一种用于免疫活性肽免疫活性检测的荧光偏振分析方法与流程

本发明属于分析检测领域，涉及一种功能性成分的活性检测方法，具体来说是一种用于免疫活性肽免疫活性检测的荧光偏振方法。

背景技术：

免疫活性肽通常是指外源性基因重组或人工化学合成的耐受原表位肽或变构肽。作为一种短肽，免疫活性肽具有来源广、活性高、稳定性强的特点，在功能性食品、保健品及医疗药品等领域中有着广大的应用前景。目前，免疫活性肽绝大部分来源于天然产物，在这些免疫活性肽的筛选过程中，淋巴细胞增殖法是常用的免疫活性检测方法。该法操作过程繁琐，检测时间长，灵敏度低，检测结果受到淋巴细胞来源、操作人员专业水平及操作环境等诸多因素的干扰，因而迫切需要发展一种更加简单且准确的。

近年来的研究发现，免疫活性肽存在不同的抗原表位，当免疫活性肽被抗原提呈细胞(apc)识别时，这些表位能与apc表面的mhc类分子发生特异性结合，形成mhc类分子-免疫活性肽复合物，该复合物与t细胞表面受体(tcr)分子发生特异性结合，进而激活自身反应性t淋巴细胞的免疫应答，使其活化、增殖。

技术实现要素：

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种用于免疫活性肽免疫活性检测的荧光偏振方法，所述的这种用于免疫活性肽免疫活性检测的荧光偏振方法要解决现有技术中检测免疫活性肽免疫活性的方法操作过程繁琐，检测时间长，灵敏度低的技术问题。

本发明提供了一种用于免疫活性肽免疫活性检测的荧光偏振方法，其特征在于包括如下步骤：

1)一个确定流感病毒荧光标记物工作浓度的步骤，用100mmol/l、ph5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液按5倍比例稀释流感病毒荧光标记物，取200μl于96孔板中，37℃孵育72h，用spectramaxm5酶标仪在吸收波长为492nm，发射波长为520nm下检测荧光偏振光强度，以达到稳定偏振值所对应的最小浓度作为流感病毒荧光标记物的工作浓度；

2)一个确定hla-drb4复合蛋白工作浓度的步骤，用100mmol/l、ph5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液按1:2、1:4、1:8、1:80和1:800的比例稀释hla-drb4复合蛋白溶液；取100μlhla-drb4复合蛋白溶液于96孔板，然后加入流感病毒荧光标记物和100mmol/l、ph5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，使流感病毒荧光标记物终浓度为步骤(1)确定的工作浓度，同时使得96孔板中的体积为200ul；将反应溶液混匀后于37℃孵育72min，用spectramaxm5酶标仪在吸收波长为492nm、发射波长为520nm的条件下检测荧光偏振光强度，以最大偏振值60％对应的hla-drb4复合蛋白浓度作为其最佳工作浓度；

3)一个建立免疫活性肽的结合率曲线的步骤，以流感病毒素浓度为横坐标，结合率为纵坐标建立免疫活性肽的结合率曲线，结合率的计算公式如下：

式中：fp样品为待检测样品的荧光偏振值，fp标记肽为流感病毒荧光标记物标记肽对应的荧光偏振值，fp无竞争为流感病毒荧光标记物荧光标记肽和hla-drb4复合蛋白的荧光偏振值；

4)一个制备免疫活性肽样品的步骤，称取200mgii型胶原蛋白，加双蒸水配置成1mg/ml的溶液，置于温度为50℃的酶反应器中，按加酶量为80u/ml加入中性蛋白酶酶解3h，蛋白酶的酶活为10000u/g，收集酶解液，将酶解液于40℃、100rpm的旋转蒸发仪中浓缩；使其终浓度为4mg/ml；

5)一个检测免疫活性肽免疫活性的步骤，将浓度为4mg/ml的免疫活性肽样品用双蒸水按100倍稀释倍数稀释成系列浓度，取总体积为200μl的溶液，该溶液中含有50μl的流感病毒荧光标记物、50μl的hla-drb4复合蛋白溶液以及100μl的免疫活性肽溶液，所述的流感病毒荧光标记物的浓度符合步骤1)的结果，所述的hla-drb4复合蛋白溶液的浓度符合步骤2)的结果，将该溶液置于96孔板中，混匀后37℃孵育72min，再用spectramaxm5酶标仪在吸收波长为492nm、发射波长为520nm下检测其荧光偏振光强度，然后计算免疫活性肽ic50值，其中，ic50值定义为在竞争性试验中结合率为50％时的免疫活性肽的浓度。

