一种监测肿瘤发生发展的产品及其应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种监测肿瘤发生发展的产品及其应用。
背景技术：
：乳腺癌目前是全球范围内最常见、致死人数最多的恶性肿瘤之一，其发病率及死亡率增长迅速。要降低乳腺癌病人的死亡率除了在病因预防上降低发病率外，提高早期诊断水平和药物治疗的疗效是两个重要方面。然而，乳腺癌的早期诊断一直是一个世界性难题，目前影像诊断(B超、钼靶)，化学诊断(癌反应，血清学和免疫学指标)及组织细胞学诊断是肿瘤诊断的三大支柱，前者在亚临床期诊断上有很大局限性，后二者均以肿瘤标志物作为观察指标，可以比影像诊断更早发现肿瘤的存在，具有高效、高灵敏性、方便、标本易获取及创伤小等优点，因此，在乳腺癌早期诊治研究中，筛选及鉴定高特异性的乳腺癌肿瘤标志物一直是研究的重点和难点。所谓肿瘤标志物，是指在肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞生物合成、释放或者是肿瘤与宿主相互作用而产生的一类物质，反映着肿瘤的存在和生长。我们可通过利用化学、免疫、分子生物学等技术对血液或分泌物进行定性或者定量的检测，通过对其分析，帮助我们从正常组织中区别肿瘤或者测定肿瘤细胞核、细胞质以及对细胞膜上的特性进行分析，以此作为辨别肿瘤细胞的标志。乳腺癌的发生与发展具有十分复杂的机制，其发病的最初阶段涉及到许多乳腺癌相关基因及其表达的改变，在致癌因素的作用下患者体内可表达多种粘附分子及其受体或配体，在肿瘤发展的不同时期其释放标志物含量也不一样。由于乳腺癌组织病理的多样性、同种病理肿瘤细胞的异质性和肿瘤生物学行为的复杂性及多态性，造成单一标志物检测对乳腺癌的诊断价值有限，只能反映了疾病某些侧面的变化，国内外众多学者倾向于筛选多种有价值的肿瘤标志物进行联合检测，以提高乳腺癌诊断的阳性率。因此，寻找一种高灵敏度、高特异性、可实际应用于乳腺癌临床诊治的生物标志物已成为乳腺癌研究中亟待解决的问题之一。CAPN15基因(calpain15，钙蛋白酶15)又名SOLH，位于16号染色体，该基因编码的蛋白含有锌指结构重复区和钙蛋白酶类结构域。编码的蛋白质具有钙依赖性半胱氨酸型内肽酶活性和半胱氨酸型酶活性，可以作为转录因子，RNA结合蛋白，或在视觉系统发育过程中的蛋白质-蛋白质相互作用。与CAPN15相关的疾病包括痉挛性偏瘫、痉挛型脑瘫。与其相关的通路为细胞外基质的降解。KLHL33基因(kelchlikefamilymember33，kelch类家族成员)位于14号染色体上，为蛋白编码基因，具有促进泛素蛋白转移酶活性。技术实现要素：为了实现肿瘤的早期发现，早期干预，本发明的目的之一在于提供CAPN15基因和/或KLHL33基因在制备监测肿瘤发生发展的产品中的应用；本发明的目的之二在于提供一种检测肿瘤的试剂盒；本发明的目的之三在于提供一种治疗乳腺癌的生物试剂；本发明的目的之三在于提供一种治疗乳腺癌的药物。为实现上述目的，本发明首先提供用于检测如下(1)-(3)中任一的检测物在制备用于监测肿瘤发生发展的产品中的应用：(1)CAPN15基因或该基因的表达产物；(2)KLHL33基因或该基因的表达产物；(3)CAPN15基因和KLHL33基因或CAPN15基因的表达产物和KLHL33基因的表达产物。优选地，所述检测包括基因水平的检测和蛋白水平的检测，所述基因水平检测包括实时定量PCR法、基因芯片法和高通量测序法；所述蛋白水平的检测包括免疫组化、胶体金法、ELISA法和Westernblot法。优选地，所述实时定量PCR法包括SYBRGreen法和TaqMan探针法。优选地，所述CAPN15基因和KLHL33基因及它们表达的蛋白在肿瘤组织中表达上调。优选地，所述产品包括芯片、试剂盒生物试剂或其他药物。优选地，所述试剂盒可以是检测CAPN15基因和/或KLHL33基因转录水平的试剂盒，如QPCR试剂盒，也可以是检测CAPN15蛋白和/或KLHL33蛋白的表达水平的试剂盒，如ELISA试剂盒；所述芯片可以是基因芯片或是蛋白芯片，其能够检测CAPN15基因和/或KLHL33基因的表达水平；所述试剂包括CAPN15和/或KLHL33基因的特异性引物和CAPN15和/或KLHL33蛋白的特异性抗体。优选地，所述ELISA试剂盒除包含与CAPN15和/或KLHL33蛋白特异性结合的抗体之外，还包含包被缓冲液、洗涤液、封闭液、加样缓冲液、反应终止液、目的蛋白标准品。优选地，所述与CAPN15(或KLHL33)蛋白特异性结合的抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。上述抗体可以从商业途径获取，也可以使用本领域已知的方法来制备。例如，将纯化的人CAPN15(或KLHL33)蛋白或它的抗原片段注射入动物体内以产生多克隆抗体。同样，表达人CAPN15(或KLHL33)蛋白或它的抗原片段的细胞也可以用来对动物致免疫而产生抗体。单克隆抗体可用杂交瘤技术制备。