一种具有优越检测线和分析灵敏度的尿素检测试剂及检测方法与流程

本发明涉及尿素检测技术领域，特别涉及一种具有优越检测线和分析灵敏度的尿素检测试剂，还涉及使用此检测试剂的检测方法。

背景技术：

尿素（UREA）是人体蛋白质代谢的终末产物。体内氨基酸经脱氨基作用分解成α-酮酸和NH₃，NH₃在肝细胞内进入尿素循环与CO₂生成尿素。尿素的生成量取决于饮食蛋白质摄入量、组织蛋白质的分解代谢和肝功能状况。生成的尿素经血液循环主要由肾脏排出。经唾液、胃液、胆汁及肠液排至消化道内的尿素，绝大部分分解成NH₃吸收后又经肝脏合成尿素仍从肾脏排泄。血浆中的尿素可全部从肾小球滤过，正常情况下约30%~40%被肾小球重吸收，肾小球亦可少量排泌尿素。血浆尿素浓度在一定程度上可反映肾小球的滤过功能，此外，肾外因素如组织分解代谢加快、消化道出血、摄食过多蛋白质等都可引起血浆尿素浓度升高，因而血浆尿素浓度测定亦不是肾功能损伤的特异指标。尽管如此，因为尿素是由肾脏排泄的低分子含氮废物的主要成分，血浆尿素浓度对慢性肾脏疾病的病程、病情观察及预后判断均有意义，且血浆尿素测定方法比较简单，所以血浆尿素测定仍是目前肾脏疾病的主要检查项目之一。

目前，文献报道的尿素活性的测定方法有尿素酶法、酚-次氯酸盐显色法、纳氏试剂显色法、二乙酰一肟法等。这些方法准确性差、灵敏度低、仪器设备要求高、试剂成本高，难于全面推广应用。

鉴于此，本发明对现有酶法尿素检测试剂进行了改良，并对其性能指标进行了评估。改良酶法尿素试剂具有更加优越的检测限和分析敏感性，并且自身性能良好，符合相关临床应用要求。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于检测UREA的试剂及使用该试剂检测UREA含量的方法。该试剂盒采用脲酶-谷氨酸脱氢酶法，可以有效检测UREA的含量，抗干扰能力强，稳定性好等优点。

基本原理：尿素在脲酶作用下，生成NH4+和HCO3－，

脲酶

尿素 + H2O 2NH4+ + 2HCO3－

NH4 ⁺及α-酮戊二酸 、还原型辅酶Ⅰ在谷氨酸脱氢酶催化下，生成L-谷氨酸和NAD⁺

谷氨酸脱氢酶

α-酮戊二酸 +NH4 + +NADH L-谷氨酸 + NAD + + H2O

通过测定NADH在340nm波长处吸光度的变化速率（ΔA/min）可测得UREA活性。

本发明是通过以下步骤得到的：

一种UREA检酸测试剂，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1和试剂R2的组成如下：

1）试剂R1的组分为：

缓冲液（pH值9.1)_{··········································}100mmol/L

NADPH_{····················································}0.3mmol/L

2）试剂R2的组分为：

缓冲液（pH值7.6）_{··········································}100mmol/L

脲酶_{·····················································}40KU/L

谷氨酸脱氢酶_{·············································}2KU/L

α-酮戊二酸_{···············································}30mmol/L

防腐剂_{···················································}0.8g/L；

以上试剂均用三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液。

以上UREA检测试剂，所述防腐剂为NaN3。

所述的UREA检测试剂来检测UREA的检测方法，使用全自动生化分析仪利用速率法进行测定，检测主波长为340nm。

所述的检测方法，R1试剂和R2试剂的比例为4:1。

本发明的有益效果：

1）采用新的缓冲体系和稳定剂，显著改善了试剂的稳定性；

2）改良酶法尿素试剂具有更加优越的检测限和分析敏感性，并且自身性能良好，符合相关临床应用要求。

附图说明

图1为两种试剂的相关性曲线图，

图2为两种试剂效期稳定性曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：

实施例1

UREA的检测试剂，包试剂R1和试剂R2：

1）试剂R1的组分为：

缓冲液（pH值9.1)_{···············································}100mmol/L

NADPH_{·························································}0.3mmol/L

2）试剂R2的组分为：

缓冲液（pH值7.6）_{···············································}100mmol/L

脲酶_{··························································}40KU/L

谷氨酸脱氢酶_{··················································}2KU/L

α-酮戊二酸_{····················································}30mmol/L

防腐剂_{························································}0.8g/L；

3）本实施例试剂的使用方法：

本实施例描述的UREA检测试剂，在使用时采用具有双试剂功能的全自动生化分析仪，如日立7180全自动分析仪等，利用速率法进行测定。将R1和R2按照4:1的比例放置到对应的试剂位上，在样品盘的对应位置放置好蒸馏水、标准品和样本，操作如表1：

表1 实施例1试剂检测方法

计算：UREA含量（mmol/L）＝（∆A测定÷∆A标准）×C标准。

实施例2

干扰性试验：取新鲜混合血清，分成2等份，然后将每等份再分成5等份，加入不同的干扰物质，使其在血清中的浓度达到表2的要求。然后分别用实施例1所得试剂，与市场常见并认可的UREA试剂同时对比测定血清中UREA的含量，对照组测定结果与加入不同干扰物质后各组的测定结果见表2。相对偏差（%）=（干扰样本的测定均值－对照样本的测定均值）/对照样本的测定均值×100%。

由表2可以看出，实施例1试剂在抗坏血酸≤1704μmol/L、胆红素≤684μmol/L、血红蛋白≤5 g/L、甘油三酯≤22.6 mmol/L对测试结果没有明显干扰。而对照组试剂在上述浓度干扰物质存在时，受到明显干扰，这说明实施例1试剂的抗干扰性能远远优于对比试剂。

表2实施例试剂抗干扰性能比较

实施例3

相关性实验：利用实施例1配方配制试剂，与市场常见的国家食品药品监督管理局认可的某公司的UREA试剂盒进行对照检测，同时检测了20个临床血清样本，检测结果如表3所示。并获得了两种试剂的相关性曲线（如图1所示），通过检测结果显示，两个试剂盒的相关系数为0.9974，说明了两者有极大的相关性。

表3实施例1试剂与市场常见并得到认可的UREA测定试剂盒对比检测结果

实施例4

试剂的稳定性对比试验：对实施例1中的试剂，均匀分装13组，每组的试剂量为R1为40mL，R2为10mL；并且取13组市场常见的国家食品药品监督管理局认可的某公司的UREA试剂盒作对照。放置到2-8℃冰箱中，每月的同一天取出一组试剂检测UREA质控品，检测结果如图2所示，实施例1试剂在2-8℃储存条件下比市场常见的UREA测定试剂盒更加稳定。

通过验证，本试剂与同类检测试剂对比相关性好，临床检测样本结果一致，能够达到市场对产品的应用要求，并且抗干扰性能好，是一种更加稳定、良好的UREA检测试剂。