一种非直观弱光场超分辨成像测量系统和方法与流程

本发明属于显微光学成像技术领域，特别是一种非直观弱光场超分辨成像测量系统和方法。

背景技术：

在现有显微成像领域，传统光学显微受衍射极限影响，分辨率被限制在100nm左右。分辨率最高的是以电子和离子等非光学信息为载体的显微技术，如扫描电子显微镜（sem）与原子力显微镜（afm）等，能实现0.1nm级分辨，而扫描隧道显微镜（stm）则能实现0.01nm级分辨。但是，这些高分辨显微技术都有测量效率低、环境适应性差、易对试样造成损伤、制造和使用价格高等问题，满足不了脱氧核糖核酸（dna）测序、集成电路光刻和纳米材料检测等实际工程需要，而这些恰恰是传统宽场光学显微的优势。具有纳米级分辨率，能够提供快速、简便、廉价等功能与价值的宽物场、远像场的光学显微技术是现代纳米工程尚未实现的追求。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种低成本、高效率、高敏感和高分辨率的非直观弱光场超分辨成像测量系统和方法。

实现本发明目的的技术解决方案为：一种非直观弱光场超分辨成像测量系统和方法，通过两个垂直的偏振片使得其构成的腔体内的光线极其微弱来实现所谓的弱光场，防止不同光子之间的湮灭效应。另外，通过旋转整个光场，来观察光场中的某些被测试样对弱光场的响应，根据被测试样的响应，比如说在每个像素里面获得的变化曲线，通过对变化曲线或响应的本征拟合，从而能获得被测试样对不同光子的状态的改变，利用每一个光场点的改变的不同，形成非直观参数的灰度差，最终形成图像。由于这个图像大量的消除了衍射效应，从而使得这个图像本身具有超分辨的功能。系统装置包括计算机、电机驱动器、显微镜模块，其中显微镜模块包括相机、检偏器、透射起偏器、反射起偏器和微型电机模块，其中透射起偏器设置于显微镜透射光路的灯室前，透射起偏器的前方设置反射镜，样品位于反射镜和物镜之间，反射起偏器设置于显微镜反射光路的灯室前，反射起偏器的前方设置分束镜，分束镜与相机之间设置检偏器，该检偏器与透射起偏器、反射起偏器在微型电机模块的控制下进行旋转，微型电机模块在电机驱动器的驱动下工作，所述电机驱动器在计算机的控制下工作，所述分束镜同时位于检偏器与显微镜的物镜之间，相机与计算机连接，将检测到的信息传输给计算机；

反射情况下，显微镜反射光路的灯室发出的光线通过反射起偏器调制后由分束镜反射后通过显微镜的物镜照射到样品上，经样品反射后的光线依次通过显微镜的物镜、分束镜、检偏器后由相机采集；

透射情况下，显微镜透射光路的灯室发出的光线通过透射起偏器调制后由反射镜反射后照射到样品上，透过样品的光线依次通过显微镜的物镜、分束镜、检偏器后由相机采集；

相机所采集的带有不同偏振信息的图输入计算机进行处理，从而获得待测样品的非直观图像。

优选地，所述所述反射起偏器（10）、透射起偏器（9）和检偏器（4）由微型电机模块（13）控制实现三者同步转动，转动精度达到0.02°。

优选地，所述透射起偏器（9）与检偏器（4）始终保持正交偏振状态。

优选地，所述反射起偏器（10）与检偏器（4）始终保持正交偏振状态。

优选地，所述反射起偏器（10）、透射起偏器（9）和检偏器（4）均为可见光波段的线偏振片。

一种基于权利要求1所述的非直观弱光场超分辨成像测量系统和方法，其特征在于，反射光路步骤如下：

步骤1、将样品（7）置于显微镜的载物台上；

步骤2、打开显微镜反射光路的灯室（12）对载物台上的样品（7）进行照明，利用相机（3）获得一幅光强图片，作为未被处理的原始图像并输入计算机（1）；

步骤3、通过电机驱动器（2）驱动微型电机（13）控制反射起偏器（10）与检偏器（4）进行同步周期性的转动，每转动固定角度，通过相机（3）采集图像，获得多幅光强图并输入计算机（1）；

