本发明涉及一种动物布鲁氏菌病的诊断方法——布鲁氏菌荧光偏振(FPA)检测试剂盒，属生物制品检测技术领域。
背景技术：
布鲁氏菌病(Brucellosis)简称布病，是由布鲁氏菌引起的以感染家畜为主的人畜共患传染病。本病不但对动物的繁殖和生产性能具有严重危害，更重要的是，人感染布鲁氏菌后，往往难以治愈，从而造成严重的公共卫生问题。目前全世界范围内消除该病的主要方法是扑杀与免疫相结合，所以建立快速准确的诊断方法对防治和清除布病非常必要。
布鲁氏菌抗体检测常用血清学方法有虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)、补体结合试验(CFT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和荧光偏振试验(FPA)。其中SAT因特异性不高，通常认为不适合国际贸易检测；RBT、CFT和ELISA为国际贸易指定试验；FPA为国际贸易选择试验。FPA利用生物物理学方法实现了对疾病的快速检测，其基本原理是荧光物质经单一平面的蓝偏振光(485nm)照射后，吸收光能跃入激发态，随后回复至基态，并发出单一平面的偏振荧光(525nm)。偏振荧光的强弱程度与荧光分子的大小呈正相关，与其受激发时转动的速度呈反相关。本发明中，我们在布鲁氏菌O链多糖(OPS)上标记荧光素分子(FITC)，当布鲁氏菌特异性抗体与抗原结合形成抗原/抗体复合物后，分子量变大，此时检测到的荧光偏振程度也较高，当检测到的偏振强度值超过cutoff值时，即判为布病阳性，反之为阴性。到时相对于ELISA方法，FPA特具有更高的检测效率，并具有良好的特异性和敏感性；另外，其试验操作也比ELISA简单，特别适合于对大量样品的检测，在布鲁氏菌血清学检测中有特定的优势。
本申请人在成功开发了牛布病间接ELISA试剂盒、动物布病竞争ELISA试剂盒和布鲁氏菌抗体检测试纸条的基础上，又开发成功了布鲁氏菌荧光偏振检测试剂盒。
技术实现要素：
本发明的目的在于建立了一种布鲁氏菌抗体高通量检测技术。其核心是将提纯的光滑型布鲁氏菌O链脂多糖(OPS)标记上异硫氰酸荧光素，经精确定量后用作检测抗原。以人工免疫健康牛制备阳性血清，以健康非免疫牛血清作阴性血清，及25×样品稀释液等组分组装而成，用于检测多种动物血清中的光滑型布鲁氏菌抗体。
本发明的技术方案
1.一种布鲁氏菌荧光偏振检测试剂盒，其特征在于该试剂盒由布鲁氏菌荧光标记抗原OPS、布鲁氏菌阳性对照血清、阴性对照血清和样品稀释液组成。
2.如权利要求1所述一种布鲁氏菌荧光偏振检测试剂盒，其特征在于其中的布鲁氏菌荧光标记抗原OPS是检测布鲁氏菌抗体的荧光标记光滑型布鲁氏菌S2株脂多糖的小分子片段，该OPS对常见的布鲁氏菌病原抗体均具有良好的特异性和敏感性。
3.权利要求1所述的布鲁氏菌荧光偏振检测试剂盒的应用，该可检测多种动物血清中的布鲁氏菌特异性抗体，即该试剂盒能对猪、牛、羊的布鲁氏菌病进行高通量快速检测。
本发明具体实施方式
布鲁氏菌荧光偏振检测试剂盒。通过对标记抗原、反应条件、结果判断标准等多方面条件的优化，特别是对阳性血清的效价进行了精确标定，比较理想地解决了布鲁氏菌荧光偏振试验诊断方法中特异性、敏感性、重复性、保存期、操作方便性等问题。本专利中使用了异硫氰酸荧光素(FITC)标记光滑型布鲁氏菌O链脂多糖小分子片段(OPS)，作为抗原。基于FPA的实验原理，该试剂盒能对多种动物进行布病检测，同时能检测血清中的IgG和IgM类抗体，因此该试剂盒在敏感性方面具有更明显的优势。
在本发明实施过程中，为了客观评价试剂盒的特异性和敏感性，将近6年收集的343份田间牛、羊的血清样本，经虎红凝集试验初筛后，再用试管凝集试验和补体结合试验检测，剔除了部分检测结果不一致的样本，共确定了148份布病阳性血清(其中牛血清70份，羊血清78份)，155份布病阴性血清(其中牛血清82份，羊血清73份)。本发明开发的试剂盒，与已确认的148份布病阳性血清样本的符合率为98.0％(145/148)，与已确认的155份阴性样本的符合率为98.7％(153/155)，由此确定试剂盒对田间样本的敏感性为98.0％，特异性为98.7％，显示了试剂盒诊断结果的可靠性。
