猫弓形虫血清抗体的Dot‑ELISA快速检测试剂盒的制作方法

本发明具体公开了一种猫弓形虫血清抗体的Dot-ELISA快速检测试剂盒，同时进一步提供了猫弓形虫血清抗体的Dot-ELISA快速检测试剂盒的制备方法，属于寄生虫检测方法技术领域。

背景技术：

弓形虫（Toxoplasmosis）是一种专性细胞内寄生的寄生虫，该病的宿主较为广泛，其中猫及猫科动物是该病的终末宿主。猫是自然界感染该病最普遍的动物，同时也是人类感染该病的重要的传染源。人群中免疫功能异常者，通常会出现继发疾病甚至造成患者死亡。孕妇感染弓形虫后，会出现流产、早产、产死胎等情况。

目前主要用于检测弓形虫抗体的方法有：补体结合试验（CT），间接血凝试验（IHA），乳胶凝集试验（LAT），碳粒凝集试验（CAT），间接免疫荧光试验（IFA），酶联免疫吸附试验（ELISA）等。

Dot-ELISA是在常规ELISA的基础之上，以NC膜代替聚乙烯酶标板而建立起的一种免疫学检测方法。Dot-ELISA不但保留了常规ELISA 的优点，还克服了常规ELISA抗原-抗体结合不牢固等缺点。常规ELISA方法检测，结果的判断需要借助仪器（酶标仪）。Dot-ELISA方法不需要借助仪器，只需肉眼观察，结果通过斑点颜色的出现和色泽深浅进行判定。Dot-ELISA灵敏性和特异性均高于常规ELISA，试验所需材料易获得、体积较小、可长期保存。这些特点为其以后的推广提供了可能。

技术实现要素：

本发明公开了一种猫弓形虫血清抗体的Dot-ELISA快速检测试剂盒，具有较高的灵敏性和特异性，不需要特殊的仪器，可进行大规模的血清样品的筛选，实际应用价值较大。

本发明将硝酸纤维素膜(NC)打孔后固定于96孔板内，将弓形虫SAG3蛋白包被于NC膜上，加入待检抗体与其发生反应，再通过加入酶标二抗使其形成抗原-抗体复合物。加入显色液，终止反应后对结果进行判断。如NC膜上斑点呈棕色则判定为阳性，无颜色变化的判定为阴性。应用重组抗原包被NC膜可延长保存时间。膜片可拆开单独保存，避免了NC膜的污染。

本发明所述的检测弓形虫血清抗体的间接Dot-ELISA试剂盒，其特征在于主要由以下部分组成：

主要包括包被抗原、包被液、封闭液、样品稀释液及洗涤液、辣根过氧化物酶标记的二抗、底物显色液、试验终止液、阳性参照血清、阴性参照血清、96孔可拆聚苯乙烯塑料反应板等。

包被抗原为弓形虫表面蛋白SAG3(蛋白浓度为1.2μg/μL)；包被液为0.05M碳酸盐缓冲液PH（9.6）；

封闭液为5%的脱脂奶粉；

样品稀释液及洗涤液为0.5% Tween-20的磷酸盐缓冲液（PBST）；

辣根过氧化物酶标记的二抗为山羊抗猫IgG；

底物显色液为TMB溶液；

终止液为2mol/L 的硫酸溶液（H₂SO₄）；

阳性参照血清及阴性参照血清。

本发明所述的检测猫弓形虫血清抗体的间接Dot-ELISA试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1）将处理好的NC膜用打孔器裁成合适大小，固定于96孔板的底部；

2）取2μL的SAG3蛋白包被在NC膜上，室温干燥或37℃温箱烘干，用50μL的5%的脱脂乳粉进行封闭，37℃温箱孵育1h；

3）PBST洗板3次每次5min，加入待检血清50μL,37℃孵育1h；

4）PBST洗板3次每次5min，加入酶标二抗50μL,37℃孵育1h；

5）PBST洗板3次每次5min，加入DAB显色液50μL，避光显色10-30分钟，随时观察颜色变化。加入蒸馏水终止反应。

本发明与现有技术相比，有益的效果在于：将NC膜裁剪成固定大小的膜片，利用重组蛋白对膜片进行包被，这样可以避免使用特殊仪器，具有省时、便捷的特点。本发明用斑点酶联免疫吸附法与常规酶联免疫吸附法进行比较，结果表明斑点酶联免疫吸附法的灵敏性高于常规方法。因其灵敏度较好进而试验的准确度较高。