CAPN15(或KLHL33)蛋白的抗体包括可以阻抑CAPN15(或KLHL33)蛋白功能的抗体，也可以是不影响人CAPN15(或KLHL33)蛋白功能的抗体。优选地，所述包被缓冲液为磷酸盐缓冲液PBS，其成分为140mMNaCl，2.7mMKCl，10mMNa2HPO4，1.8mMKH2PO4，pH值为7.4。优选地，洗涤液为含1％Tween-20的PBS，称为PBST，其成分为PBS，1％Tween-20。优选地，封闭液为含1％BSA的PBS，其成分为PBS，1％BSA。优选地，加样缓冲液的成分为50mMTris-HCl，0.5MKCl，1％BSA，0.05％Tween-20，pH值为8.4。优选地，反应终止液成分为2MH2SO4。本发明所述肿瘤包括但不限于以下：乳腺癌、胃癌、胰腺癌、结肠和直肠癌、食道癌、肺癌、膀胱癌、睾丸癌、前列腺癌、宫颈癌、淋巴瘤。优选地，所述肿瘤为乳腺癌。进一步地，本发明提供了一种检测乳腺癌的试剂盒，所述试剂盒包括：(1)组织样品提取总RNA试剂；(2)反转录试剂；(3)定量PCR试剂。优选地，组织样品提取总RNA试剂包括TRizol、三氯甲烷、异丙醇、75％乙醇和无酶水；所述反转录试剂包括：5x逆转录缓冲液、SuperRT逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs、OligodTPrimer(或Random6mers)和RNaseFreedH2O。优选地，逆转录反应液包含：250mMpH8.3的Tris-HCl，375mM的KCl，15mM的MgCl2，50mM的DTT。优选地，所述定量PCR试剂包括特异性扩增CAPN15和/或KLHL33的引物序列。优选地，所述引物包括：(1)CAPN15：上游引物SEQIDNO.1下游引物SEQIDNO.2；和/或(2)KLHL33：上游引物SEQIDNO.3下游引物SEQIDNO.4。优选地，所述定量PCR试剂还包括PCR缓冲液、dNTP、Taq酶和SYBRGreen荧光染料。优选地，所述试剂盒含有阳性对照和阴性对照。优选地，所述阳性对照为正常的乳腺组织RNA或DNA，所述阴性对照为ddH2O。优选地，所述PCR缓冲液包含：25mMKCl，2.5mMMgCl2，200mM(NH4)2SO4。进一步地，本发明提供一种治疗乳腺癌的生物试剂，所述生物试剂含有抑制CAPN15或KLHL33基因表达的siRNA，所述siRNA序列为如下：(1)CAPN15：SEQIDNO:7和SEQIDNO:8；(2)KLHL33：SEQIDNO:9和SEQIDNO:10。进一步地，本发明提供一种治疗乳腺癌的药物，所述药物包括抑制肿瘤细胞增殖的药物和促进肿瘤细胞凋亡的药物。优选地，所述药物包括通过干扰RNA抑制CAPN15基因或KLHL33基因表达。在本发明中，所述RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，该技术已被广泛用于探索基因功能和许多疾病的基因治疗领域中。以细胞为基础的RNAi筛选在功能基因学研究方面具有许多优势，主要表现在大多数细胞类型都能使用RNAi方法，并且相对较容易下调或沉默任何目的基因的表达。优选地，所述药物还包括药学上可接受的载体，这类载体包括(但并不限于)：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。优选地，所述药物可根据需要制备成各种剂型，包括但不限于，片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。优选地，所述药物还可与其他治疗肿瘤的药物联用，多种药物联合使用可以大大提高治疗的成功率。本发明的有益效果如下：本发明发现了一种检测肿瘤的分子标记物CAPN15和/或KLHL33基因，并进一步证实CAPN15和KLHL33基因表达水平在肿瘤组织中表达上调。因此，利用CAPN15和/或KLHL33基因检测肿瘤，如乳腺癌，不仅能够快速有效的做到早期诊断，其精确度大大提高。本发明还通过干扰肿瘤细胞中CAPN15和/或KLHL33基因的表达可以明显抑制细胞增殖和促进细胞凋亡，因此，CAPN15和/或KLHL33基因为肿瘤的基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。附图说明图1实时荧光定量PCR检测CAPN15基因和KLHL33基因在乳腺癌组织中的表达情况；图2实时荧光定量PCR检测针对CAPN15和KLHL33的干扰RNA分别对CAPN15基因和KLHL33基因表达的影响；图3利用CCK-8法检测CAPN15基因和KLHL33基因表达对乳腺癌细胞增殖的影响。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，如按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版)(科学出版社，2002)中的所述条件，或按照试剂制造厂家所建议的条件。