本发明所述的布鲁氏菌荧光偏振检测试剂盒，选取猪种布鲁氏菌S2株作为OPS提取的生产菌种，在常规提取OPS方法的基础上，增加了蛋白酶K消化和浓缩步骤，提高了OPS浓度和纯度。具体技术方案如下：
1.OPS提取
(1)将灭活菌悬液以10000g离心20min，收集沉淀。称量并计算菌体湿重，将菌体湿重按1:8(W/V)比例加入2％(V/V)醋酸中，121℃高压灭菌15min。4℃以10000g离心20min去除菌体碎片。
(2)在上清液中加入终浓度为5％的三氯乙酸，室温搅拌15min后，4℃10000g离心10min，弃去沉淀。加入一定量的蛋白酶K，使其终浓度达50μg/ml，置56℃水浴消化2小时。
(3)上清液置100倍蒸馏水透析过夜，用PEG8000浓缩40倍，再次置于蒸馏水透析过夜，收集透析袋内容物，分装成2ml/瓶冻干保存，此即提纯的OPS。
2.建立了FITC-OPS分子标记方法
(1)将4mg OPS加入到2ml 0.5％(V/V)的三乙胺溶液中，置冰上超声处理15min，超声后加入200μl 100mmol/L的EDTA溶液，并用10μl 1mol/L的盐酸将溶液pH调为5.0。
(2)取20mg FITC(异构体I)溶解于800μl 0.25mol/L硼酸溶液(pH10.5)中，然后全部加入到OPS溶液中，继续超声处理1min。加入1ml 1.6％脱氧胆酸钠溶液，37℃搅拌孵育18小时。
(3)4℃10000g离心30min，将上清液转移到透析袋中用PEG6000浓缩，随后用PBS透析1小时，将透析物用PD-10柱脱盐，收集所有FITC-OPS标记物，合并后用PEG6000再浓缩，最后再用PBS透析1小时，收集透析后产物4℃保存，即为标记抗原原液。
3.FPA试剂盒阳性血清的效价标定
(1)用布鲁氏菌虎红平板凝集试验、试管凝集试验和补体结合试验对临床表现健康的2岁左右成年牛进行检测，筛选布病抗体阴性牛。
(2)将布鲁氏菌参考强毒株M28灭活抗原以5×1010CFU/牛颈部皮下免疫，3个月后双倍剂量加强免疫1次。加强免疫后2周采血。
(3)用试管凝集试验测定凝集效价，当效价超过800IU/ml时，静脉放血，分离血清。根据实际测定的效价，用牛布病阴性血清将其效价稀释至320IU/mL，用0.45μm滤器过滤除菌，作为试剂盒中布病阳性血清。
4.PFA试剂盒的特异性和敏感性评价
(1)将2009～2015年间课题组收集的343份田间牛、羊的血清样本，分别用虎红平板凝集试验和试管凝集试验检测，将两种方法均检测为阳性的血清样本和均检测为阴性的样本再用补体结合试验确认，选择三种方法全为阳性的血清作为阳性参考血清，三种方法全为阴性的血清作为阴性参考血清。
(2)用筛选出的148份确定为布病阳性的血清(其中牛血清70份，羊血清78份)和155份布病阴性血清(其中牛血清82份，羊血清73份)作为待检血清，评价试剂盒的敏感性和特异性。
附图说明
图1猪种布鲁氏菌S2的PCR鉴定鉴定图图中1:DNA Marker；2:大肠杆菌阴性对照；3:S2菌株的PCR扩增。
本发明微生物资源信息
本发明所涉及的微生物为：猪种布鲁氏菌(Brucella suis)S2株(CVCC70502)，来自国家兽医微生物菌种保藏中心，系猪种布鲁氏菌生物1型，是布鲁氏菌病弱毒活疫苗株。羊种布鲁氏菌(Brucella melitensis)M28株(CVCC70003)，来自国家兽医微生物菌种保藏中心，系羊种布鲁氏菌生物1型，是布鲁氏菌病活疫苗效力评价检验用强毒参考株。两个菌株均由北京市海淀区中关村南大街8号中国兽医药品监察所中国兽医微生物菌种保藏管理中心鉴定、保管和供应(请见中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录(第二版)，中国农业科学技术出版社，2002年，p35，p32)。