本发明根据mhc类分子能与免疫活性肽特异性结合的原理，提出了一种用于免疫活性肽免疫活性检测的荧光偏振免疫分析法。荧光偏振免疫分析法(fluorescencepolarizationimmunoassay，fpia)是一种定量免疫分析技术，其基本原理是荧光物质经单一平面的蓝偏振光(485nm)照射后，吸收光能跃入激发态，随后回复至基态，并发出单一平面的偏振荧光。

本发明利用流行感冒病毒偶联fitc荧光素合成荧光标记物，并以该荧光标记物为竞争物，使其与待测免疫活性肽竞争性地与hla-drb4复合蛋白结合，通过对结合率的计算建立了免疫活性肽活性的的荧光偏振定量检测方法。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明建立的免疫活性肽免疫活性的荧光偏振免疫分析方法，为免疫活性肽的高效筛选及制备的提供了一种可靠的分析手段。该法对免疫活性肽免疫活性检测的ic50为98.32ng/ml，线形范围为9.82～9985.43ng/ml(ic20-ic80)，具有较高的灵敏度。本发明的方法具有快速、简便、高效及可靠的优点，本发明的方法只需要加样，无需分离和洗涤操作。国内外尚未有关于采用荧光偏振免疫分析法检测免疫活性肽免疫活性的方法。

附图说明

图1是用荧光偏振法建立的流感病毒素的结合率曲线。

图2是用荧光偏振法建立的免疫活性肽结合率曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。另外，本发明采用的原料均为市场上可以购买的物质。

实施例1

流感病毒荧光标记物工作浓度的确定，具体步骤为：

用100mmol/l、ph5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液按5倍比例稀释流感病毒荧光标记物(购自于南京肽业生物科技有限公司)，取200μl于96孔板中，37℃孵育72h，用spectramaxm5酶标仪在吸收波长为492nm，发射波长为520nm下检测其荧光偏振光强度。当偏振值达到稳定后，所对应的流感病毒荧光标记物的最小浓度为5μm，以此作为流感病毒荧光标记物的工作浓度。

实施例2

mhc工作浓度的确定，具体步骤为：

用100mmol/l、ph5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液按1:2、1:4、1:8、1:80和1:800的比例稀释hla-drb4复合蛋白溶液(购自于武汉三鹰生物技术有限公司)；取100μlhla-drb4复合蛋白溶液于96孔板，再加入同等体积的流感病毒荧光标记物，使流感病毒荧光标记物终浓度为步骤(1)确定的工作浓度；将反应溶液混匀后于37℃孵育72min，用spectramaxm5酶标仪在吸收波长为492nm、发射波长为520nm的条件下检测其荧光偏振光强度。当荧光偏振光强度达到最大偏振值的60％时，对应的hla-drb4复合蛋白浓度为125nm，此即为hla-drb4复合蛋白的最佳工作浓度。见附图1。

实施例3

建立免疫活性肽的结合率曲线：以流感病毒素浓度为横坐标，结合率为纵坐标建立免疫活性肽的结合率曲线。结合率的计算公式如下：

式中：fp样品为待检测样品的荧光偏振值，fp标记肽为流感病毒荧光标记物标记肽对应的荧光偏振值，fp无竞争为流感病毒荧光标记物荧光标记肽和hla-drb4复合蛋白的荧光偏振值。

实施例4

免疫活性肽样品的制备：称取200mgii型胶原蛋白，加双蒸水配置成1mg/ml的溶液，置于温度为50℃的酶反应器中。按加酶量为80u/ml加入中性蛋白酶(购于国药集团化学试剂有限公司，酶活为10000u/g)酶解3h，收集酶解液。将酶解液于40℃、100rpm的旋转蒸发仪中浓缩。

实施例5

免疫活性肽免疫活性的检测，具体步骤如下：

将浓度为4mg/ml的免疫活性肽用双蒸水按100倍稀释倍数稀释成系列浓度。取总体积为200μl的溶液，该溶液中含有50μl浓度为5μm的流感病毒荧光标记物、50μl浓度为125nm的hla-drb4复合蛋白溶液以及100μl的免疫活性肽溶液。将该溶液置于96孔板中，混匀后37℃孵育72min，再用spectramaxm5酶标仪在吸收波长为492nm、发射波长为520nm下检测其荧光偏振光强度。以双蒸水作为空白对照。计算ic50值，ic50值定义为在竞争性试验中结合率为50％时的免疫活性肽的浓度。结果表明免疫活性肽的ic50＝64.36ng/ml。见附图2。