血清PSMD4蛋白的检测试剂盒及其检测方法与应用与流程

本发明属于免疫学和生物技术领域，具体涉及一种PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒及其检测方法与在多种恶性肿瘤(肺癌、胃癌和结直肠癌)血清学诊断以及肿瘤筛查中的应用。

背景技术：

癌症(cancer)泛指所有的恶性肿瘤。据世界卫生组织统计，全球癌症患者每年新增1400多万，中国成为世界上受癌症影响最严重的国家。中国大陆的癌症发病率几乎占了全球的一半。在中国范围内癌症在各种死因中也已经排在第二位，在城市则已经排在首位。其中肺癌病死率上升最快，已经排在恶性肿瘤死亡率中的第一位。其次是肝癌、胃癌和结直肠癌。令人担忧的是，未来10年，中国的癌症发病率与死亡率仍将继续攀升。因此，癌症的早期诊断对延长患者的生存时间和降低患者死亡率具有重要意义。

目前癌症的诊断主要依靠实验室检查、影像学检查以及病理检查相结合。但是影像学检查和病理检查都没有办法大规模筛选出早期癌症患者。而实验室检查则需要借助多种肿瘤免疫标志物检测来指导临床诊断。目前用于临床的肿瘤标志物有很多种，如AFP是肝癌最有诊断价值的指标，结肠癌的血清癌胚抗原(CEA)；胃癌的胃液硫糖蛋白(FSA)、胃癌相关抗原(GCAA)、前列腺癌的前列腺特异性抗原(PSA)等。但是据近年研究报道，各种肿瘤标志物都存在着容易漏诊和误诊的问题。目前临床还没有特异性好、敏感性高的肿瘤标志物可以用于多种癌症患者的大规模筛选。因此，临床仍需要高度敏感的恶性肿瘤特异标志物用于癌症患者的大规模人群的初步筛查，进而提高恶性肿瘤的早期诊断率。

恶性肿瘤血清标志物的研究一直是科学家们研究的重点，但大多数研究成果难以满足实际应用的需要。探索高敏感性及特异性的血清学指标尤为重要。

本发明中的研究对象—PSMD4蛋白，是一个蛋白酶体26S非ATP酶亚基 4(GeneID:5710)。该分子含有两段15个氨基酸的泛素相互作用模序(ubiquitin interactingmotif,UIM)，能够选择性结合泛素化蛋白，介导蛋白质降解。已有研究报道，PSMD4异常表达与炎症性肠病、溃疡性结肠炎等疾病相关，PSMD4在恶性肿瘤中的表达及生物学功能尚不十分清楚。有研究显示，PSMD4可能与细胞分化和机体发育有关(参见文献：Hamazaki,J.,et al.,Rpn10-mediated degradation of ubiquitinated proteins is essential for mouse development.Mol Cell Biol,2007.27(19):p.6629-38)。我们发现PSMD4是一个重要的癌蛋白，并且可以释放入血。本申请人已就PSMD4作为肝癌预后诊断标志物的新用途申请了中国专利CN201310005491.4，发明名称为“PSMD4蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用”，公开号为CN103091493A。

目前尚无文献报道在肿瘤病人血清样品中准确检测到PSMD4蛋白；也尚无针对肿瘤病人血清样品中PSMD4蛋白含量提供一种准确、简便、灵敏度高的检测手段；也尚无文献报道PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒以及该类试剂盒在肿瘤血清学诊断和筛查中的应用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒；本发明的另一目的是提供利用上述试剂盒的检测方法；本发明的第三目的是提供上述试剂盒在多种恶性肿瘤(如肺癌、胃癌、结直肠癌等)血清学诊断和筛查中的应用。

本发明旨在为临床和实验室多种恶性肿瘤血清样品中PSMD4蛋白含量提供准确、简便、灵敏度高、并可被广泛使用的检测手段。

本发明人经过广泛而深入的研究，采用酶联免疫吸附法检测PSMD4蛋白在多种恶性肿瘤病人血清中的表达水平，并首次证实在多种恶性肿瘤病人的血清中存在PSMD4蛋白的高表达。