本发明的优点
本发明涉及布鲁氏菌荧光偏振(FPA)检测试剂盒。本发明使用了异硫氰酸荧光素(FITC)标记光滑型布鲁氏菌O链脂多糖小分子片段(OPS)，作为抗原。基于FPA的实验原理，该试剂盒能对多种动物进行布病检测，同时能检测血清中的IgG和IgM类抗体，因此该试剂盒在敏感性方面具有更明显的优势；本发明通过对主要试剂配方的改进和优化，特别是对阳性血清的效价进行了精确标定，有效提高了试剂盒的敏感性和特异性，敏感性、重复性、保存期、操作方便性等问题，大大缩短了高通量检测所需的时间，本发明为我国布鲁氏菌病诊断提供了新型高效的检测方法。
实施例
以下实施例为进一步明本发明，不构成对本发明请求保护的技术方案的限制。
实施例1
——抗原制备用菌种(猪种布鲁氏菌S2株，B.suisS2)的质量标准。
1.菌落形态菌落边缘整齐、圆润，露滴状，斜光照射，逆光观察微带蓝色乳光。
2.染色形态为球杆菌，单个散在，不形成芽孢和荚膜。大小在0.6～2.5μm之间。革兰氏染色为阴性，柯氏染色为红色。
3.纯粹检验按现行《中国兽药典》(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一〇年版三部，中国农业出版社，2011，以下称《中国兽药典》)附录进行，应纯粹。
4.特异性检验
(1)血清学特异性以培养物制成抗原，与光滑型布鲁氏菌阳性血清应出现凝集，与粗糙型血清不出现凝集。
(2)PCR特异性合成如下4条引物，将其配成引物混合储存液，各引物浓度均为25μM。
Feri：5’-GCGCCGCGAA GAACTTATCA A-3’ 21(序列1)
Reri:5’-CGCCATGTTA GCGGCGGTGA-3’ 20(序列2)
Fsuis：5’-GCGCGGTTTT CTGAAGGTTC AGG-3’ 23(序列3)
RIS711:5’-TGCCGATCAC TTAAGGGCCT TCAT-3’ 24(序列4)
模板S2培养菌落或试剂盒提取的S2基因组DNA。
PCR反应体系50μL的反应体系中，含5μL 10×Buffer，8μL2.5mMdNTPs，混合引物储存液2μL，Taq酶2U，模板DNA 1μL(或挑取菌落少许)。
PCR反应程序：95℃5min后，按94℃1min、60℃1.5min、72℃1.5min进行28个循环，最后72℃10min。
结果：扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳鉴定，应出现2条特异性PCR条带，大小分别为178bp和285bp(见附图1)。
实施例2
——本申请检测用抗原OPS的提纯和标记方法
1.菌悬液制备 将鉴定合格的B.suisS2株二级种子接种于胰眎琼脂扁瓶中，37℃培养48小时后，每瓶加入含有0.5％苯酚的生理盐水20ml浸泡菌体表面10min以上，洗下培养物，收集于无菌玻璃瓶中。
2.菌液灭活及灭活检验 将收集好的菌悬液加热到80℃，维持120min，待其自然冷却后，存于4℃。对灭活菌液应进行灭活检验。取灭活菌液0.1ml涂布胰眎琼脂或TSA平板，37℃培养7天，不应无菌生长。
3.OPS的提纯将灭活检验合格的菌悬液以10000g离心20min，收集沉淀。称量并计算菌体湿重，将菌体湿重按1:8(W/V)比例加入2％(V/V)醋酸中，充分混匀后，121℃高压灭菌15min。冷却后4℃10000g离心20min去除菌体碎片。在上清液中加入终浓度为5％的三氯乙酸，室温搅拌15min后，4℃10000g离心10min，弃去沉淀。加入一定量的蛋白酶K，使其终浓度达50μg/ml，置56℃水浴消化2小时。将上清液置100倍蒸馏水中透析过夜，用PEG8000浓缩40倍后，再次置于蒸馏水透析过夜，收集透析袋内容物，分装成2ml/瓶冻干保存，此即提纯的OPS。
