荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及生物检测领域，尤其涉及基因检测评估系统，具体的说是一种荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法。

背景技术：

随着科学研究的不断发展，人类基因组计划完成后，后基因组计划的全面展开，以基因工程为主导的生物技术在体育运动问题领域的应用得到广泛的关注。目前运用遗传学的理论和方法进行运动选材已经有了初步进展。常用的基因检测方法有：直接测序(direct sequencing，DS)、连接酶检测反应(ligase detection reaction，LDR)、限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、变性高效液相色谱分析(denaturing high performance liquid chromotography，DHPLC)、定量PCR，其中利用DNA分析仪直接测序是金标准，但是上述方法分别存在着成本高、准确率低、操作繁琐和重复性差等问题。实时荧光定量核酸扩增检测系统(Real-time Quantitative PCR Detecting System，qPCR)，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，荧光定量PCR(realtime PCR)检测在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法，qPCR系统为三代的PCR检测技术，qPCR具有检测灵敏度高，检测线性范围宽，检测精度和重复性好等突出优势，因此被公认为当今世界用于临床的最先进核酸分子诊断技术。因此该技术可以高效、准确的用于运动基因检测。

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。SNP为第三代遗传标志，人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关，SNP研究是人类基因组计划走向应用的重要步骤。这主要是因为SNP将提供一个强有力的工具，用于高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究等。SNP在基因组中分布相当广泛，研究表明在人类基因组中每300碱基对就出现一次。大量存在的SNP位点，使人们有机会发现与各种疾病，包括肿瘤相关的基因组突变；从实验操作来看，通过SNP发现疾病相关基因突变要比通过家系来得容易；有些SNP并不直接导致疾病基因的表达，但由于它与某些疾病基因相邻，而成为重要的标记。SNP在基础研究中也发挥了巨大的作用，通过对Y染色体SNP的分析，使得在人类进化、人类种群的演化和迁徙领域取得了一系列重要成果。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。

已有越来越多的文献对荧光定量PCR技术从各方面的应用角度进行阐述，大部分文献公开了多种单一片段通过荧光定量PCR技术进行检测的具体方式方法，但在发明人进行荧光定量PCR检测SNP位点的过程中，发现单一片段的检测不足以满足检测要求，对于具有两个或多个SNP位点的综合性检测，需要重复检测，步骤繁琐且操作时间长。

心脏性猝死是指急性症状发作后1小时内发生的以意识突然丧失为特征的由心脏原因引起的自然死亡。心脏性猝死者绝大多数患有器质性心脏病，主要包括冠心病、肥厚型和扩张型心肌病、心脏瓣膜病、心肌炎、非粥样硬化性冠状动脉异常、浸润性病变、传导异常(QT间期延长综合征、心脏阻滞)和严重室性心律失常等，猝死相关遗传性心律失常在发作之前可能无症状，一旦发作则可能致命。大多数心脏性猝死则是室性快速心律失常所致。一些暂时的功能性因素，如心电不稳定、血小板聚集、冠状动脉痉挛、心肌缺血及缺血后再灌注等使原有稳定的心脏结构异常发生不稳定情况。某些因素如自主神经系统不稳定、电解质失调、过度劳累、情绪压抑及用致室性心律失常的药物等，都可触发心脏性猝死。现有的心源性猝死基因的研究多数是依据离子通道相关基因上位点的研究，这些位点是基于欧洲人群大样本量GWAS研究得出的强关联位点，在应用于亚洲人群，尤其是我国人群时，位点关联性较弱，难以通过检测得到较为准确的结果，因此建立中国人群的评估系统是十分有必要的。

技术实现要素：

为此，需要提供一种对两个及以上SNP位点或两个及以上基因的SNP位点进行检测的荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法。

为实现上述目的，发明人提供了一种荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括荧光定量PCR检测部及结果处理评价部，其中结果处理评价部包括位点对应的检测结果处理系统及参考数据库；荧光定量PCR检测部所涉及的试剂、用量及扩增检测方式等可参考已公开的现有技术，在此不做赘述。

优选地，检测试剂盒包括至少两个位点的荧光定量PCR检测及结果处理评价；也就是说，所述检测试剂盒为多重荧光定量PCR检测试剂盒，多个位点不限于同一DNA片段。

优选地，结果处理评价部中参考数据库以千人基因组中的东亚人群基因组数据作为普通人群水平，并将检测结果实时收入数据库内；参考数据库内包括根据待测基因位点的等位基因型风险值及风险评级，该基因的出现频率、基因风险及其他统计数据，以及相关建议方案等。

