被选择性保留，并且在受精时通过反转录聚合酶链反应转移到卵子内，在雄性小鼠合子早期受精卵发育中起重要作用。同时DBY基因编码一个仅在睾丸中表达的短转录子，由此推断DBY在精子发生过程中起重要作用。
由于DBY基因与X染色体上的对应基因Dbx有较高的同源性，这为DBY特异性抗体的制备带来很大的难度。利用生物信息学方法分析DBY与DBX间的同源性，去掉高度同源序列区域，在序列差异区域选择DBY特异性抗原表位为特异性抗体的制备提供了新的思路。在本发明中我们通过选取具有代表性和应运广泛性的几个软件模型来研究DBY蛋白的线性B细胞表位，全面分析了 DBY蛋白的生物特性。分别进行跨膜区分析和序列比对去除同源区，利用在线软件预测获得优选序列区域，最后用独立软件进一步筛选，综合评价得出抗原肽序列。小鼠DBY蛋白的空间构象相关信息还没有公布，而没有分析其构象表位，所以在DBY抗原肽筛选中我们选取了 3段序列，用于下游实验抗原肽表达的参考。
发明内容
本发明的目的是提供一种DBY重组抗原肽，及其基于血清学H-Y抗原基因DBY的抗原表位抗体的制备方法和XY精子免疫分选法。一种DBY重组抗原肽，包含以下三段蛋白序列:DBY-1KSSDNQNGGGNTESKGRYIPPHLRNRETSKGVCDKDSSGWSCSKDKDAY
SSFGSRDSRGKPNYFSDRGSGSRGRFDDHGRNDYDGIGGRDRTGFGKFERSGHSRffSDRSDEDDffSKDBY-1ISIHGDRSQKDREEALHQFRSGRKPILVATDBY-1II
SRGRSKSRFSGGFGARDYRQSSGSANAGFNSNRANSSRSSGSSHNRGFGGGGYGGFY剛DGYGGNYNSQAVDffffGN。一种DBY重组抗原肽，蛋白序列如下:KSSDNQNGGGN TESKGRYIPPHLRNRET SKGVCDKDSSGWSCSKDKDAYSSFGSRDSRGKPNYFSDRGSGSRGRFDDHGRNDYDGIGGRDRTGFGKFER
SGHSRffSDRSDEDDffSKPLPACTSIHGDRSQKDREEALHQFRSGRKPILVATAVAAGSSRGRSKSRFSGGFGARDYRQSSGSANAGFNSNRANSSRSSGSSHNRGFGGGGYGGFYNNDGYGGNYNSQAVDffffGN。血清学H-Y抗原基因DBY抗体制备方法，是以上述的重组抗原肽为抗原免疫试验动物，获得多克隆抗体。所述的重组抗原肽的制备过程如下:提取雄性小鼠脑组织中总RNA，再用逆转录合成cDNA第一链，设计特异性引物
DBV-1 -F5、GCCK〕AAnCGACC-似
DBY-1 -R5’-CCGGAGCTCTGGTTTTGTCATC-3，
DBY Il-F5:-GGCGAGCTCTTTC'AAGTATGCG'
DBY [1-R5,-GGGTCG ACC ACTA A ACTTTCG-r
DB^IIl-F5’-CGGTCGACGGACGTTAGCAGA-3’
DBY-1l 1-R5 -G C G A A Cj CTTA C CAA ATGTTGTGo '，将3段DBY抗原肽核酸片段扩增出来；将抗原肽核酸片段分别克隆进入pMD18_T载体，筛选阳性质粒，经双酶切(见表I)后，将DBY1、DBY2和DBY3核酸片段用T4连接酶连接后克隆入pET-32a表达载体中，筛选出阳性克隆质粒pET-32a-DBY，然后进行原核表达，获得的DBY重组抗原肽进行纯化。XY精子免疫分选法，以上述制备的抗体与动物精子进行免疫反应,来鉴别或者分离X和Y精子。所述的动物精子包括小鼠的精子。本发明的创新性在于:精子分离需要X和Y精子之间存在可检测的差异，到目前为止，只有利用DNA结合的染料直接检测DNA含量的流式细胞分离X和Y精子是行之有效的方法，在牛性别选择方面得到商业应用(准确度可达90%以上)。但使用流式细胞仪作为性别选择常规工具应用于动物育种是相对低效的，因为每单位时间内产生的精子是有限的，性别控制精液的精子数量比正常精液低，；需要价格昂贵的专门设备(Seidel，2003)、专利授权和操作高度熟练的的技术人员(Hendriksen，1999)，此法未得到广泛应用。而且精子在分离、后续的处理、保存、使用等阶段都可能受到许多因素(高度稀释、核染色、机械高压、激光照射、离心、冷冻等)的损害，使得分离精子活力、精液的密度等精子的常规性状受到影响，导致牛性控后代出现个体差异(Rath et al.2009,陆阳清，2005, Spinaciet al.，2006; Berme jo-人丨varezet al., 2008) 0免疫学分选方法可避免或减少与DNA含量检测有关的影响。本发明探求X和Y精子表面的特异性标记蛋白的序列和结构信息，首次利用Y精子特异性表面抗原(血清学检测H-Y抗原复合物)的候选基因DBY抗原表位制备抗体，建立了简单、高效的X和Y精子免疫学分选法。
图1为pET-32a_DBY诱导表达结果图；1:37°C , Oh ；2:37°C，Ih ；3:37°C,3h ；4:37°C,6h 沉淀；5:37°C,6h 上清；6:30°C,6h 沉淀；7:30°C,6h 上清；图2为DBY多肽抗血清与雌鼠脾细胞进行细胞免疫荧光反应结果(200倍)；图3为DBY多肽抗血清与雄鼠脾细胞进行细胞免疫荧光反应结果(200倍)；图4为小鼠精子细胞免疫荧光反应统计结果；图5为DBY多肽抗血清与小鼠精子反应结果。