4.OPS的标记取4mg OPS加入到2ml 0.5％(V/V)的三乙胺溶液中，置冰上超声处理15min，超声后加入200μl 100mmol/L的EDTA溶液，并用10μl 1mol/L的盐酸将溶液PH调为5.0。取20mg FITC(异构体I)溶解于800μl 0.25mol/L硼酸溶液(PH10.5)中，然后全部加入到OPS溶液中，继续超声处理1min。加入1ml 1.6％脱氧胆酸钠溶液，37℃搅拌孵育18小时。4℃10000g离心30min，将上清液转移到透析袋中用PEG6000浓缩，随后用PBS透析1小时，将透析物用PD-10柱脱盐，收集所有FITC-OPS标记物，合并后用PEG6000再浓缩，最后再用PBS透析1小时，收集透析后产物4℃保存，即为标记抗原原液。
实施例3
——本申请试剂盒中阴性对照血清和阳性对照血清的制备与检验标准
1.阴性对照血清的制备
(1)动物用虎红平板凝集试验、试管凝集试验和补体结合试验均检测为布鲁氏菌抗体阴性的2周岁左右、性成熟的健康牛。
(2)血清制备颈静脉采血，分离血清，用0.45μm滤器过滤除菌，收集的血清加入0.05％proclin300防腐，无菌分装，检验合格后，-20℃保存备用。
2.阴性对照血清的检验
(1)性状橙黄或淡黄色澄清液体。
(2)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
(3)特异性检验经虎红平板凝集试验、试管凝集试验和补体结合试验检验应均为阴性。将制备的阴性对照血清作为待检血清，进行FPA检测，其70<mP<95。
3.阳性对照血清的制备
(1)动物筛选用布鲁氏菌虎红平板凝集试验、试管凝集试验和补体结合试验对临床表现健康的2周岁左右、性成熟的健康牛进行检测，筛选布病抗体阴性牛。
(2)血清制备将布鲁氏菌参考强毒株M28灭活抗原制成菌悬液，以5×1010CFU/牛颈部皮下免疫，3个月后双倍剂量加强免疫1次。加强免疫后2周采血。用试管凝集试验测定凝集效价，当效价超过800IU/ml时，静脉放血，分离血清。根据实际测定的效价，用牛布病阴性血清将其效价稀释至320IU/mL，用0.45μm滤器过滤除菌，加入proclin 300至终浓度为0.05％，-20℃保存备用，作为试剂盒中布病阳性血清。
4.阳性对照血清的检验
(1)性状 橙黄或淡黄色澄清液体。
(2)无菌检验 按《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
(3)效价测定 采用试管凝集试验测定阳性对照血清的效价，应为1:320。将制备的阳性对照血清作为待检血清，进行FPA检测，其120<mP<250。将阳性对照血清用阴性对照血清进行1:64稀释作为待检血清，进行FPA检测，计算△mP，应不低于20。
实施例4
——试剂盒其它组分的制备和检验标准
1.标记抗原的制备及检验
(1)标记抗原的制备标记抗原原液用抗原保护剂(商品化)稀释至250、500、1000、2000倍，随着抗原浓度的降低，FPA检测的敏感性逐步提高，当标记抗原作1:1000倍稀释时，FPA检测方法的敏感性为5IU/ml，与ELISA方法和布鲁氏菌抗体检测试纸条敏感性一致，因此确定最佳抗原稀释浓度。稀释抗原即为FPA试剂盒标记抗原，于4℃棕色瓶避光保存。
(2)检验
1)性状无色透明液体。
2)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
2.25×样品稀释液的配制及检验