步骤4、计算机（1）根据输入的光强图确定光强图的相位差和方位角；

步骤5、利用步骤4所得相位差、方位角的值分别形成灰度图像，所述灰度图像中每点的灰度值代表相位差或方位角的大小，对不同颜色进行赋值形成假彩色图像，调整成像的对比度获得样品的相位差非直观图像、方位角非直观图像；

步骤6、根据相位差、方位角，通过mueller矩阵确定stokes参量并进行stokes参数非直观成像。

一种基于权利要求1所述的非直观弱光场超分辨成像测量系统和方法，其特征在于，透射光路步骤如下：

步骤1、将样品（7）置于显微镜的载物台上；

步骤2、打开显微镜透射光路的灯室（11）对载物台上的样品（7）进行照明，利用相机（3）获得一幅光强图片，作为未被处理的原始图像并输入计算机（1）；

步骤3、通过电机驱动器（2）驱动微型电机（13）控制透射起偏器（9）与检偏器（4）进行同步周期性的转动，每转动固定角度，通过相机（3）采集图像，获得多幅光强图并输入计算机（1）；

步骤4、计算机（1）根据输入的光强图确定光强图的相位差和方位角；

步骤5、利用步骤4所得相位差、方位角的值分别形成灰度图像，所述灰度图像中每点的灰度值代表相位差或方位角的大小，对不同颜色进行赋值形成假彩色图像，调整成像的对比度获得样品的相位差非直观图像、方位角非直观图像；

步骤6、根据相位差、方位角，通过mueller矩阵确定stokes参量并进行stokes参数非直观成像。

进一步的步骤3所述电机驱动器（2）驱动微型电机（13）控制透射起偏器（9）与检偏器（4）进行同步周期性的转动可以通过周期性转动样品（7）来替代起偏器与检偏器的同步周期性转动。

进一步的步骤6所述根据相位差、方位角，通过mueller矩阵确定stokes参量并进行stokes参数非直观成像，所采用的公式为：

式中，是像素点所在每幅图的平均光强信息，是相位差，是方位角，

是stokes参量的四个参数。

本发明与现有的技术相比，主要显著的有点为：（1）成本低：本发明的成本较低，主要是由光学元件构成，一台显微镜，多个偏振器件，一台计算机，一个电机组成，视场较大，不需要扫描。（2）高分辨率：由于该方法采用了非直观成像方法，利用偏振参数成像，通过计算多幅图像，对点扩散函数进行瘦身，从而绕开了衍射极限，获得高分辨率的假彩色图像。（3）高效率：本发明采用的是光学成像方法，成像速度快，获得各种偏振态下的图像过程可控制在5分钟以内。（4）高敏感：采用弱光场测量技术，能够对样品的更多细节信息成像。

附图说明

图1是本发明非直观弱光场超分辨成像测量系统的结构示意图。

图2是本发明实施实例中皮肤细胞样品的普通显微镜直接成像效果图。

图3是本发明实施实例中皮肤细胞样品的弱光场非直观显微成像相位差效果图。

图4是本发明实施实例中皮肤细胞样品的弱光场非直观显微成像方位角效果图。

图5是本发明实施实例中皮肤细胞样品的弱光场非直观显微成像去偏效果图。

图6是本发明实施实例中皮肤细胞样品的弱光场非直观显微成像s0效果图。

图7是本发明实施实例中皮肤细胞样品的弱光场非直观显微成像s1效果图。

图8是本发明实施实例中皮肤细胞样品的弱光场非直观显微成像s2效果图。

图9是本发明实施实例中皮肤细胞样品的弱光场非直观显微成像s3效果图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细说明。

本发明利用弱光场偏振调制对样品形貌结构进行分析，通过两个垂直的偏振片使得其构成的腔体内的光线极其微弱来实现所谓的弱光场，防止不同光子之间的湮灭效应。另外，通过旋转整个光场，来观察光场中的某些被测试样对弱光场的响应，根据被测试样的响应，比如说在每个像素里面获得的变化曲线，通过对变化曲线或响应的本征拟合，从而能获得被测试样对不同光子的状态的改变，利用每一个光场点的改变的不同，形成非直观参数的灰度差，最终形成图像。非直观弱光场超分辨成像测量系统的优势在于图像大量的消除了衍射效应，从而使得这个图像本身具有超分辨的功能。。该装置主要是依据一台普通的显微镜进行改造，所以大大降低了装置的设计难度。