本发明第一方面，提供了一种PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒，所述的ELISA检测试剂盒包括：

(1)包被有PSMD4抗体的ELISA酶标板，所述的包被抗体为兔抗人PSMD4的多克隆抗体；较优的，兔抗人PSMD4的多克隆抗体购自PTG公司；最优的，抗体工作浓度为2μg/ml。

(2)检测PSMD4抗原的抗体，为小鼠抗人PSMD4的单克隆抗体；较优的， 小鼠抗人PSMD4的单克隆抗体购自PTG公司；最优的，检测抗体的工作浓度为0.5μg/ml。

(3)酶标二抗，HRP(辣根过氧化物酶)标记的山羊抗小鼠IgG；较优的，HRP标记的山羊抗小鼠IgG购自PTG公司；最佳的，稀释浓度为1:5000。

(4)标准蛋白，为重组人PSMD4融合蛋白；较优的，重组人PSMD4融合蛋白购自PTG公司。

(5)所述的试剂盒，还包括有：常规的样品稀释液、包被缓冲液、封闭液、ELISA酶标板洗涤液、抗体稀释液、显色液和终止液；

所述的试剂盒，ELISA酶标板为市售的ELISA酶标板，优选德国greiner公司的ELISA酶标板(96孔单条可拆酶标板#650180)；

包被缓冲液，选用sigam公司的1×PBS，pH:9.6；

封闭液，选用含3％牛血清白蛋白+PBS溶液的封闭液；

ELISA酶标板洗涤液，较优的为含0.05％Tween-20的1×PBS溶液；

样品稀释液：样品为血清时，较优的为1×PBS，pH:7.4；

抗体稀释液，选用1×PBS；

显色液，选用sigam公司的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)；

终止液，较优的为2mol/L的硫酸溶液。

本发明所述的一种PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒，所用的试剂、条件进一步优化：

(1)包被抗体的优化：本发明的试剂盒，分别选用不同的抗体包被：兔抗人PSMD4的多克隆抗体(Abnova公司，#H00005710-AP11-1)、兔抗人PSMD4的多克隆抗体(PTG公司，#14899-1-AP)，鼠抗人PSMD4的单克隆抗体(Abnova公司，#H00005710-AP11-2)、鼠抗人PSMD4的单克隆抗体(PTG公司，#66179-1-Ig)，检测浓度选用7.5μg/ml，5μg/ml，2.0μg/ml，1μg/ml，0.5μg/ml，0.25μg/ml。结果发现选用兔抗人PSMD4的多克隆抗体(Abnova公司，#H00005710-AP11-1)、鼠抗人PSMD4的单克隆抗体(Abnova公司，#H00005710-AP11-2；PTG公司，#66179-1-Ig)作为包被抗体均存在明显的非特异反应，标准品的浓度和吸光度数值没有相关性；但是使用兔抗人PSMD4的多克隆抗体(PTG公司，#14899-1-AP)则没有明显的非特异性反应，标准品的浓度和吸光度具有较好的相关性。经过反复优化，抗体工作浓度2μg/ml为最佳，标准品的浓度和吸光度数值的相关性最好。