(1)配制称取Na2HPO4·12H2O 6.25g，NaH2PO4·2H2O 87.5g，NaCl212.5g，Tween-20 12.5ml，蔗糖125g，加去离子水至800ml，调pH值7.2～7.6，定容至1000ml。加入proclin 300溶液使其终浓度为0.05％，过滤除菌后，无菌分装。
(2)检验
1)性状为无色透明液体。
2)无菌检验 按《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
3)pH值应为7.2～7.6。
实施例5
——布鲁氏菌荧光偏振试剂盒(FPA)稀释液的选择
分别选用碳酸盐缓冲液、PBST和含0.5％蔗糖的磷酸缓冲液作为样品稀释液，进行FPA试验，阳性血清反应△mP值最高者作为效果最好的稀释液。结果通过对3种包被液的比较，表明含0.5％蔗糖的磷酸缓冲液作为稀释液的稀释效果最好(结果见表1)。
表1 3种稀释液FPA结果比较
注：△mP＝样品的mP—阴性血清mP的平均值
实施例6
——布鲁氏菌荧光偏振(FPA)检测试剂盒阳性对照血清的制备
用布鲁氏菌虎红平板凝集试验、试管凝集试验和补体结合试验对临床表现健康的2周岁左右成年牛进行检测，筛选布病抗体阴性牛。对筛选的阴性牛用布鲁氏菌参考强毒株M28灭活抗原制成菌悬液，以5×1010CFU/牛颈部皮下免疫，3个月后双倍剂量加强免疫1次。加强免疫后2周采血。用试管凝集试验测定凝集效价，当效价超过800IU/ml时，静脉放血，分离血清。根据实际测定的效价，用牛布病阴性血清将其效价稀释至320IU/mL，用0.45μm滤器过滤除菌，加入proclin 300至终浓度为0.05％，-20℃保存备用，作为试剂盒中布病阳性血清。
1.布病阴性羊筛选
采用虎红平板凝集试验、试管凝集试验及补体结合试验对临床试验牛进行检测，选择三种方法均检测为阴性的牛作为制备阳性血清的候选牛。结果试验中选择了编号为912、936、963的三份血清检测，结果见表2。3份待检血清样品与虎红抗原均无凝集颗粒出现，呈均匀浑浊，判为布病抗体阴性。对照阳性血清与虎红抗原呈明显凝集颗粒，液体几乎完全透明。试管凝集试验中3份待检血清样品4个不同稀释度(1:50、1:100、1:200、1:400)结果均为阴性。补体试验中3份待检血清样品均100％溶血，判为布病抗体阴性。
表2 三种不同方法对待检血清的检测结果
注：(1)虎红平板凝集试验结果说明：++++：出现大的凝集片或颗粒，液体完全透明；+++：有明显的凝集颗粒，液体几乎完全透明；++：有较明显的凝集颗粒，液体稍透明；+：稍能见到凝集，液体混浊；—：无凝集，液体均匀混浊。
(2)试管凝集试验结果说明：4+：菌体完全凝集和沉淀，液体100％清亮；3+：菌体几乎完全凝集和沉淀，液体75％清亮；2+：有显著的凝集和沉淀，液体50％清亮；1+：有清楚可见的凝集和沉淀，液体25％清亮；—：无凝集和沉淀，液体菌液混浊。
(3)补体结合试验结果说明：P：阳性；N：阴性。
2.免疫
免疫一般只需进行两次。初免：用2ml布鲁氏菌M28灭活抗原(5×1010CFU/ml)颈部皮下免疫布病阴性的牛。加强免疫：初免3个月后，双倍剂量颈部皮下加强免疫1次。加强免疫后2周采血，用试管凝集试验测定凝集效价应不低于1:800。若效价达不到标准，继续加强免疫1～2次，15日后再试血，直至效价合格。本发明912、936号和963号牛进行二次免疫后采用试管凝集试验测定的效价分别为1:900、1:1000、1:1200。
3.血清制备
二免14日后采血，测定试管凝集效价，进一步用阴性对照血清将分离的阳性血清按比例稀释到预期效价为1:320，加入ProClin 300(SUPELCO公司)至终浓度为0.05％，无菌分装，作为待检阳性对照血清。
4.检验
对制备完成的阳性对照血清按如下项目进行检验：
(1)性状观察血清制品色泽为淡黄或微红色澄明液体。
(2)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，为无菌生长。
