本发明涉及基Annexin A1蛋白的一种白血病检测试剂盒的开发与应用。具体地，本发明涉及：检测受试者中Annexin A1蛋白表达水平的方法；受试者中Annexin A1蛋白的表达水平在白血病病人检测中的用途；以及涉及一种试剂盒产品，其包括作为活性成分的Annexin A1蛋白的抗体和包括涉及该产品的说明书。
背景技术：
癌症是一类严重危害人类健康的疾病，目前全球癌症死亡人数高于艾滋病、结核病和疟疾死亡人数的总和，已成为全球头号杀手。2015年6月2日，美国临床肿瘤学会议落幕，根据世界卫生组织(WHO)发布的《全球癌症报告2014》，2012年全球癌症患者和死亡病例均有所增加，新增癌症病例有近一半出现在亚洲，其中大部分在中国，中国新增癌症病例高居第一位。该报告预测全球癌症病例将呈现迅猛增长态势，由2012年的1400万人，逐年递增至2025年的1900万人，到2035年将达到2400万人。而白血病是一类造血系统的恶性疾病，是国内十大高发恶性肿瘤之一，占肿瘤发病率的第六位，在我国各年龄组恶性肿瘤的死亡率中分别占男性的第6位和女性的第8位，在儿童及35岁以下的死亡率中占第1位。WHO预计，在全球范围内，新增癌症病例和癌症患者死亡率也将会以每年1％的速度递增，而在中国、俄罗斯和印度这些国家增长速度会更快，估计到2030年全球将可能有7500万人遭受癌症的折磨，将新增2700万癌症病例，死于癌症的人数将达到1700万人，这一数字对许多国家的健康护理体系来说是难以承受的。
Annexin A1蛋白是于30年前发现的首个annexins蛋白超家族成员，分子量为37kDa，其羧基末端拥有4个高度保守的70个氨基酸重复序列能够以Ca2+依赖的模式与负电荷的膜磷脂相结合，其氨基末端(49个氨基酸残基)包含了磷酸化和蛋白水解位点(可以水解产生33kDa的N末端切割产物)，承担了Annexin A1蛋白特异的生物学功能[1]。最初鉴定的Annexin A1蛋白活性是作为磷脂酶A2(PLA2)的抑制剂，被认为具有抗炎的活性[2,3]，进一步研究显示其在先天免疫/适应性免疫和对抗细菌感染中也发挥了重要作用[4-6]。也有研究显示Annexin A1蛋白还具有调节信号转导、DNA复制、离子通道形成、细胞增殖、凋亡、迁移等特性[7-9]。而目前尚未见ANXA1在白血病中表达情况的相关研究报道。
由于Annexin A1蛋白的序列已经明确，Annexin A1蛋白的商业化抗体已成熟，该抗体的产生对于研究基于Annexin A1蛋白的相关疾病提供了诸多便利。目前还未见关于Annexin A1蛋白作为试剂盒在白血病检测领域的相关研究报道。
技术实现要素：
为了向在正常体检中的人们提供检测发现白血病可能性的新途径或提供更广泛的选择，本发明的发明人研究首次发现：与健康人相比，Annexin A1蛋白在白血病患者外周血白细胞中呈现高表达。
因此，本发明一方面提供了一种检测受试者可能患白血病的方法，其包括在所述受试者中检测Annexin A1蛋白的表达水平。
本发明的另一方面提供了Annexin A1蛋白的抗体在制备用于检测受试者是否患有白血病或是否具有患有白血病风险的试剂盒中的用途。优选地，所述的检测是通过检测受试者外周血中Annexin A1蛋白表达水平而进行的。示例性地，如果受试者周血中Annexin A1蛋白表达水平是正常对照组的1.3-100倍或更高，则可以判定该受试者患有白血病或具有患有白血病风险。例如，本发明所述的高表达是指是对照组(健康组)表达水平的1.3倍、1.31倍、1.32倍、1.33倍、1.34倍、1.35倍、1.36倍、1.37倍、1.38倍、1.39倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍或更高。
本发明的再一方面提供了一种检测受试者是否患有白血病或是否具有患有白血病风险的试剂盒，其包括作为活性成分的Annexin A1蛋白的抗体；以及包括该涉及抗体产品的说明书。
在本发明中，其中所述的Annexin A1蛋白的抗体是指与Annexin A1蛋白特异性结合的抗体，例如特异性与Annexin A1蛋白结合的单克隆抗体或者多克隆抗体。
对于本发明所述的受试者，其优选为哺乳动物，更优选为人。
本发明的发明人出乎意料的发现，受试者外周血中Annexin A1蛋白的表达水平与该受试者是否患有白血病或者是否具有患白血病的风险显著相关。例如，如果受试者外周血中Annexin A1蛋白的表达水平相对健康受试者是高表达的，则可诊断为该受试者患有白血病或者具有患白血病的风险。这对于早发现白血病并进行及时治疗赢得了时间。
示例性地，本发明的试剂盒、检测或者用途可以作为诊断白血病的辅助手段。也就是说，医生或者其他医务人员可以结合受试者其他的理化指标或影像结果给出受试者的诊断结果。
如本文所使用的，“包含”、“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包括在内的或开放性的，并且不排除另外的未陈述的元件或方法步骤。术语“包含”在本文中的任何表述，特别是在描述本发明的方法、用途或产品时，应理解为包括基本上由所述组分或元件或步骤组成和由所述组分或元件或步骤组成的那些产品、方法和用途。本文示例性描述的本发明适当地可以在不存在本文未具体公开的任何一种或多种元件、一种或多种限制的情况下进行实践。