本发明的技术方案主要包括：利用高通量测序方法对乳腺癌组织中CAPN15基因和KLHL33基因的表达水平与旁癌组织进行差异比较。采用实时荧光定量PCR方法验证CAPN15基因和KLHL33基因在乳腺癌组织中的表达上调。利用RNA干扰技术使体外培养的乳腺癌细胞中CAPN15基因和KLHL33基因的沉默，检测乳腺癌细胞增殖和凋亡情况。实施例1筛选与乳腺癌相关的基因标志物1、样本收集收集经外科手术切除、并经病理学检查确诊的45例乳腺癌患者的乳腺癌组织及对应癌旁组织标本。取样来源于北京协和医院2010年10月到2015年12月期间确诊为乳腺癌并接受外科术切除的病人。手术切除乳腺癌组织后在病理科医生的指导下立即将乳腺癌及癌旁组织放入液氮，编号后置-80℃低温冰箱保存。2、对组织进行总RNA提取采用Reagent(invitrogen，货号15596-018)进行样本RNA提取，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：收集样本后冻存于液氮，取出后把组织放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：①加入Trizol，室温保存5分钟；②加氯仿0.2mL，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5分钟-10分钟；③12000rpm高速离心15分钟后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管管中，注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10分钟；④12000rpm高速离15分钟后小心弃掉上清液，按1mL/mLTrizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5分钟；⑤弃去乙醇液体，室温下放置5分钟以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉淀；⑥用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-80℃。RNA质量判定标准：RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间；总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。3、RNA样品的质量分析RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。4、高通量测序测序平台为Illumina公司的HiSeq2500高通量测序平台，进行高通量转录组深度测序，测序后我们运用Fast-QC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)软件对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布，质量值的位置分布，GC含量，PCRduplication含量，kmer的frequency等。在差异基因表达分析时，根据得到的FPKM值，采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中，筛选时，LOG2FC>1或<-1,FDR<0.05。为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对差异表达基因进行了GeneOntology和信号通路分析，并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析，鉴于以上数据分析的结果，结合文献我们筛选了差异性表达基因CAPN15和KLHL33，CAPN15基因和KLHL33基因在乳腺癌组织中表达上调。实施例2实时荧光定量PCR验证乳腺癌组织中CAPN15基因和KLHL33基因的表达情况1、材料按照实施例1的样本收集方式收集35例乳腺癌患者的乳腺癌组织及10例癌旁组织，对其进行分组及编号。2、方法2.1对组织进行总RNA提取，同实施例1的提取方法。2.2逆转录采用RTreagentkit(invitrogen，货号DRR037A)进行cDNA反转录。采用10μL反应体系：5xPrimerScriptBuffer2μL、PrimeScriptRTEnzymeMixI0.5μL、OligodTPrimer0.5μL、Random6mers0.5μL、RNA模板为0.5μg和RNaseFreedH2O补至10μL。反应程序为37℃15min，85℃5sec。获得的cDNA保存放-20℃冰箱备用。