(2)检测抗体的优化：本发明的试剂盒，分别选用不同的抗体作为检测抗体：当包被抗体为兔抗人PSMD4的两种多克隆抗体(Abnova公司；#H00005710-AP11-1；PTG公司，#14899-1-AP)时选用鼠抗人PSMD4的两种单克隆抗体(Abnova公司，#H00005710-AP11-2；PTG公司，#66179-1-Ig)分别作为检测抗体；当包被抗体为鼠抗人PSMD4的两种单克隆抗体(Abnova公司，#H00005710-AP11-2；PTG公司，#66179-1-Ig)时选用兔抗人PSMD4的两种多克隆抗体(Abnova；#H00005710-AP11-1；PTG公司，#14899-1-AP)。检测浓度选用2.0μg/ml，1μg/ml，0.5μg/ml，0.25μg/ml，0.1μg/ml。结果发现包被抗体兔抗人PSMD4的多克隆抗体(Abnova公司；#H00005710-AP11-1)与鼠抗人PSMD4的两种单克隆抗体(Abnova公司，#H00005710-AP11-2；PTG公司，#66179-1-Ig)配伍时呈现明显的非特异反应，标准品的浓度和吸光度数值没有相关性；兔抗人PSMD4的多克隆抗体(PTG公司，#14899-1-AP)与鼠抗人PSMD4的单克隆抗体(Abnova公司，#H00005710-AP11-2)配伍时同样存在明显非特异反应，标准品的浓度和吸光度数值没有相关性；分别将两种包被抗体鼠抗人PSMD4的单克隆抗体(Abnova公司，#H00005710-AP11-2；PTG公司，#66179-1-Ig)与兔抗人PSMD4的两种多克隆抗体(Abnova；#H00005710-AP11-1；PTG公司，#14899-1-AP)配伍，结果也存在明显非特异反应，标准品的浓度和吸光度数值没有相关性。通过多次排列组合验证发现，仅在选用兔抗人PSMD4的多克隆抗体(PTG公司，#14899-1-AP)与小鼠抗人PSMD4单抗(PTG公司，#66179-1-Ig)配伍时，标准品的浓度和吸光度具有较好的相关性。后续经过反复优化，当检测抗体的工作浓度为0.5μg/ml时，标准品的浓度和吸光度数值的相关性最好。

(3)封闭液的优化：分别选用不同的封闭液，含1％牛血清白蛋白+PBS溶液，含2％牛血清白蛋白+PBS溶液，含3％牛血清白蛋白+PBS溶液，含4％牛血清白蛋白+PBS溶液，含5％牛血清白蛋白+PBS溶液，封闭时间选择室温1小时，室温2小时，4℃过夜。结果发现最佳封闭液和封闭时间为含3％牛血清白蛋白+PBS溶液的封闭液和室温封闭2小时为最佳组合。

(4)酶标二抗的优化：根据检测抗体的不同选用不同种属的酶标二抗，检测抗体为小鼠抗人PSMD4单抗(Abnova公司，#H00005710-AP11-2；PTG公司，#66179-1-Ig)时选用山羊抗小鼠HRP标记的IgG抗体(Jackson公司 #715-005-150)和山羊抗小鼠HRP标记的IgG抗体(PTG公司#SA00001-1)；检测抗体为兔抗人PSMD4多抗(Abnova；#H00005710-AP11-1；PTG公司，#14899-1-AP)时选用山羊抗兔HRP标记的IgG抗体(PTG公司#SA00001-15)。抗体稀释倍数选择1:1000，1:2000，1:3000，1:5000，1:10000。在组合验证中山羊抗小鼠HRP标记的IgG抗体(Jackson公司#715-005-150)和山羊抗兔HRP标记的IgG抗体(PTG公司#SA00001-15)的两组结果均未显示较好的相关性，存在非特异反应。在所以验证组合中小鼠抗人PSMD4单抗(PTG公司，#66179-1-Ig)作为检测抗体与酶标二抗为山羊抗小鼠HRP标记的IgG抗体配伍的结果显示较好的相关性(PTG公司#SA00001-1)，1:5000的稀释浓度为最佳。

(5)样品稀释液的优化：分别选用不同的样品稀释液，血清样本检测时样品稀释液选用1×PBS(pH:7.4)或含0.1％BSA，0.5％Tween-20的1×PBS溶液。结果发现最佳血清样本稀释液为1×PBS(pH:7.4)优于含0.1％BSA，0.5％Tween-20的1×TBS溶液。

本发明第二方面，提供了利用上述的PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒的检测方法。

检测前，首先制备检测ELISA酶标板：包被缓冲液将抗体(兔抗人PSMD4的多克隆抗体)稀释成2.0ug/ml，在ELISA酶标板的每孔中加入100μl，封板后置于4℃孵育过夜，备用。