包括依次连接的计算机（1）、电机驱动器（2）和显微镜模块，所述显微镜模块包括相机（3）、检偏器（4）、透射起偏器（9）、反射起偏器（10）和微型电机模块（13），其中透射起偏器（9）设置于显微镜透射光路的灯室（11）前，透射起偏器（9）的前方设置反射镜（8），样品（7）位于反射镜（8）和物镜（6）之间，反射起偏器（10）设置于显微镜反射光路的灯室（12）前，反射起偏器（10）的前方设置分束镜（5），分束镜（5）与相机（3）之间设置检偏器（4），该检偏器（4）与透射起偏器（9）、反射起偏器（10）在微型电机模块（13）的控制下进行旋转，微型电机模块（13）在电机驱动器（2）的驱动下工作，所述电机驱动器（2）在计算机（1）的控制下工作，所述分束镜（5）同时位于检偏器（4）与显微镜的物镜（6）之间，相机（3）与计算机（1）连接，将检测到的信息传输给计算机（1）；

反射情况下，显微镜反射光路的灯室（12）发出的光线通过反射起偏器（10）调制后由分束镜（5）反射后通过显微镜的物镜（6）照射到样品（7）上，经样品（7）反射后的光线依次通过金相显微镜的物镜（6）、分束镜（5）、检偏器（4）后由相机（3）采集；

透射情况下，显微镜透射光路的灯室（11）发出的光线通过透射起偏器（9）调制后由反射镜（8）反射后照射到样品（7）上，透过样品（7）的光线依次通过显微镜的物镜（6）、分束镜（5）、检偏器（4）后由相机（3）采集；

所述反射起偏器（10）、透射起偏器（9）和检偏器（4）由微型电机模块（13）控制实现三者同步转动，转动精度达到0.02°。

所述透射起偏器（9）与检偏器（4）始终保持正交偏振状态。

所述反射起偏器（10）与检偏器（4）始终保持正交偏振状态。

所述反射起偏器（10）、透射起偏器（9）和检偏器（4）均为可见光波段的线偏振片。

非直观弱光场算法的基本原理是：通过两个垂直的偏振片使得其构成的腔体内的光线极其微弱来实现所谓的弱光场，防止不同光子之间的湮灭效应。另外，通过旋转整个光场，来观察光场中的某些被测试样对弱光场的响应，根据被测试样的响应，比如说在每个像素里面获得的变化曲线，通过对变化曲线或响应的本征拟合，从而能获得被测试样对不同光子的状态的改变，利用每一个光场点的改变的不同，形成非直观参数的灰度差，最终形成图像。由于这个图像大量的消除了衍射效应，从而使得这个图像本身具有超分辨的功能。

一种基于权利要求1所述的非直观弱光场超分辨成像测量系统和方法，其特征在于，反射光路步骤如下：

步骤1、将样品（7）置于显微镜的载物台上；

步骤2、打开显微镜反射光路的灯室（12）对载物台上的样品（7）进行照明，利用相机（3）获得一幅光强图片，作为未被处理的原始图像并输入计算机（1）；

步骤3、通过电机驱动器（2）驱动微型电机（13）控制反射起偏器（10）与检偏器（4）进行同步周期性的转动，每转动固定角度，通过相机（3）采集图像，获得多幅光强图并输入计算机（1）；

步骤4、计算机（1）根据输入的光强图确定光强图的相位差和方位角；

步骤5、利用步骤4所得相位差、方位角的值分别形成灰度图像，所述灰度图像中每点的灰度值代表相位差或方位角的大小，对不同颜色进行赋值形成假彩色图像，调整成像的对比度获得样品的相位差非直观图像、方位角非直观图像；