2.3qRT-PCR利用NCBI提供的在线软件https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/设计管家基因(GAPDH)和目的基因(CAPN15:NM_005632.2和KLHL33:NM_001109997.2)的特异性扩增引物，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如表1所示：表1引物序列表用PremixExTaqTMII(TaKaRa，货号DRR081A)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。荧光定量PCR20uL反应体系如下：PremixExTaqTMII：10uL，引物(10μM)：正、反向引物各0.8uL，ROXReferenceDyeII(50×)：0.4uL，dH2O：6uL，模板cDNA：2uL。反应程序在ABI7500上进行，扩增程序为：95℃30sec，(95℃5sec，60℃34sec)×40个循环。3、统计学分析实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：2-ΔΔCt×100％，比较CAPN15基因和KLHL33基因在乳腺癌组织和癌旁组织中的表达水平。结果显示：qRT-PCR扩增结果稳定，其中CAPN15基因和KLHL33基因分别在乳腺癌组织中的表达水平为癌旁组织的3.8倍和4.0倍，以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析CAPN15基因和KLHL33基因在乳腺癌组织中表达上调的结果，具体如图1所示。实施例3RNAi干扰乳腺癌细胞中CAPN15和KLHL33基因的表达一、细胞培养以人源乳腺癌MCF-7细胞系为研究对象，人源乳腺癌MCF-7细胞系购自美国ATCC公司，细胞培养用含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的RPMI1640培养基，于37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。二、siRNA设计与合成依据在线设计软件siDirectversion2.0(http://design.rnai.jp/)，根据基因序列参照NCBI:NM_005632.2(CAPN15)和NM_001109997.2(KLHL33)，设计相应的siRNA，具体序列见表2。设计后送往公司合成。表2siRNA序列列表三、细胞转染1、转染将细胞按1×104/孔接种到24孔细胞培养板中，在37℃、5％CO2培养箱中细胞培养24h，在无双抗、含10％血清的培养基中，转染按照转染试剂LipofectamineTM2000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染，实验分为阴性对照组和实验组(20nM)，实验组又分为siRNA-CAPN15+siRNA-KLHL33联合组siRNA-CAPN15组和siRNA-KLHL33组，浓度为20nM/孔。同时分别转染。2、QPCR检测乳腺癌细胞中各组CAPN15基因和KLHL33的转录水平2.1细胞总RNA的提取步骤同实施例2。2.2逆转录步骤同实施例2。2.3QPCR扩增步骤同实施例2。3、实验结果如图2所示，乳腺癌MCF-7细胞被siRNA单独或联合沉默后，CAPN15基因mRNA相对表达量在联合组、siRNA-CAPN15组比阴性对照组明显减少(P<0.05)，而联合组比siRNA-CAPN15减少更显著(P<0.05)。而siRNA-KLHL3组和阴性对照组差异没有统计学意义。KLHL33基因mRNA相对表达量在联合组、siRNA-KLHL3组比阴性对照组明显减少(P<0.05)。并且联合组比siRNA-KLHL3减少更显著(P<0.05)，而siRNA-CAPN15组和阴性对照组差异没有统计学意义。实施例4单独或联合干扰后乳腺癌MCF-7细胞增殖的情况细胞分组：阴性对照组、siRNA-CAPN15组、siRNA-KLHL3和联合组取对数增殖期细胞配置成1×104/mL单细胞悬液接种于96孔板，每孔100μL，每组设6个复孔。待细胞贴壁后，加入CCK-8试剂，2h后用酶标仪测定其450nm波长吸光度值作为零点。之后分别在12、24、48和72小时节点上，每孔加入CCK-8试剂10μL温育2h后，酶标仪测定细胞吸光度值，绘制细胞生长。结果如图3所示，转染48小时后，在siRNA-CAPN15组、siRNA-KLHL3组和联合组的乳腺癌细胞的生长抑制与阴性对照组相比有显著差异(P<0.05)，其中，联合组生长抑制作用最强，在转染72h后与两个单独组有显著差异。实施例5CAPN15对人乳腺癌细胞凋亡的影响使用流式细胞仪检测CAPN15基因和KLHL3基因对细胞凋亡的影响。3.1步骤按照实施例3方法进行细胞转染，转染72h后，使用预冷PBS洗涤细胞，然后用0.25％胰酶消化细胞，中止消化，将离心收集的细胞使用PBS重悬，将细胞定量为1×106个/mL，取200μL上述细胞悬液放置到Appendorf管中，加入10μLAnnexin-V-FITC混匀，室温暗处孵育染色15min，上机前5min加入10mg/L碘化丙锭(PI)染色5μL。