具体实施例方式以下结合具体实施方式
进一步说明本发明，而非限制本发明。1、DBY抗原肽的生物信息学预测和筛选利用DNAStar 软件 PROTEAN program (Gamier-Robson program)、在线蛋白质分析工具 ABCpred servers(http://www.1mtech.res, in/raghava/abcpred/)、BepiPredl.0servers (http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred)等生物信息学技术，分别从蛋白质跨膜区、一级结构同源性、二级结构、亲水性、可塑性、表面可极性以及抗原指数等方面，综合分析DBY蛋白全序列的结构特性，同时我们对DBY蛋白进行跨膜区预测。雄性个体的DBY与雌性个体的DBX进行序列比对，去除冗余序列和同源的重复序列进一步缩小预测范围。最后结合在线线性B细胞软件预测结果筛选出3段DBY抗原肽序列(DBY-1，DBY-1I，DBY-1II，见序列表)。2、DBY抗原肽的原核表达利用Trizol法提取雄性小鼠脑组织中总RNA,再用逆转录试剂盒合成cDNA第一链，根据3段DBY抗原肽序列(DBY-1 ,DBY-1I，DBY-1II)设计特异性引物(见表1)，将3段DBY抗原肽核酸片段扩增出来。将抗原肽核酸片段分别克隆进入PMD18-T载体(大连宝生物工程有限公司)，提取重组质粒进行PCR鉴定和测序验证。然后用原核表达载体pET-32a(大连宝生物工程有限公司)，进行原核表达，获得的DBY抗原肽(见序列表)用His纯化试剂盒进行纯化。表IDBY抗原肽引物设计结果
权利要求
1.一种DBY重组抗原肽，其特征在于，包含以下三段蛋白序列:DBY-1KSSDNQNGGGNTESKGRYIPPHLRNRETSKGVCDKDSSGWSCSKDKDAYSSFGSRDSRGKPNYFSDRGSGSRGRFDDHGRNDYDGIGGRDRTGFGKFERSGHSRffSDRSDEDDffSKDBY-1ISIHGDRSQKDREEALHQFRSGRKPILVATDBY-1IISRGRSKSRFSGGFGARDYRQSSGSANAGFNSNRANSSRSSGSSHNRGFGGGGYGGFYNNDGYGGNYNSQAVDffffGN。
2.—种DBY重组抗原肽，其特征在于，蛋白序列如下: KSSDNQNGGGNTESKGRYIPPHLRNRETSKGVCDKDSSGWSCSKDKDAY SSFGSRDSRGKPNYFSDRGSGSRGRFDDHGRNDYDGIGGRDRTGFGKFER SGHSRffSDRSDEDDffSKPLPACTSIHGDRSQKDREEALHQFRSGRKPILV ATAVAAGSSRGRSKSRFSGGFGARDYRQSSGSANAGFNSNRANSSRSSGS SHNRGFGGGGYGGFY剛DGYGGNYNSQAVDffffGN0
3.血清学H-Y抗原基因DBY抗体制备方法，其特征在于， 以权利要求2所述的重组抗原肽为 抗原免疫试验动物，获得多克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于， 所述的重组抗原肽的制备过程如下: 提取雄性小鼠脑组织中总RNA，再用逆转录合成cDNA第一链，设计特异性引物 DBY-1-F5,-GCGGAATTCGA€CTGAAAGAT-3,DBY-1 -R5' -C'CGGAGC-1 (:' IGGTTTTGTC'/VIC'-.3:DBY I1-F55-GGCGAGCTCTTTCAAGTATGCG-3’DBY [1-R5 '-GGGTCGACCACTAAACTTTCG-31DBY-1I1-F5’-CGGTCGACGGACGTTAGCAGA-3’ BV-1ll-R5 ■■(；( (i A A (i('iIA( ('A A AK.'I i(i Ki " ，将3段DBY抗原肽核酸片段扩增出来；将抗原肽核酸片段分别克隆进入PMD18-T载体，筛选阳性质粒，经双酶切后，将DBY1、DBY2和DBY3核酸片段用T4连接酶连接后克隆入pET-32a表达载体中，筛选出阳性克隆质粒 pET-32a-DBY,然后进行原核表达，获得的DBY重组抗原肽进行纯化。
5.XY精子免疫分选法，其特征在于，以权利要求3或4制备的抗体与动物精子进行免疫反应，来鉴别或者分离X和Y精子。
6.根据权利要求5所述的免疫分选法，其特征在于，所述的动物精子包括小鼠的精子。
全文摘要
本发明公开了血清学H-Y抗原基因DBY抗体制备及其XY精子免疫分选法。利用生物信息学方法预测并筛选出血清学H-Y抗原基因DBY的3个B细胞表位抗原肽，连接、重组、原核表达，得到了高纯度的DBY重组抗原肽。以重组抗原肽为抗原免疫新西兰大白兔，获得效价高、特异性强的多克隆抗体。利用DBY抗体结合流式细胞技术分选出约63.2±4.5%精子。本发明建立了以血清学H-Y抗原基因DBY抗体为基础的X和Y精子的免疫分选法，利用该抗体来分离X和Y精子，可建立简单、高效、安全的性别选择的理想方法，可更好地控制种用品种(或品种)的遗传改良，获得更快的遗传进展和畜牧业生产与管理的效率优势。
文档编号C07K16/40GK103114079SQ20131002877
公开日2013年5月22日 申请日期2013年1月25日 优先权日2013年1月25日
发明者王乃东, 谭庆辉, 薛立群, 袁安文, 许道军 申请人:湖南农业大学