本发明利用重组抗原包被NC膜，作为抗原的一种干燥保存形式，可延长抗原的保存时间。

本发明所用材料的成本较低，便于企业的生产，经济效益将较为可本观；本方法检测效率较高，可进行大规模的市场推广。对临床进行猫弓形虫病的普查具有较大的参考价值。

附图说明

图1为最佳血清稀释度结果图；

图2为最佳酶标二抗工作浓度结果图；

图3为最佳抗原工作浓度结果图；

图4为特异性试验结果图；

图5为敏感性试验结果图。

具体实施方式

下列实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明。

实施例1

间接Dot-ELISA前期样品的制备

（1）NC膜用蒸馏水浸泡20min。制成合适大小的圆形膜片，干燥后放入96孔板中，包被蛋白，加入5%的脱脂乳粉；封闭时间为1h;洗涤3次每次5min。

（2）抗原的制备：利用基因工程技术对弓形虫表面抗原SAG3基因进行表达、鉴定，最终获得弓形虫SAG3蛋白。

（3）用微量移液器取抗原混合物在NC膜中间进行点样，干燥后，5%的脱脂乳粉进行封闭；封闭后将NC膜至于PBST中进行洗涤，得到重组抗原包被的NC膜，也可称之为快速诊断膜片。阴凉干燥处储存备用；

一抗血清通过静脉采血后离心去上清；

（4）二抗为过氧化物酶标记的山羊抗猫IgG；

（5）将得到的抗原包被的NC膜置于96孔板中，每孔加入样品50μL，37℃温箱中孵育1h；

（6）将NC膜置于PBST中进行洗涤，3次，每次5min；

（7）加入HRP标记的山羊抗猫二抗IgG 50μL每孔，37℃温箱孵育1h;

（8）PBST进行洗涤3次，每次5min；

（9）加入DAB显色液，避光显色。蒸馏水中进行终止。

（10）结果判定，当NC膜上出现棕色斑点是可判定为阳性，无颜色变化判定为阴性。

实施例2：

间接Dot-ELISA方法的建立

1、待检血清最佳稀释度

取2μg弓形虫SAG3蛋白包被膜片，用PBST对阳性参照血清按1：100向后倍比稀释至1:25600，按实施例1进行试验，最终确定待检血清的最佳稀释度为1：1600。（见图1）

2、 HRP标记山羊抗猫IgG最佳工作浓度

将HRP标记的山羊抗猫IgG按照1:1000倍比稀释至1:7000，按照实施例1进行试验，最终确定最佳工作浓度为1：5000。（见图2）

3、包被抗原最佳工作浓度

判断标准按照阳性与阴性参照血清A450的比值及膜片的显色程度进行判断，最佳的抗原包被量为0.125μg/孔。（见图3）

4、性能的测定

（1）敏感性试验

将阳性参照血清由1:200倍比稀释至1:25600，观察膜片颜色变化，在阳性参照血清稀释至1：12800时，膜片仍有颜色，最终确定本试验的敏感性为1：12800。（见图4）

（2）特异性试验

猫弓形虫阳性及阴性参照血清、猫杯状病毒、猫传染性胃肠炎病毒进行试验，只有阳性参照血清出现颜色变化，其他未出现颜色变化。说明本试验方法特异性较强。（见图5）

（3）重复性试验

猫弓形虫参照血清进行不同批次的膜片的重复性试验，结果表明，本试验的重复性较好。

4、样品检测

间接血凝试验与间接Dot-ELISA试验检测猫血清96份，其中间接血凝试验检出54份阳性，间接Dot-ELISA检出60份阳性。

实施例3

检测猫弓形虫血清抗体间接ELISA试剂盒成份的组装

检测试剂盒包括以下组分：

1、弓形虫表面抗原SAG3蛋白（-20℃保存）；

2、包被液（0.05M碳酸盐缓冲液）PH（9.6）：秤取NaCO₃ 1.59g； NaHCO₃ 2.93g；蒸馏水 80mL，待其溶解后，调PH值9.6，定容至100 mL；

3、硝酸纤维素膜（NC）打孔后真空袋中保存；

4、封闭液：称取5g 脱脂奶粉加入PBST 溶解后定容至100mL；

5、洗涤液及样品稀释液(PBST)：称取 NaCl 8g；KCl 0.2g；NaHPO₄.12H₂O 2.9g；KH₂PO₄0.2g；吐温-20 0.5Ml；

6、TMB底物显色液：按底物A液（称取TMB 200mg，加入无水乙醇100mL，调PH值5.0，加双蒸水定容至1000mL），与底物B液（称取柠檬酸9.33g，Na₂HPO₄ 14.60g，加入6.4mL H₂O₂ ，调PH值5.0，加双蒸水定容至1000mL）1:1加入显色；

7、终止液 ： 吸取浓硫酸22.2mL后加入蒸馏水178.8mL；

8、阳性参照血清（-20℃）；

9、阴性参照血清（-20℃）；

以上材料便是本发明的所有组分。

保存条件：标准血清及蛋白为-20℃保存。其余组分的保存温度为4℃保存。