本发明的检测方法包括以下步骤：血清样本用样品稀释液以1:1稀释，以100μl/孔的体积加样，室温孵育2小时；PSMD4重组蛋白用样品稀释液稀释成不同浓度梯度，以100μl/孔的体积加样，室温孵育2小时；甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液，每孔300μl，洗涤3-5次，甩干；将PSMD4检测抗体稀释成0.5μg/ml，每孔100μl，室温孵育1小时；甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液，每孔300μl，洗涤3-5次，甩干；加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG，每孔100μl，室温孵育40分钟；甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液，每孔300μl，洗涤6-8次，甩干；加入TMB，每孔100μl，室温避光孵育10-20分钟，加入2mol/L硫酸溶液终止反应，每孔50μl；在酶标仪上(450nm)测定OD值。

PSMD4重组蛋白用样品稀释液稀释成不同浓度梯度，可以根据检测需要自行设定浓度梯度，在本发明的一个优选实施例中，浓度梯度为：10ng/ml， 3ng/ml，1ng/ml，0.3ng/ml，0.1ng/ml，0.03ng/ml，0.01ng/ml。

本发明第三方面，提供了上述的PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒在多种恶性肿瘤血清学诊断中的应用。

本发明提供了一种PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒在制备恶性肿瘤血清学诊断或筛查试剂盒中的应用。

本发明的血清PSMD4蛋白的检测试剂盒可以同时特异性地、准确地、定性且定量地检测、诊断、筛查多种恶性肿瘤。

所述的恶性肿瘤，在本发明的优选实施例中，是肺癌、胃癌，和/或结直肠癌等。

本发明的PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒在制备恶性肿瘤血清学诊断或筛查试剂盒中的应用，所述的PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒包括上述的试剂盒组成。

本发明的PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒在制备恶性肿瘤血清学诊断或筛查试剂盒中的应用，所述的试剂盒用于血清学诊断或筛查的方法包括上述的检测方法步骤。

本发明的有益效果：

1)准确：目前市场上无商业化的人源性PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒，经文献检索没有定量检测人源性PSMD4蛋白含量的方法，前期工作发现PSMD4为癌蛋白，但目前无法对多种恶性肿瘤病人血清中的PSMD4进行测定。此ELISA试剂盒可准确检测多种恶性肿瘤病人血清中的PSMD4蛋白的含量，结果由酶标仪定量分析，排除了免疫组化、免疫荧光等半定量方法的主观性。

2)灵敏度高：用该方法检测到的PSMD4蛋白最低可至10pg/ml，敏感性明显高于普通的Western blot和免疫组化等半定量方法。

3)简单方便：本方法中所用试剂和实验耗材均为市售商业化产品，容易获得；检测中仅需移液器和酶标仪进行加样和读数，普通的实验室和医院均可开展此项检测。

本发明提供的ELISA试剂盒操作简单方便，可准确、高灵敏度地检测到多种恶性肿瘤病人血清中的PSMD4蛋白的含量；为筛查早期恶性肿瘤病人和基础研究提供了一种新的手段和方法。

本发明的试剂盒主要用于多种恶性肿瘤病人的血清样品中PSMD4蛋白 的定量检测，基础研究中可运用于各种生物学样品(如细胞培养上清液、细胞裂解液)中的PSMD4蛋白的检测。

本发明检测时不需要复杂仪器，易于在科研院校和医疗机构中推广应用，可大规模检测临床标本，快速获得人PSMD4蛋白相关的海量数据和信息，为多种恶性肿瘤患者的早期诊断和筛查提供临床参考价值，具有广阔的市场前景、较大的经济和社会效益。

附图说明

图1是双抗体夹心ELISA方法检测PSMD4融合蛋白的结果，其中A图为柱状图，B图为散点图(呈线性相关)。

图2是双抗体夹心ELISA方法检测正常人群和肺癌患者血清中PSMD4蛋白的结果，normal(健康对照)；lung cancer(肺癌)；

图3是双抗体夹心ELISA方法检测正常人群和胃癌患者血清中PSMD4蛋白的结果，normal(健康对照)；gastric cancer(胃癌)；

图4是双抗体夹心ELISA方法检测正常人群和结直肠癌患者血清中PSMD4蛋白的结果，normal(健康对照)；colorectal cancer(结直肠癌)。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。