步骤6、根据相位差、方位角，通过mueller矩阵确定stokes参量并进行stokes参数非直观成像。

一种基于权利要求1所述的非直观弱光场超分辨成像测量系统和方法，其特征在于，透射光路步骤如下：

步骤1、将样品（7）置于显微镜的载物台上；

步骤2、打开显微镜透射光路的灯室（11）对载物台上的样品（7）进行照明，利用相机（3）获得一幅光强图片，作为未被处理的原始图像并输入计算机（1）；

步骤3、通过电机驱动器（2）驱动微型电机（13）控制透射起偏器（9）与检偏器（4）进行同步周期性的转动，每转动固定角度，通过相机（3）采集图像，获得多幅光强图并输入计算机（1）；

步骤4、计算机（1）根据输入的光强图确定光强图的相位差和方位角；

步骤5、利用步骤4所得相位差、方位角的值分别形成灰度图像，所述灰度图像中每点的灰度值代表相位差或方位角的大小，对不同颜色进行赋值形成假彩色图像，调整成像的对比度获得样品的相位差非直观图像、方位角非直观图像；

步骤6、根据相位差、方位角，通过mueller矩阵确定stokes参量并进行stokes参数非直观成像。

根据权利要求6和权利要求7所述的非直观弱光场超分辨成像测量系统和方法，其特征在于，步骤3所述电机驱动器（2）驱动微型电机（13）控制透射起偏器（9）与检偏器（4）进行同步周期性的转动可以通过周期性转动样品（7）来替代起偏器与检偏器的同步周期性转动。

根据权利要求6和权利要求7所述的非直观弱光场超分辨成像测量系统和方法，其特征在于，步骤6所述根据相位差、方位角，通过mueller矩阵确定stokes参量并进行stokes参数非直观成像，所采用的公式为：

式中，是像素点所在每幅图的平均光强信息，是相位差，是方位角，

是stokes参量的四个参数。

本发明是利用弱光场正交偏振调制成像。通过两个垂直的偏振片使得其构成的腔体内的光线极其微弱来实现所谓的弱光场，防止不同光子之间的湮灭效应。另外，通过旋转整个光场，来观察光场中的某些被测试样对弱光场的响应，根据被测试样的响应，比如说在每个像素里面获得的变化曲线，通过对变化曲线或响应的本征拟合，从而能获得被测试样对不同光子的状态的改变，利用每一个光场点的改变的不同，形成非直观参数的灰度差，最终形成图像。与直接利用远场的光强进行成像相比，由于这个图像大量的消除了衍射效应，从而使得这个图像本身具有超分辨的功能，且偏振参数对于物体结构各项异性的变化更加的灵敏。因此，本发明提供了一种新的弱光场光学显微成像的方法，该方法基于非直观参数成像技术，突破了衍射极限，获得了高分辨率图像。

综合检测方法和所采用的微型电机模组，微型能够快速而精确的控制起偏器与检偏器的进行同步旋转与定位，从而实现持续正交偏振状态的精确调制，且提高了成像的分辨率，该方法的优势是不需要进行扫描，大大提高了成像效率并降低了成本。

综上，本发明主要有四大优势：（1）低成本，（2）高效率，（3）高分辨，（4）高敏感。

实施例1

下面结合附图详细介绍该发明装置和实现对样品进行光波参数成像的步骤。

（1）结合附图详细介绍该发明装置：

结合图1，本发明是利用弱光场非直观光波参数图进行样品结构分析的装置，包括依次连接的计算机（1）、电机驱动器（2）和显微镜模块，所述显微镜模块包括相机（3）、检偏器（4）、透射起偏器（9）、反射起偏器（10）和微型电机模块（13），其中透射起偏器（9）设置于显微镜透射光路的灯室（11）前，透射起偏器（9）的前方设置反射镜（8），样品（7）位于反射镜（8）和物镜（6）之间，反射起偏器（10）设置于显微镜反射光路的灯室（12）前，反射起偏器（10）的前方设置分束镜（5），分束镜（5）与相机（3）之间设置检偏器（4），该检偏器（4）与透射起偏器（9）、反射起偏器（10）在微型电机模块（13）的控制下进行旋转，微型电机模块（13）在电机驱动器（2）的驱动下工作，所述电机驱动器（2）在计算机（1）的控制下工作，所述分束镜（5）同时位于检偏器（4）与显微镜的物镜（6）之间，相机（3）与计算机（1）连接，将检测到的信息传输给计算机（1）；其中所述反射起偏器（10）、透射起偏器（9）和检偏器（4）由微型电机模块（13）控制实现三者同步转动，转动精度达到0.02°。所述透射起偏器（9）与检偏器（4）始终保持正交偏振状态。所述反射起偏器（10）与检偏器（4）始终保持正交偏振状态。所述反射起偏器（10）、透射起偏器（9）和检偏器（4）均为可见光波段的线偏振片。