优选地，根据检测结果得到各位点的基因型及对应风险积点，计算获得待测基因的风险值P，并根据平均风险值Pa、平均方差S，据此得到以下五种处理结果：

P_a+0.6S≤P为高风险级别；P_a+0.2S≤P＜P_a+0.6S为略高风险级别；P_a-0.2S≤P＜P_a+0.2S为一般风险级别；P_a-0.6S≤P＜P_a-0.2S为略低风险级别；P＜P_a-0.6S为低风险级别。

更优选地，待测基因的风险值为多个检测基因位点的乘积，也就是说，P=S1*S2。

作为一种优选的实施方式，本发明中的荧光定量PCR试剂盒为心源性猝死位点检测试剂盒，该试剂盒检测两个SNP位点，检测位点为rs4665058和rs2824292位点，rs4665058位点的AA-AC-CC基因型的OR值分别为3.68-1.98-1；rs2824292位点的GG-GA-AA基因型的OR值分别为3.16-1.78-1；P值≥2.33为高风险级别,2.13≤P值＜2.33为偏高风险,1.93≤P值＜2.13为一般风险,1.72≤P值＜1.93为偏低风险,P值＜1.72为低风险。

本发明的另一目的在于提供一种根据上述荧光定量PCR检测试剂盒的荧光定量PCR检测方法，其中，检测方法具体包括：

a.待测样本的扩增，采用单荧光标记探针，设计待测样本的引物及探针序列，进行PCR扩增；

b.样本检测，通过熔解曲线峰型图检测已扩增的位点，得到对应位点的检测结果；

c.根据检测结果进行结果处理，将各位点的风险积点统计后得出该待测基因的风险值，并对应数据库中的风险级别；

d.根据检测结果的对应级别，综合得到基因风险及相关处理结果。

优选地，样本的检测结果进行结果处理时，具体方法如下：

根据检测结果得到各位点的基因型及对应风险积点，计算获得待测基因的风险值P，并根据平均风险值Pa、平均方差S，据此得到以下五种处理结果：

P_a+0.6S≤P为高风险级别；P_a+0.2S≤P＜P_a+0.6S为略高风险级别；P_a-0.2S≤P＜P_a+0.2S为一般风险级别；P_a-0.6S≤P＜P_a-0.2S为略低风险级别；P＜P_a-0.6S为低风险级别。

更优选地，平均方差S的计算方式如下：

其中i为待测基因的检测位点数量。

优选地，平均风险值通过东亚人群的基因组数据，其中人群总人数为N，Pa的计算公式为：

区别于现有技术，上述技术方案通过采用荧光定量PCR的多重检测试剂盒，可对多种基因的检测结果进行评估，基于科学准确的结果参考数据库，可以得到十分准确并且个性化及强，可对检测样本给予个性化的结果及建议，已达到更加有效地基因检测的目的，具有更加广泛的使用及推广价值。

本发明的检测试剂盒及检测方法特异性强、检出率高，效率高、成本低，如应用在基因诊断领域，可以综合检测与分析受检人群是否携带待测基因，并评估该待测基因的风险，筛选样本范围，并对样本进行后续指导建议，起到更加深入的指导作用。

附图说明

图1为具体实施方式所述的检测样品实验结果；

图2为具体实施方式所述的检测样品测序结果；

图3为具体实施方式所述的检测样品实验结果；

图4为具体实施方式所述的检测样品测序结果；

图5为根据检测样品实验结果进行评估的流程图。

具体实施方式

为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。以下实施例中用到实验试剂如无特殊说明，均可通过商业手段获得。

请参阅图1～4，本实施例中采用荧光定量PCR检测试剂盒进行心源性猝死相关基因的检测，其中对心源性猝死相关的两个基因上的两个多态性位点(rs4665058和rs2824292)进行检测，利用特异性设计的引物和探针，优化扩增体系和条件，在同一体系同时完成两个基因上的两个多态性位点的检测。

优选地，本实施例中采用单荧光标记探针，罗氏480平台，最后通过熔解曲线峰型图检测rs4665058和rs2824292位点。

具体的rs4665058和rs2824292位点的双重荧光定量PCR检测方法具体如下：

1.rs4665058和rs2824292位点的引物及探针设计如下表1所示：

表1引物及探针

2.试剂配制

3.PCR反应程序

对待扩增序列进行PCR扩增反应，具体的反应过程(循环)设置参数如下：

4.对扩增结果进行检测，检测结果如图1～4所示，检测样品rs4665058实验结果为G，检测样品rs2824292实验结果AG，通过测序进行复检，证明本实验方法具有准确性和可靠性。