兔抗人PSMD4的多克隆抗体，Abnova公司；H00005710-AP11-1

小鼠抗人PSMD4的单克隆抗体，Abnova公司；H00005710-AP11-2

兔抗人PSMD4的多克隆抗体，PTG公司；14899-1-AP

小鼠抗人PSMD4的单克隆抗体，PTG公司；66179-1-Ig

HRP标记的山羊抗小鼠IgG，PTG公司；SA00001-1

HRP标记的山羊抗兔IgG，PTG公司；SA00001-15

HRP标记的山羊抗小鼠IgG，Jackson公司；715-005-150

重组人PSMD4融合蛋白，PTG公司；ag6691

显色液选用sigam公司的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)。

实施例1：

检测ELISA酶标板的制备：包被缓冲液1×PBS，pH:9.6将抗体(兔抗人 PSMD4的多克隆抗体)稀释成2.0ug/ml，在ELISA酶标板的每孔中加入100μl，封板后置于4℃孵育过夜，备用。

血清样本和重组蛋白的检测：甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液(含0.05％Tween-20的1×PBS溶液)，每孔300μl，洗涤2-3次，甩干；用含3％牛血清白蛋白的PBS溶液的封闭液封闭，以200ul/孔的体积加样，室温下封闭2小时：甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液，每孔300μl，洗涤2-3次，甩干，血清样本用样品稀释液1×PBS(pH:7.4)以1:1稀释，以100μl/孔的体积加样，室温孵育2小时；PSMD4重组蛋白用样品稀释液稀释成不同浓度梯度，以100μl/孔的体积加样，室温孵育2小时；甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液，每孔300μl，洗涤3-5次，甩干；将PSMD4检测抗体稀释成0.5μg/ml，每孔100μl，室温孵育1小时；甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液，每孔300μl，洗涤3-5次，甩干；加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG，每孔100μl，室温孵育40分钟；甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液，每孔300μl，洗涤6-8次，甩干；加入TMB，每孔100μl，室温避光孵育10-20分钟，加入2mol/L硫酸溶液终止反应，每孔50μl；在酶标仪上(450nm)测定OD值。

实施例2：优化

1、包被抗体浓度的优化：

分别选用不同的包被抗体兔抗人PSMD4多克隆抗体(PTG公司和Abnova公司)，选择不同浓度(7.5μg/ml，5μg/ml，2.0μg/ml，1μg/ml，0.5μg/ml，0.25μg/ml)包被ELISA酶标板，按照实施例1中的操作步骤进行检测，加入已知的不同浓度PSMD4蛋白标准品。根据获得的OD值，选择空白组OD值最小，且OD值和标准蛋白浓度之间的线性关系最为密切的作为最佳抗体(PTG公司)包被抗体浓度为2.0μg/ml。

2、封闭液的优化：

分别选用不同的封闭液，含1％牛血清白蛋白+PBS溶液，含2％牛血清白蛋白+PBS溶液，含3％牛血清白蛋白+PBS溶液，含4％牛血清白蛋白+PBS溶液，含5％牛血清白蛋白+PBS溶液，封闭时间选择室温1小时，室温2小时，4℃过夜。按照实施例1中的操作步骤进行检测，加入已知的不同浓度PSMD4蛋白标准品，选择空白组OD值最小，且OD值和标准蛋白浓度之间的线性关系最为密切的作为最佳封闭液和封闭时间。含3％牛血清白蛋白+ PBS溶液的封闭液和室温封闭2小时为最佳组合。

3、检测抗体的优化：

检测抗体选用鼠抗人PSMD4的两种单克隆抗体(Abnova公司，#H00005710-AP11-2；PTG公司，#66179-1-Ig)检测浓度选用(2.0μg/ml，1μg/ml，0.5μg/ml，0.25μg/ml，0.1μg/ml)。按照实施例1中的操作步骤进行检测，加入已知的不同浓度PSMD4蛋白标准品，选择空白组OD值最小，且OD值和标准蛋白浓度之间的线性关系最为密切的作为最佳检测抗体和工作浓度。PSMD4(PTG公司)的工作浓度0.5μg/ml为最佳配伍。