反射情况下，显微镜反射光路的灯室（12）发出的光线通过反射起偏器（10）调制后由分束镜（5）反射后通过显微镜的物镜（6）照射到样品（7）上，经样品（7）反射后的光线依次通过显微镜的物镜（6）、分束镜（5）、检偏器（4）后由相机（3）采集；

透射情况下，显微镜透射光路的灯室（11）发出的光线通过透射起偏器（9）调制后由反射镜（8）反射后照射到样品（7）上，透过样品（7）的光线依次通过显微镜的物镜（6）、分束镜（5）、检偏器（4）后由ccd相机（3）采集；

（2）实现对该装置的弱光场光波参数成像方法的反射光路具体步骤如下：

步骤1、将样品（7）置于显微镜的载物台上；

步骤2、打开显微镜反射光路的灯室（12）对载物台上的样品（7）进行照明，利用相机（3）获得一幅光强图片，作为未被处理的原始图像并输入计算机（1）；

步骤3、通过电机驱动器（2）驱动微型电机（13）控制反射起偏器（10）与检偏器（4）进行同步周期性的转动，每转动固定角度，通过相机（3）采集图像，获得多幅光强图并输入计算机（1）；

步骤4、计算机（1）根据输入的光强图确定光强图的相位差和方位角；

步骤5、利用步骤4所得相位差、方位角的值分别形成灰度图像，所述灰度图像中每点的灰度值代表相位差或方位角的大小，对不同颜色进行赋值形成假彩色图像，调整成像的对比度获得样品的相位差非直观图像、方位角非直观图像，如图3、图4和图5所示；

步骤6、根据相位差、方位角，通过mueller矩阵确定stokes参量并进行stokes参数非直观成像，如图6、图7、图8和图9所示。

（3）实现对该装置的弱光场光波参数成像方法的透射光路具体步骤如下：

步骤1、将样品（7）置于显微镜的载物台上；

步骤2、打开显微镜透射光路的灯室（11）对载物台上的样品（7）进行照明，利用ccd相机（3）获得一幅光强图片，作为未被处理的原始图像并输入计算机（1）；

步骤3、通过电机驱动器（2）驱动微型电机（13）控制透射起偏器（9）与检偏器（4）进行同步周期性的转动，每转动固定角度，通过ccd相机（3）采集图像，获得多幅光强图并输入计算机（1）；

步骤4、计算机（1）根据输入的光强图确定光强图的相位差和方位角；

步骤5、利用步骤4所得相位差、方位角的值分别形成灰度图像，所述灰度图像中每点的灰度值代表相位差或方位角的大小，对不同颜色进行赋值形成假彩色图像，调整成像的对比度获得样品的相位差非直观图像、方位角非直观图像；

步骤6、根据相位差、方位角，通过mueller矩阵确定stokes参量并进行stokes参数非直观成像。

根据权利要求6和权利要求7所述的非直观弱光场超分辨成像测量系统和方法，其特征在于，步骤3所述电机驱动器（2）驱动微型电机（13）控制透射起偏器（9）与检偏器（4）进行同步周期性的转动可以通过周期性转动样品（7）来替代起偏器与检偏器的同步周期性转动。

根据权利要求6和权利要求7所述的非直观弱光场超分辨成像测量系统和方法，其特征在于，步骤6所述根据相位差、方位角，通过mueller矩阵确定stokes参量并进行stokes参数非直观成像，所采用的公式为：

式中，是像素点所在每幅图的平均光强信息，是相位差，是方位角，

是stokes参量的四个参数。

综上，本发明通过在普通的显微镜的改造，增加了弱光场非直观光波参数成像的核心部件，通过多次测量正交偏振态下的光强图，反演计算获得分辨率比原光强图更好的效果图，同时由于非直观算法对于散射光更加的敏感。相较于传统的显微光学成像器械具有成本低，敏感度高，效率高、分辨率高的优势。