本实施例中上述两个位点分别来自Bezzina等和Ar-king博士发表的文章，文章通过GWAS研究得出了与心源性猝死直接相关的两个易感位点，并计算出了两个位点的风险等位基因型风险值，即OR值。GWAS研究发现CXADR和BAZ2B基因上的常见遗传变异可能与心室颤动/SCD发生有关。Bezzina等发现CXADR基因上的SNP位点(rs2824292)是急性心肌梗死后心室颤动发生的危险因素。rs2824292可以降低CXADR的转录本丰度，携带该变异的心肌梗死动物模型表现出严重的心脏传导障碍和心律失常易感性。为探讨遗传变异与心脏骤停间关系，Ar-king博士将4402例心脏骤停患者与3万名正常人的基因进行比对分析发现，BAZ2B基因发生变异(rs4665058)时，心脏骤停的发生概率显著增高，且往往会在缺乏任何预兆的情况下发生，病死率高达95％。而且已有研究表明，与CXADR基因相关的疾病为心肌炎与扩张性心肌病，并具有心室心脏冲动的作用，BAZ2B基因虽无相关功能研究，但其在心脏中表达。

评估上述2个位点，不同基因型及其风险值（OR）为：BAZ2B基因rs4665058，AA-AC-CC基因型的OR值分别为3.68-1.98-1；CXADR基因rs2824292，GG-GA-AA基因型的OR值分别为3.16-1.78-1。由于心源性猝死的发病率小于10％，所以OR值近似于RR值，即风险值。每个位点的风险值则按照基因型来计算，即纯合风险等位基因型的风险值为OR值的平方，杂合风险等位基因型的风险值为OR值，纯合非风险等位基因型为1，对于一个受检者，每个SNP位点根据检测得到的基因型，都有一个易感值，我们定义这个分值为S，那么受检者的个人心源性猝死易感值为P，P值为两项基因型的OR值乘积：

P＝S1*S2。

根据基因检测结果，对个人的心源性猝死风险进行评估，并建立中国人群的心源性猝死易感数据库。

以千人基因组中东亚人群的基因组数据为普通人群水平，总人数定义为N。以千人基因组中东亚人群的基因型平均分设定为人群的平均分：

并计算出平均方差，

根据Pa与S，将东亚人群的心源性猝死风险值进行分级，将受检者的个人心源性猝死风险值P对应到人群分级中去，人群分级共五级，分别为高-略高-一般-略低-低五个风险级别。

Pa+0.6S≤P为高风险级别；Pa+0.2S≤P＜Pa+0.6S为略高风险级别；Pa-0.2S≤P＜Pa+0.2SC为一般风险级别；Pa-0.6S≤P＜Pa-0.2S为略低风险级别；P＜Pa-0.6S为低风险级别。基于东亚人群划分的心源性猝死风险级别，P值≥2.33为高风险级别,2.13≤P值＜2.33为偏高风险,1.93≤P值＜2.13为一般风险, 1.72≤P值＜1.93为偏低风险,P值＜1.72为低风险。

如图5所示，根据基因检测结果，将两项OR值相乘得出个人心源性猝死的易感值，也就是风险值。对应到由分级方法得到个人的心源性猝死风险级别，根据受检者的P值对应的级别，综合得到受检者的心源性猝死的风险，从而给出个体健康管理方案。

本实施例根据每个位点对心源性猝死风险的风险值来计算心源性猝死风险的得分，并根据现有的数据库去进行人群分级，通过个人得分得到个人的心源性猝死风险级别，从而评估受检者的猝死风险，引导高风险者改善生活方式，避免诱发因素，增加体检频率。与此同时建立两个基因多态性位点的中国人群数据库，为建立中国人群特有的心源性猝死评估奠定基础。

本发明可以对受检者的心源性猝死相关风险进行评估。本发明提供的检测试剂盒特异性强、检出率高，效率高、成本低，能够综合检测与分析受检人群是否携带“心源性猝死易感基因”，并评估其患心源性猝死的风险，将易感人群从普通人群中筛选出来，给予个性化指导建议，改变不良的生活习惯，达到预防的目的。

尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳美因临床检验所有限公司

<120> 荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法

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