4、酶标二抗的优化：

检测抗体为小鼠抗人PSMD4单抗(Abnova公司，#H00005710-AP11-2；PTG公司，#66179-1-Ig)时选取酶标二抗为山羊抗小鼠HRP标记的IgG(Jackson公司#715-005-150；PTG公司#SA00001-1)；抗体稀释倍数选择1:1000，1:2000，1:3000，1:5000，1:10000。按照实施例1中的操作步骤进行检测，加入已知的不同浓度PSMD4蛋白标准品，选择空白组OD值最小，且OD值和标准蛋白浓度之间的线性关系最为密切的作为最佳酶标二抗和稀释浓度。山羊抗小鼠HRP标记的IgG抗体配伍为最佳(PTG公司#SA00001-1)，稀释浓度为1:5000稀释为最佳。

5、样品稀释液的优化：

病人血清样本检测时样品稀释液选用1×PBS(pH:7.4)或含0.1％BSA，0.5％Tween-20的1×TBS溶液，按照实施例1中的操作步骤进行检测，加入已知的不同浓度PSMD4蛋白标准品，选择OD值和标准蛋白浓度之间的线性关系最为密切的作为最佳血清样本稀释液。最佳血清样本稀释液为1×PBS(pH:7.4)溶液。

实施例3：ELISA试剂盒检测PSMD4融合蛋白

将PSMD4重组蛋白(PTG#ag6691)倍比稀释，从10ng/ml开始稀释，连续稀释7个浓度，10ng/ml，3ng/ml，1ng/ml，0.3ng/ml，0.1ng/ml，0.03ng/ml，0.01ng/ml每个样品设置2个复孔，100μl/孔，按照实施例1的步骤重复检测5次，结果相似，如图1所示，PSMD4重组蛋白与抗体的反应具有良好的浓度依赖关系，且成明显的线性关系。

实施例4：PSMD4蛋白的ELISA试剂盒的特异性和敏感性评价

1、特异性试验

用实施例1建立的ELISA方法检测50例正常人群、26例肺癌病人血清样品、41例胃癌病人血清样品以及39例结直肠癌病人血清样本(健康人群选自本院员工体检样本；肺癌、胃癌及结直肠癌样本均来源于上海市长征医院检验科，经病理诊断为原发性肺癌、胃癌及结直肠癌)，将PSMD4重组蛋白作为阳性对照，根据所得标准品OD值与所对应浓度绘制标准曲线，计算各人群中PSMD4蛋白的血清学水平。

如图2所示，肺癌组人群PSMD4蛋白的血清学水平(Mean178.99pg/mL,Range0-645.95pg/ml)明显高于正常人群(Mean98.84pg/mL,Range0-164.14pg/ml)，差异有统计学意义(p＝0.002)。提示PSMD4在肺癌的血清学诊断中有一定的特异性。

如图3所示，胃癌组人群PSMD4蛋白的血清学水平(Mean193.99pg/mL,Range20.82-586.43pg/ml)明显高于正常人群(Mean98.84pg/mL,Range0-164.14pg/ml)，差异有统计学意义(p﹤0.001)。提示PSMD4在胃癌的血清学诊断中有一定的特异性。

如图4所示，结直肠癌组人群PSMD4蛋白的血清学水平(Mean258.01pg/mL,Range20.76-1010.38pg/ml)明显高于正常人群(Mean98.84pg/mL,Range0-164.14pg/ml)，差异有统计学意义(p﹤0.001)。提示PSMD4在结直肠癌的血清学诊断中有一定的特异性。(Mean-均值；Range-极值范围)

2、敏感性试验

将PSMD4重组蛋白(1ug/ul)用1×PBS作连续倍比稀释，设置2个复孔，得出标准蛋白各个稀释点的平均OD值与空白组OD值有统计学差异的最高稀释倍数。

PSMD4融合蛋白稀释10⁸倍后的OD值与空白组OD值仍有统计学差异，表明可检测的PSMD4蛋白最低浓度为10pg/ml。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。