本文已采用的术语和表述用作描述性而不是限制性术语，并且在此种术语和表述的使用中不预期排除所示和所述特征或其部分的任何等价物，但应认识到各种修饰在请求保护的本发明的范围内是可能的。因此，应当理解尽管本发明已通过优选实施方案和任选特征具体公开，但本领域技术人员可以采用本文公开的概念的修饰和变化，并且此类修饰和变化被视为在如由附加权利要求定义的本发明的范围内。
附图说明
图1为受试者外周血中Annexin A1蛋白表达水平的代表性Western blotting图片，其中P代表patient，指白血病患者；V代表volunteers，指健康志愿者。
为更清楚地说明本发明，现结合如下实施例进行详细说明，但这些实施例仅仅是对本发明的示例性描述，并不能解释为对本申请的限制。
实施例
1.材料和方法
1.1细胞株及抗体
人慢性粒性白血病细胞K562购自中国医学科学院肿瘤细胞库。Annexin A1蛋白的兔源一抗抗体购自巴傲德生物科技有限公司，使用时按1：1000比例稀释，辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔的二抗购自巴傲德生物科技有限公司，使用时按1：5000稀释。内参抗体GAPDH同样购自巴傲德，使用时按1：10000稀释。
1.2白血病病人和正常人血液样品
白血病病人外周血取自浙江省人民医院血液科。正常人外周血取自浙江省中医院下沙院区体检中心。
1.2实验方法
1.2.1细胞培养
将K562细胞培养于含10％FBS(Fetal bovine serum)的DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培养基中(含谷氨酰胺、10mM HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)、1.0mM丙酮酸钠、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)，于37℃、5％CO2、饱和湿度下培养，每3天传代一次，取对数生长期细胞制备蛋白样品并于-80度保存，用于与白血病病人蛋白样品以及健康志愿者蛋白样品一起做Western blotting检测。
1.2.2全血样品中白细胞分离方法
将正常人或白血病患者的外周血样4℃,450g(约2300rpm)离心10min，取血清于干净的1.5mL的EP管中，于—80℃下保存；往剩余血红色沉淀中加约3倍体积的红细胞裂解液，轻轻涡旋或颠倒摇匀后，冰上裂解15min，其间轻轻涡旋混匀两次；再4℃450g离心10min以沉淀白细胞，小心吸弃上清液。重复此步骤1-2次直到得到白色沉淀。再加1mL PBS，450g，4℃离心5min，弃上清，重复1-2次。再按所得的白细胞的量加适量的RIPA全细胞裂解液(含有10mM的PMSF10％)。在震动器上剧烈震荡后，于冰上充分裂解30min，再于—80℃下保存后与K562细胞蛋白样品同时做Western blotting检测。
2.实验结果
Annexin A1蛋白在正常体检志愿者和白血病患者外周血白细胞中的表达水平
Western blotting检测结果显示：正常志愿者外周血白细胞中Annexin A1蛋白呈现低水平的表达或不表达，而相比于正常志愿者，白血病患者外周血白细胞中Annexin A1蛋白呈现高表达(见图1)。
表1综合了所研究的30例白血病病人的相关资料，包括患者年龄、性别、白血病分型，以及外周血白细胞中Annexin A1蛋白的表达水平，如图1中P16是V1的6.18倍，P17是V1的3.67倍，P11是V1的1.64倍，P15是V1的1.29倍，P19是V1的3.32倍，P12是V3的14.22倍，P13是V3的7.90倍，P28是V3的2.84倍，P29是V3的7.74倍，P30是V3的8.57倍，P17是V5的2.49倍，P17是V6的2.88倍，P17是V7的2.40倍，P17是V8的2.68倍，P17是V9的2.66倍，P19是V10的7.27倍，P19是V11的7.78倍，P19是V12的7.50倍，P19是V13的7.38倍，P19是V14的11.41倍，P19是V15的5.57倍，P15是V10的3.74倍，P15是V11的3.99倍，P15是V12的3.85倍，P15是V13的3.79倍，P15是V14的5.87倍，P15是V15的2.86倍，。从表1中可以看出Annexin A1蛋白在白血病患者中呈现高阳性率的检出，阳性率高达86.7％。
表1：所检测的30例白血病病人中Annexin A1蛋白的表达水平
由此可见，将Annexin A1蛋白的抗体做成一种ELISA试剂盒，利用该试剂盒来在体检中检测受试者外周血中Annexin A1蛋白的表达水平，通过该检测可以高准确率的检测出受试者是否患有白血病的可能性。
本领域普通技术人员应当理解，可以在本发明的实践中采用除具体例示那些外的方法和原材料等而无需过度实验。任何此类方法和原材料等的所有的本领域已知的功能等价物都预期包括在本发明中。本领域技术人员还应当理解，可对本说明书及权利要求书中描述的本发明进行各种变动和修饰，且本发明包括所有此类变动和修饰。本发明还包括本说明书中单独或同时提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征中的任何2个或更多个的任何和所有组合。
参考文献
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