未转染siRNA的细胞分别用Annexin-V-FITC和PI染色用于标准定量。用FACS流式细胞仪进行双色荧光细胞流式计数，观察凋亡细胞百分比。3.2统计学方法实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS19.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用的t检验，认为当P＜0.05时具有统计学意义。3.3结果乳腺癌MCF-7细胞在单独、联合组中凋亡细胞比阴性对照组(6.89±1.13)％明显增多(P＜0.05)，其中siRNA-CAPN15组的细胞凋亡率为(30.67±2.72)％，siRNA-KLHL3组细胞凋亡率为(34.31±2.52)％、联合组中凋亡率最高为(42.53±2.31)％。实施例6试剂盒的制备本实施例检测乳腺癌的试剂盒包括以下组成部分：(1)组织样品提取总RNA试剂包括TRizol、三氯甲烷、异丙醇、75％乙醇和无酶水；(2)反转录试剂包括：5x逆转录缓冲液、SuperRT逆转录酶、dNTPS、OligodTPrimer、Random6mers和RNaseFreedH2O，所述逆转录反应液包含：250mMpH8.3的Tris-HCl，375mM的KCl，15mM的MgCl2，50mM的DTT。进行1次反转录PCR的用量如表3所示，反应程序为：42℃30min，85℃5min。表3反转录试剂体系组分加入量5x逆转录缓冲液4μLOligodTPrimer(50μM)0.5μLRandom6mers(100μM)0.5μLSuperRT逆转录酶(200U/μL)1μLdNTPs(2.5mM)4μL总RNA1μgRNaseFreedH2O至20μL(3)定量PCR试剂包括：PCRMix反应体系，GAPDH、CAPN15和KLHL3的引物。所述PCRMix反应体系的组分包含反应缓冲液、dNTPs、Mg2+、ExTaqHS酶及GreenI。所述引物序列见表1所示。进行1次定量PCR的用量如表4所示。反应程序为95℃30sec，(95℃5sec，60℃34sec)×40个循环。上述试剂均可以在市面上购买。表4定量PCR体系组分加入量PCRMix反应体系10μL上游引物(10μM)0.5μL下游引物(10μM)0.5μL模板cDNA2.0μL加入灭菌蒸馏水至20μL试剂盒还包括：阳性对照为正常的乳腺组织RNA或DNA和阴性对照为ddH2O。一个试剂盒可以包括上述各成分进行多次PCR的用量，如25次、50次、100次等，各成分的具体量视情况需要而定。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表<110>北京致成生物医学科技有限公司<120>一种监测肿瘤发生发展的产品及其应用<130>p16rxa86<160>12<170>PatentInversion3.5<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1gacgattcggcctacgagag20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2gacaaagtcgccgtactcca20<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>3ggacgaagagtgcaccgag19<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4tgccaagcctttctgacaca20<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>5ctctggtaaagtggatattgt21<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>6ggtggaatcatattggaaca20<210>7<211>21<212>RNA<213>人工序列<400>7uuagaacucagcauuuuggcc21<210>8<211>21<212>RNA<213>人工序列<400>8ccaaaaugcugaguucuaagg21<210>9<211>21<212>RNA<213>人工序列<400>9aguucauaggccucaaagcuu21<210>10<211>21<212>RNA<213>人工序列<400>10gcuuugaggccuaugaacuaa21<210>11<211>21<212>RNA<213>人工序列<400>11auuuugcgguggaaauguccu21<210>12<211>21<212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