(3)效价测定将血清作1:140，1:150，1:160，1:170，1:180稀释进行试管凝集试验，测定其效价。将制备的血清1:64稀释作为待检血清，进行FPA检测，计算△mP，应不低于20。
实施例6
——试剂盒敏感性试验
1.稀释的布鲁氏菌抗体阳性对照血清的灵敏度试验
将布鲁氏菌抗体阳性对照血清进行2倍梯度稀释后，用3批实验室自制试剂盒进行检测，确定该试剂盒对梯度稀释的阳性对照血清的灵敏度，结果见表3。由表3可见，3批FPA试剂盒检测梯度稀释阳性对照血清的结果一致，血清效价均检测至1:64倍(△mP值≥20)。
表3 对梯度稀释的阳性对照血清的灵敏度检测
注：布鲁氏菌荧光偏振(FPA)检测试剂盒的判定标准为：样本△mP≥20时，布鲁氏菌抗体阳性(标为“+”)；样本△mP值<20时，为布鲁氏菌抗体阴性(标为“－”)。
2.对已知阳性样本的敏感性试验
采用3批布鲁氏菌荧光偏振(FPA)检测试剂盒对148份布病阳性血清(其中牛血清70份，羊血清78份)进行检测，布病阳性血清样本的符合率均为98.0％(145/148)，结果见表4和表5，显示了试剂盒较高的敏感性及诊断结果的可靠性。
表4 对已知阳性样本的敏感性检测
注：布鲁氏菌荧光偏振(FPA)检测试剂盒的判定标准为：样本△mP≥20时，布鲁氏菌抗体阳性(标为“+”)；样本△mP值<20时，为布鲁氏菌抗体阴性(标为“－”)。
表5 对已知阳性血清的敏感性分析
附注：
——FPA方法使用说明
1用法
1.1样品处理取动物全血，待血液凝固后，以4000r/min离心10min，收集上清，血清应清亮，无溶血。
1.2 1×样品稀释液的配制使用前，将25×样品稀释液恢复至室温(20～25℃)，并摇动，使结晶溶解(可在37℃水浴中加热5～10min)，然后用去离子水作1:25稀释，充分混匀。
1.3操作步骤
1.3.1取反应板，将待检血清、阳性对照血清和阴性对照血清分别加入到ELISA板中，20μl/孔，其中阳性对照血清加1孔(孔1)和阴性对照血清各加3孔(孔2、孔3、孔4)。加样过程要注意避免产生气泡。
1.3.2每孔加180μl样品稀释液，充分混匀；室温下孵育反应板3～5min后读取每孔的空白值。
1.3.3每孔立即加入10μl荧光标记抗原，充分混匀；室温下孵育反应板3～5min后读取每孔偏振值。
2结果判定
2.1计算公式：偏振值(△mP)＝(样品mP—阴性对照mP平均值)
2.2试验成立条件：3个阴性对照血清重复测定孔的值均应在70～95mP；1个阳性对照血清孔的值应在120～250mP，试验成立。
2.3结果判定：当血清样本的△mP≥20mP时，为布鲁氏菌病抗体阳性；当血清样本的△mP＜20mP时，为布鲁氏菌病抗体阴性。
序列表
<110> 中国兽医药品监察所
<120> 布鲁氏菌荧光偏振（FPA）检测试剂盒
<130>
<160> 4
<170> Patentin version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：引物Feri
<400> 1
GCGCCGCGAA GAACTTATCA A 21（序列1）
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：引物Reri
<400> 2
CGCCATGTTA GCGGCGGTGA 20（序列2）
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：引物Fsuis
<400> 3
GCGCGGTTTT CTGAAGGTTC AGG 23（序列3）
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：引物RIS711
<400> 4
TGCCGATCAC TTAAGGGCCT TCAT 24（序列4）
1